中国小麦品种品质评价体系建立与分子改良技术研究

中国农业科学 2006,39(6):1091-1101
Scientia Agricultura Sinica
中国小麦品种品质评价体系建立与分子改良技术研究
何中虎1，晏月明2，庄巧生1，张 艳1，夏先春1，张 勇1，王德森1，夏兰芹1，胡英考2， 蔡
民华2，陈新民1，阎 俊1，周 阳1
(1中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；2首都师范大学生命科学学院，北京 100037)
摘要：中国小麦品种品质评价体系建立与分子改良技术研究主要进展包括4个方面，（1）从食品品质—性状—蛋白质—DNA四个层次对中国230份小麦品种的6类49个品质性状进行深入系统研究，建立了中国小麦品种品质评价体系；建立了中国面条标准化实验制作与评价方法，明确了选种指标，建立并验证其分子标记选择体系，还优化并完善面包、北方馒头和饼干的评价方法与选种指标；（2）创立高分子量谷蛋白亚基酸性毛细管电泳（A-CE）与高低分子量谷蛋白亚基质谱（MS）鉴定方法；发现了与面筋强度直接相关的水溶性蛋白WS-6；改进SDS-PAGE 方法，明确了面包和面条对亚基组成的要求。

筛选出Glu-B1和Glu-D3位点8个亚基的STS标记，明确了Glu-D3位点亚基与基因的关系；在小麦近缘种中鉴定了15个新亚基，丰富了品质改良的候选基因资源；（3）阐明了从农家种、历史改良品种到目前主栽品种的籽粒硬度演变规律和等位变异特点，发现7个新等位基因，修正硬度形成的分子理论；（4）制定全国小麦品质区划方案，为全国品质育种提供了3批亲本。

为了更好推动中国小麦品质改良工作的发展，建议加强4个方面的工作。

关键词：普通小麦；籽粒硬度；贮藏蛋白；面条品质；分子标记；专论
Establishment of Quality Evaluation System and Utilization of Molecular Methods for the Improvement of Chinese Wheat Quality HE Zhong-hu1, YAN Yue-ming2, ZHUANG Qiao-sheng1, ZHANG Yan1, XIA Xian-chun1, ZHANG Yong1, WANG De-sen1, XIA Lan-qin1, HU Ying-kao2, CAI Min-hua2, CHEN Xin-min1, YAN Jun1, ZHOU Yang1 (1Institute of Crop Science/National Wheat Improvement Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;
2College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037)
Abstract: Quality improvement has become an important objective for wheat breeding, and the aim of this paper is to review the progress of quality evaluation and improvement methods of Chinese wheat during the last ten years. (1) A standardized quality evaluation system including end-use quality testing and use of molecular markers has been established, a laboratory protocol and evaluation method was developed for Chinese noodles, selection criterion and molecular markers were identified. Laboratory testing protocols for pan bread, north style steamed bread, an dcookie have also been optimized. (2) An acidic capillary electrophoresis method for separation of high molecular weight glutenin subunits (HMW-GS) and MALDI-TOF-MS for separation of high and low molecular weight glutenin subunits (HMW-GS and LMW-GS) were established. A water soluble protein, named WS-6, was found to be directly linked with gluten quality, and SDS-PAGE method was used to investigate the composition of HMW-GS and LMW-GS of Chinese wheat, and association between glutenin subunits and quality performance of pan bread and Chinese noodle quality were clarified. Y-type gene specific markers for discrimination of HMW-GS at Glu-B1 locus were established and the association between LMW-GS genes and alleles at Glu-D3 locus were identified. (3) Grain hardness distribution and occurrence of puroindoline alleles in Chinese wheat were characterized, and five new mutations were discovered. (4) A regional wheat quality proposal was developed and released by the Ministry of Agriculture. Three groups of parents were recommended to provincial wheat breeding programs. Future
收稿日期：2005-07-28；接受日期：2006-02-14
基金项目：农业部“948”重大国际合作项目（2003Q01）、“973”项目（2002CB11130）和国家自然科学基金项目（30270822）
作者简介：何中虎（1963-），男，陕西蒲城人，研究员，博士，研究方向为小麦遗传育种。

E-mail: zhhe@。

通讯作者晏月明（1960-），男，重庆人，教授，博士，研究方向为小麦分子遗传与蛋白质组学。

E-mail: yanym@
1092 中国农业科学39卷
directions for quality improvement in China are also proposed.
Key words: Common wheat; Kernel hardness; Storage protein, Noodle quality, Molecular marker; Review
0 引言
品质是小麦育种和生产的重要目标，也是影响产业竞争力的重要因素。

因人多地少矛盾突出，消费水平较低，中国小麦育种长期以提高产量和改良抗病性为主。

20世纪80年代中后期，小麦品质改良开始受到重视，当时以在现有品种材料中筛选优质品种为主，主要是学习掌握国外已有技术，育成的优质麦产量偏低，推广面积小。

90年代中后期，农业产业结构调整对小麦品质提出更高要求，为优质小麦研究提供了难得的机遇，又适逢国家小麦改良中心－分中心的相继建立，仪器设备得到补充更新，使得中国在优质小麦育种与产业化、品质改良方法研究等方面走上迅速发展的道路。

十年前，中国优质小麦研究与发展主要存在五大问题。

一是对中国小麦品种主要品质性状缺乏系统研究，品质改良的盲目性大，忽视了籽粒软硬分类，在面筋强度改良中对低分子量亚基及1B/1R易位的作用重视不够。

研究工作几乎全是补课性质，与国际水平相差30～40年，曾对部分品种的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、和面仪参数、粉质仪参数、高分子量亚基和醇溶蛋白及面包品质做过一些初步研究，尚未涉及到籽粒硬度、磨粉品质、颜色性状、淀粉特性、溶剂保持力、低分子量亚基、1B/1R等重要性状。

二是成品品质评价在品质育种中至关重要，国内缺乏标准化的实验室制作与评价体系，严重制约品质育种工作。

主要表现在测试方法不完善，标准化程度低，更谈不上与国际接轨。

西方早已成熟的面包、饼干烘焙方法尚未完全掌握，中国传统食品如面条和馒头的实验室评价尚在摸索之中，虽然形成了面包、面条、馒头、饼干等行业标准，但因研究水平低，标准的可操作性差，因而在科研单位和面粉企业应用并不广泛。

三是生物技术的迅速发展为品质改良技术升级提供了可能，但因品质性状难度大，加之工作基础差，国内的分子标记研究以抗病性为主，因而如何应用现代生物技术，实现品质改良研究的跨越式发展是面临的重要问题。

四是对品质性状的基因型与环境互作了解十分有限，多数地方以面包品质改良为主要目标，全国性的品质区划工作尚未开始，如何根据气候、土壤、生态等自然因素和种植制度、市场需求等社会因素来规划全国优质小麦的生产和科研是面临的重要问题。

五是缺乏产量高、加工品质过硬的优质小麦品种（面包、面条、饼干、糕点），因此在继续改良品质性状的同时，如何进一步提高产量潜力，做到产量质量协同改良是优质小麦育种的重要课题。

因此，深入系统研究中国小麦品质评价体系与分子改良技术对提高中国小麦竞争力具有重要意义。

针对上述问题，中国农业科学院作物科学研究所与首都师范大学生命科学学院密切合作，前者以测试方法标准化、分子标记、籽粒硬度等为主，后者侧重于贮藏蛋白的分离技术，通过分工与协作，实现优势互补，提高工作效率。

通过常规育种、谷物化学与分子生物学即大田试验－品质分析－现代生物技术检测的密切结合，从食品品质－性状－蛋白质－DNA四个层次建立小麦品质评价体系。

鉴于欧美等国已对面包和饼干糕点品质等做了大量深入研究，以中国传统食品面条和馒头的实验室制作方法标准化和评价方法规范化为切入点，以此带动品质测试方法的标准化；通过大量实验明确其选种指标，筛选并验证其分子标记选择体系。

由于蛋白质品质和籽粒硬度是制约中国小麦加工品质的主要因素，在进行出粉率、色泽、淀粉品质、面团流变学特性及食品品质研究的同时，重点突出贮藏蛋白分离技术及硬度的等位变异分子检测，建立中国优势领域。

用SDS-PAGE对高低分子量亚基（HMW-GS）进行鉴定，进而明确各类亚基与面包和面条品质的关系；发现了与面团强度直接相关的水溶性蛋白标记WS-6，创立了HMW-GS的酸性毛细管电泳（A-CE）和HMW-GS及LMW-GS的MALDI-TOF- MS鉴定新方法，为蛋白质品质改良提供新技术。

从近源野生种克隆优质亚基基因并进行功能验证，为改良蛋白质品质提供优质候选基因。

在主产区选用代表性品种，开展多年多点试验，明确基因型、环境及其互作对品质性状的相对贡献，深入了解现有品种的品质状况，从宏观把握中国小麦品质，提出全国小麦品质区划方案，为小麦产业发展提供决策依据。

为了使研究成果尽快在全国小麦科研与生产中发挥作用，采取研究、培训与推广同步进行的策略。

需要说明的是，中国农业大学在小麦贮藏蛋白与淀粉特性研究、西北农林科技大学在陕西省小麦品种品质检测评价、中国科学院在小麦近缘种的高分子量麦谷蛋白亚基变异分
6期何中虎等：中国小麦品种品质评价体系建立与分子改良技术研究 1093
析与遗传进化研究等方面也做了大量工作，鉴于笔者的许多论文在国外发表，考虑到写作上的方便，故本文仅限于作者单位的研究进展总结。

1 主要进展
1.1 中国小麦品种品质评价体系建立
在对国内外现有测试方法和蛋白质及分子标记进行优化完善的基础上，从食品品质－性状指标－蛋白质－DNA四个层次对中国230多份主要小麦品种（系）进行了深入系统的研究与评价，涉及的指标包括磨粉品质与颜色相关性状、蛋白质与面团流变学特性、淀粉品质、软质小麦品质参数、微量元素营养及食品品质评价共6类49个性状。

所用的蛋白质和分子标记包括籽粒硬度的Friabilin蛋白和Pina/Pinb、多酚氧化酶及其分子标记PPO18/Xgwm312、麦谷蛋白高低分子量亚基、醇溶蛋白、1B/1R易位、GBSS蛋白及Wx-7A、Wx-4A和Wx-7D等。

建立了既有中国特色、又与国际接轨的中国小麦品种品质的评价体系，为小麦品质改良提供了方法和理论依据。

1.1.1中国小麦品种品质性状评价体系磨粉品质与颜色性状包括容重、籽粒蛋白质、籽粒硬度（SKCS，NIR/NIT）、Friabilin蛋白、Pina/Pinb、出粉率（%）、灰分（%）、面粉颗粒度大小、面粉麸腥数目、面粉颜色等级、磨粉品质指数、面粉颜色、面团颜色、多酚氧化酶活性、PPO18/Xgwm312和黄色素含量等19个。

（1）PSI法、NIR/NIT和单籽粒硬度仪（SKCS）测定的籽粒硬度相关性很高（r＝0.8～0.9），皆可用于品种硬度分类。

硬度与蛋白质含量与质量不匹配是影响中国小麦品质改良的重要因素。

（2）除籽粒硬度、容重和饱满度外，评价磨粉品质的指标还应包括面粉出粉率、灰分含量、颜色等级与磨粉品质指数。

麸腥数目（或面积）与面粉亮度呈显著负相关（r＝－0.65～0.72），面粉颜色等级（Flour color grade，简称FCG）与面团亮度（L*值）呈显著负相关（r＝－0.95），因此FCG可作为面团亮度的度量指标。

磨粉品质指数（Milling quality index，简称MQI）与白盐面条的亮度呈显著负相关（r＝－0.60～0.67）。

出粉率、FCG与MQI可用于育种中的磨粉品质评价[1]。

（3）多酚氧化酶（PPO）活性和黄色素含量是影响面制品颜色的重要性状，明确了PPO的遗传变异，通过遗传途径降低PPO活性是可行的。

鲜面条在贮存过程中颜色褐变普遍存在，PPO是引起褐变的主要原因，而对挂面颜色的影响较小。

筛选出面粉色泽好、PPO活性低、黄色素含量低的品种16份，可作为改良面粉颜色的亲本[2, 3]，PPO18和Xgwm312可用于育种分子辅助选择[4, 5]。

蛋白质与面团流变学特性包括蛋白质含量（%）、湿面筋含量（%）、沉降值、和面仪参数、粉质仪参数、拉伸仪参数、成泡仪参数、高低分子量亚基组成（SDS-PAGE）、1B/1R易位、高分子量亚基（HPLC 与CE）、醇溶蛋白（CE）、水溶蛋白（CE）、高低分子量亚基含量（RP-HPLC）和醇溶蛋白含量（RP-HPLC）等16个指标。

中国小麦的HMW-GS和LMW-GS组成较为丰富，优质亚基如5+10等频率低，劣质亚基2+12及1B/1R易位频率高是导致面筋质量差的主要原因。

麦谷蛋白高低分子量亚基（1或2*、7+8或7+9或14+15、5+10、Glu-A3d和Glu-B3d）及非1B/1R易位组成可作为筛选面筋强度的蛋白质标记，适用于大量种质筛选[6, 7]。

在选择强筋的同时，评价中国小麦品质尤其要注意吸水率和面团延展性。

筛选出面团流变学特性接近澳洲优质小麦Hartog的优良品种（系）8份，可作为育种中的优质亲本[3]。

淀粉品质性状包括直链淀粉含量、直/支淀粉比例、RVA参数、GBSS蛋白和Wx等5个。

GBSS蛋白或分子标记皆可用于大量材料筛选，RVA粘度仪参数（高峰粘度）可用于分离世代鉴定。

筛选出37份Wx-B1缺失型，豫麦47、豫麦49、丰优6号、豫麦62、新麦9号、扬麦5号和绵阳26等7份的淀粉糊化特性与澳洲著名面条品种Gamenya接近，可作为育种中的杂交亲本[3, 8]。

软质小麦品质特有的参数包括水溶剂保持力、蔗糖溶剂保持力、碳酸钠溶剂保持力、乳酸溶剂保持力、碱水保持力、戊聚糖含量等6个。

溶剂保持力测试方法所用样品量小、方法简单、重复性好，应作为分离世代软质麦品质筛选的主要指标，降低SRC是软麦育种的主要目标。

戊聚糖含量也与饼干品质密切相关，应作为筛选指标之一。

在产比阶段以后，籽粒硬度、溶剂保持力、成泡仪参数及烘烤品质可全面反映软质小麦品质的优劣[9, 10]。

中国现有品种间铁、锌含量差异大，在270份小麦中筛选出铁含量高的品种（系）10份（＞50mg·kg-1），分别是优选14、中优16、中优14-7、1061-93矮、中品920809、京冬6号、中品92050、中作8131-1、烟2980和中优9507。

筛选出锌含量高的品种（系）9份（＞40.0mg·kg-1），分别是山东435001、中作8131-1、京冬6、临旱6105、中品920809、中优16、优选14、
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中优14-7、优选93-8。

上述材料可作为提高铁、锌含量的育种亲本。

1.1.2中国面条品质评价体系与分子标记
（1）改进实验面条评价体系：借鉴日本面条和欧美通心粉的评价方法，对加水量、和面时间与速度、面团静置时间、压片与切条方式、煮面时间等与面条评价的关系进行了深入系统研究，提出了符合中国实际、操作性强的中国面条实验制作标准与评价方法，新的评分标准为：颜色15分，外观10分，软硬度20分，弹韧性30分，光滑度15分，食味10分[11]；将质构仪（与面条适口性相关系数r=0.70）和色度仪（与面条颜色相关系数r=0.73）用于中国面条品质评价，形成了规范化、重复性好的标准化实验面条评价体系[12, 13]。

这一评价体系得到国内主要面粉厂及质量检测单位的好评和国际同行的认可。

（2）明确面条品质的选种指标、面条与面包品质要求的异同：用200多个品种（系）对面条品质的选种指标及面条品质与面包品质间的关系做了深入研究。

明确了蛋白质含量和蛋白质质量（沉降值、稳定时间等）与中国干面条评分呈二次曲线关系（R2=0.22～0.53），而与面包体积和评分呈正向直线相关关系（r=0.50～0.83）。

就中国干面条品质而言，性状的重要性排序为蛋白质质量>淀粉糊化特性>颜色>蛋白质数量。

影响面包品质的性状首推蛋白质质量，次为蛋白质数量，与淀粉质量关系不密切[7, 14]；用500多份小麦品种样品与糯性基因近等系证实了中国面条对淀粉品质的要求与日本面条有类似之处，Wx-B1基因可作为优良淀粉和面条质地的选择指标[3, 8, 13, 15]；将干面条对品质指标的要求定量化，其具体选种指标为：12.5%≤籽粒蛋白质≤13.5%，38.0 ml ≤沉降值≤45.0 ml，5.0 min≤稳定时间≤8.0 min，RVA峰值粘度>2800cp，灰分含量、多酚氧化酶（PPO）活性和黄色素含量越低越好。

（3）确定面条主要选种指标的分子标记：根据不同硬度等位变异与品质性状的关系，证实了面条品种硬度应为Pinb-D1突变类型，Pina/Pinb的STS标记可用于辅助选择[16]；PPO18（STS）标记的876 bp片段（低PPO）和SSR标记Xgwm264b可分别作为多酚氧化酶和高黄色素的标记[4, 17]；面条对高分子量亚基要求并不严格，但要求低分子量亚基为Glu-A3d和Glu-B3d [7]；高淀粉糊化特性要求含Wx-B1基因[8, 13]。

其中PPO和黄色素标记由笔者筛选鉴定，籽粒硬度、低分子量亚基、淀粉特性的标记前人已有报道，但没有明确其与中国面条品质的关系。

用中国面条品质优良的品种如PH82-2-2、小偃6号、小偃54、陕优225、豫麦34、豫麦49、扬麦5号、Hartog和Eradu等进行分子标记验证，证明了这一标记体系的有效性。

该工作极大推动了面条育种分子标记体系的建立与应用。

以PPO标记为例予以说明。

以中国200多份主栽小麦品种和品系为材料，明确了PPO的遗传变异及其与品质性状的关系[2]；利用中优9507/CA9632的DH系进行QTL定位表明，位于2AL和2DL上的两个主效QTL可分别解释PPO活性变异的50.0%和29.1%[17]。

用203个小麦品种（系）验证了SSR引物Xgwm312的扩增片段198 bp与高PPO活性有关，这是第一个可用于辅助选择的PPO标记[5]。

在此基础上，根据小麦PPO 活性基因的cDNA序列，设计了一个新的STS标记PPO18，并利用DH群体、缺体四体和双端体把PPO18定位于小麦染色体2AL上。

2AL上的PPO基因与PPO18共分离，可解释43%的表型变异。

利用PPO18标记在PPO高和低的小麦品种中可分别扩增出685 bp 和876 bp的PCR片段，即PPO基因序列在这两类品种中有191 bp的差异。

序列分析表明，这种差异发生在PPO基因的内含子区。

在PPO活性低的小麦品种中，PPO基因的内含子区多出191 bp片段，影响PPO基因的转录和表达[4]。

此外，笔者还改进了面包制作与评价体系，对北方馒头和饼干的品质评价方法及选种指标进行了研究[9, 10, 18, 19]，提出了饼干小麦品种的新标准，得到面粉企业的认可。

由于篇幅所限，不对其进行详细论述。

1.2 贮藏蛋白分离方法及其在品质研究中的应用 1.
2.1改进SDS-PAGE方法，明确不同食品的高低分子量亚基要求HMW-GS和LMW-GS组成是影响面筋质量的主要因素。

在对20世纪90年代初的主栽品种研究后认为，优质亚基5+10等频率低是中国小麦面筋强度弱的主要因素。

国外对低分子量亚基的分离方法虽有一些报道，但因操作烦琐、育种家不易掌握等原因始终未能广泛用于品质育种。

笔者在国内最早建立了可同时鉴定HMW-GS与LMW-GS的SDS- PAGE方法，根据Glu-B3j亚基与1B/1R易位系的紧密连锁关系，可判断1B/1R的有无，为高低分子量亚基同时用于育种提供了简单易行的鉴定方法[6, 20～23]。

对中国500多份冬春小麦品种（系）的HMW-GS、LMW-GS及1B/1R易位系及其与面团流变学特性和面包面条品质的关系进行了深入研究[6, 7, 20～23]。

结果表明：HMW-GS、LMW-GS及位点互作对加工品质都有
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重要影响，其顺序为Glu-D1>Glu-A3>Glu-B3>Glu- A1>Glu-B1>Glu-D3；优质HMW-GS和LMW-GS频率低、尤其是1B/1R易位系频率高，是造成中国小麦面筋质量差的最重要原因；优质面包品种的亚基组成应为1（≥2>null）、7+8（≥17+18>7+9）、5+10（>2+12）和Glu-A3d（>Glu-A3b>Glu-A3c>Glu-A3a），优质面条品种对高分子量要求不严，但Glu-A3d和Glu-B3d有较大正向效应；提出了导入优质亚基1或2*、7+8、5+10、Glu-A3d和Glu-B3d并淘汰1B/1R易位系是提高面筋质量的主要途径。

1.2.2小麦品种快速鉴定的高效毛细管电泳（HPCE）技术体系笔者对HPCE的主要环节进行优化，建立了品种鉴定的高效毛细管电泳体系。

只需半粒种子(10～20 mg)，就可对醇溶蛋白进行快速高分辨度HPCE分离和品种鉴定，在10～15 min内完成样品制备，单个样品分离时间10～20 min，一般可得到30～40个组分，对A-PAGE方法难以鉴定的亲缘极近的品种或种质，用HPCE方法则很容易区分，在分辨度和分离时间等方面明显优于传统的凝胶电泳方法[24, 25]。

主要用途包括：品种鉴定、种子纯度检测与真实性鉴定，比传统A-PAGE方法准确度高、速度快、样品用量少。

遗传多样性研究，根据醇溶蛋白HPCE图谱，研究不同品种的遗传多样性，为小麦育种提供理论依据。

品质改良标记辅助选择，HPCE技术可对γ-45等优质蛋白带进行快速准确鉴定，作为辅助选择标记。

1.2.3 HMW-GS酸性毛细管电泳（A-CE）鉴定新方法首次建立了小麦HMW-GS酸性毛细管电泳（A-CE）鉴定新技术。

主要技术参数及优点是：微量，只需15～20 mg胚乳（面粉）；成本低，毛细管价格低廉、试剂使用量少、仪器维护费用低；快速，单个样品在10～12 min内分离完成，而常用的SDS-PAGE 方法一般需要2 d；分辨度高，对普通的HMW-GS及x-型和y-型亚基均能分离开，并正确区分；重复性高，迁移时间的相对标准偏差（RSD）小于2%，峰高的RSD小于3%，从进样到结果输出均能自动完成。

利用A-CE方法研究了小麦品种及其近缘种HMW-GS和醇溶蛋白等位变异[26～31]，并对5+10、2+12、7+8、13+16、14+15、17+18、1、2*等亚基进行快速准确鉴定；在小麦近缘种中鉴定了15个新亚基，丰富了品质改良的候选基因资源。

如在节节麦（T. tauschii）中鉴定了1.5、2.1*、2.2、10.1、10.2、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5等新亚基，在Spelt和栽培二粒麦中鉴定了6.1+22.1、13*+19*和13+22*等新亚基。

1.2.4 HMW-GS和 LMW-GS的MALDI-TOF-MS鉴定新方法首次采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对HMW-GS和LMW-GS进行分子量的精确检测，获得了15个小麦品种的18个HMW-GS（包括5+10、2+12、7+8、1、2*、13+16、14+15等主要亚基）及普通小麦品种、四倍体野生二粒小麦和二倍体粗山羊草的LMW-GS高分辨质谱图及其精确度较高的分子量，建立了HMW-GS和LMW-GS精确鉴定的MALDI-TOF-MS新方法[32]。

该方法不经单亚基回收，样品制备简单，可准确检测不同亚基的分子量，适用于HMW-GS等位变异分析、新亚基检测、克隆基因的分子量验证和谷蛋白翻译后修饰的鉴定等。

1.2.5 种子水溶性蛋白的高效毛细管电泳分离方法通过优化提取方法和分离参数，建立了小麦水溶性蛋白高效毛细管电泳分离方法，分离时间较前人缩短1/3，首次发现了与面筋强度直接相关的WS-6亚基，在小麦品质改良中有重要应用价值。

1.2.6筛选新标记与低分子量基因鉴定首次设计了对面筋强度有重要作用的Glu-B1上3个Y亚基的PCR标记，并用SDS-PAGE和RP-HPLC进行了验证。

即ZSBy8F5/R5可作为亚基8的特异标记，用来区分SDS-PAGE难以分辨的8和8*及7+8与17+18；ZSBy9aF1/R3和ZSBy9F7/R6可以作为亚基9的标记，引物ZSBy9F2/R2可作为亚基13+16的标记，也可用来区分亚基14+15和20[33]。

在Glu-D3位点获得了3个不同的LMW-GS基因（编号分别为Glu-D3-1、Glu-D3-2和Glu-D3-3），每个基因包含2～3个等位基因。

Glu-D3-1基因总长为2 792 bp，有2个等位基因，二者的唯一差异是后者在基因编码区有一个三碱基（CAA）缺失位点，导致蛋白缺失一个谷酰胺。

Glu-D3-2基因总长为2 144 bp，包含3个等位基因。

Glu-D3-3基因（长2 326 bp）也有2个等位基因，二者之间共有12个SNPs，仅基因编码区就有8个。

Glu-D3亚基的差异并不是由于单一基因的等位突变引起的，而是由多个基因的等位突变联合控制的，明确了Glu-D3亚基与等位基因的关系[34]。

近期笔者获得了Glu-D3位点其它3个LMW–GS基因，并且筛选5个基因的STS标记。

1.2.7候选优质基因克隆与功能鉴定在小麦近缘种中分离克隆了20多个HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白候选基因和上游启动子[30, 35~37]，部分HMW-GS基因已登录GenBank、EMBL和DDBJ，如AY245797
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（1By8）、AY248704（1Dy12.1t）、AY863056 （1Dy10.1t）、AY260548（1Ay1d）、AY260549（1Ay2d）、AY303766（1Ay1s）。

从优质硬粒小麦品种Simeto中克隆的1By8 HMW 亚基基因，已获得了上游启动子和编码区全序列。

编码区全长2 166 bp，与1By9亚基基因相比，1By8基因多1个45 bp的重复序列。

在粗山羊草中鉴定、克隆的一个新的y-型亚基基因1Dy12.1t[35, 38]，包括上游启动子和编码区全序列（2 807 bp），1Dy12.1t基因与优质亚基基因1Dy10具有较高的同源性，而与1Dy12（泳动率相似）基因存在较大差异，因此有可能是一个候选优质基因。

在野生二粒（T. dicoccoides）和栽培一粒（T. monoccocum）中克隆了6个新的LMW-i型低分子量谷蛋白基因：LMW-Y5、LMW-Y13、LMW-Y22、LMW-M1、LMW-M3和LMW-M5。

其中LMW-M5是首次在栽培一粒小麦中克隆的具有9个半胱氨酸残基的LMW-i型新基因，从基因结构推测该基因对小麦品质可能具有重要作用[30]。

这些候选基因的克隆为小麦品质改良提供了新的基因资源。

重点对已克隆的1D12.1t（粗山羊草）和1By8（硬粒小麦）两个HMW谷蛋白亚基候选基因进行了原核表达与微量配粉品质检测以及基因枪转化研究，以验证其功能特性。

通过表达载体在E. coli中高效表达目的蛋白，并回收纯化；同时用SDS-PAGE和RP-HPLC 方法直接从种子中回收目的亚基，经SDS-PAGE和毛细管电泳鉴定亚基纯度。

按10g面粉加20～50 mg蛋白进行品质配粉检测，添加1D12.1t、1By8亚基后，和面时间等参数均明显提高，表明它们对面筋品质具有重要作用。

1.3 中国小麦硬度等位变异分子检测
籽粒硬度已成为国内外小麦品质分类的主要依据之一，它与磨粉品质和食品加工品质关系密切。

决定硬度的friabilin蛋白主要由PINA和PINB两类亚基组成，Pina和Pinb基因的不同变异类型是造成硬度差异的分子基础。

笔者率先在国内开展了硬度的深入研究，建立了籽粒硬度的常规快速测定方法（单籽粒硬度仪和NIR预测模型）[38, 39]，friabilin蛋白相对表达量预测籽粒硬度的准确率高达85%左右，可作为硬度的生化标记[40]。

明确了硬度的地域分布规律，即北方冬麦区以硬质小麦为主，南方冬麦区软质小麦居多，春麦区几乎全为硬质型，建议全国各地小麦品质改良应在籽粒硬度的基础上，考虑其它品质性状和指标[41]。

1.3.1发现7个新等位基因通过对国内300多份品种及高代品系和200多份农家种籽粒硬度等位变异的分子检测，明确了从农家种、历史改良品种到目前主栽品种的籽粒硬度演变规律和等位变异特点，发现了5个新等位基因[42～44]。

（1）农大3214等49个品种含硬度新基因（Pina- D1a/Pinb-D1p），即在Pinb基因编码区第42位氨基酸密码子缺失一个碱基A，从而造成移码突变，使得第42位氨基酸由Lysine（AAA）突变为Asparagine （AAU），并使第60位氨基酸由Leucine（CUG）变为终止密码子UGA，从而影响Pinb-D1b基因的正常表达。

（2）在京冬11中发现Pinb基因的新突变类型Pinb-D1q，即在Pinb基因编码区第44位氨基酸密码子由TGG变为TTG，导致编码氨基酸由Tryptophane 变为Leucine，从而影响了Pinb-D1b基因的正常表达。

（3）在贵州地方品种光头线麦和红麦中发现了Pinb的新突变型Pinb-D1t，即在Pinb基因编码区第47位氨基酸密码子由GGC突变为CGC，从而影响了Pinb-D1b的正常表达。

（4）在江苏地方品种红和尚中发现了Pina的新突变类型，命名为Pina-D1m。

（5）在江苏地方品种钻头白麦和白芒春中发现了Pina-D1新突变类型，命名为Pina-D1n。

由于Pina的突变类型以前只在山羊草以及由此培育的人工合成小麦中报道，据此修正了Morris提出的硬度形成的分子理论[45]，即以前认为PINA蛋白缺失或Pinb基因突变导致籽粒由软质变为硬质，现在改为Pina或Pinb突变都可导致小麦籽粒由软质变为硬质。

这5个新基因分别被定名为Pinb-D1p、Pinb-D1q、Pinb-D1t、Pina-D1m和Pina-D1n。

首次对六倍体小黑麦籽粒硬度形成的分子机理进行了探讨。

控制小黑麦籽粒硬度的Sina和Sinb基因都具有独特性，并在小黑麦中发现secaloindoline-a基因，命名为Sina-R1b。

还发现了编码区长450 bp独特的secaloindoline-b基因，命名为Sinb-R1c，与已报道的Sinb-R1a、Sinb-R1b序列相似性分别为99.1%和99.8%。

组成friabilin的两个主要成分SINA和SINB的差异表达，是造成六倍体小黑麦籽粒硬度差异的主要原因[46]。

1.3.2硬度等位变异与加工品质的关系用82份中国冬小麦、40份中国春小麦和CIMMYT的一些代表性种质为材料，研究了籽粒硬度等位变异与磨粉品质。