组织切片制作

四 脱 水 组织经固定和水洗后含多量水分，水与透明剂、 组织经固定和水洗后含多量水分，水与透明剂、石蜡不 能溶合，因此，在透明、浸蜡前必须进行脱水， 能溶合，因此，在透明、浸蜡前必须进行脱水，把组织中的 水份彻底驱除。 水份彻底驱除。 常用脱水剂： 常用脱水剂：酒精 注意事项： 注意事项： 1、一般从 ％酒精开始，由低浓度酒精到高浓度酒精逐步递 、一般从70％酒精开始， 如果固定液为酒精溶液， 增。如果固定液为酒精溶液，则应从与固定液中相同浓度的酒 精开始脱水。 精开始脱水。 对一些柔软组织低等无脊椎动物组织需增加酒精级数， 2、对一些柔软组织低等无脊椎动物组织需增加酒精级数，缩 小浓度差异，应从70 酒精以下50 70％ 50％ 30％开始脱水， 小浓度差异，应从70％酒精以下50％或30％开始脱水，否则收 缩较大。 缩较大。 脱水的时间根据组织的种类、体积大小和厚度而定， 3、脱水的时间根据组织的种类、体积大小和厚度而定，一般 与组织的大小成正比。 与组织的大小成正比。 脱水必须在有盖瓶子内进行。 4、脱水必须在有盖瓶子内进行。
石蜡切片技术
石蜡切片法是将组织经过一系列药品处理，使石蜡渗 石蜡切片法是将组织经过一系列药品处理， 是将组织经过一系列药品处理 入组织，包埋成蜡块，再把组织蜡块切成极薄的片子， 入组织，包埋成蜡块，再把组织蜡块切成极薄的片子， 根据不同的需要用不同的染色方法以显示不同细胞和 组织的形态，以及细胞和组织中某些化学或特殊（ 组织的形态，以及细胞和组织中某些化学或特殊（如 抗原）成份含量的变化。 抗原）成份含量的变化。
包埋器
蜡块
八 、切片和附贴 组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机切成薄片的过程称切片。 组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机切成薄片的过程称切片。 切片前的准备
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（1）切片前必须了解切片机的基本结构和性能。装刀架、刀片。 切片前必须了解切片机的基本结构和性能。装刀架、刀片。 切片前必须了解切片机的基本结构和性能 检验刀片是否锋利。 检验刀片是否锋利。 24小时后用自来水充分洗 （2）载玻片、盖玻片的处理：洗液浸泡24小时后用自来水充分洗 ）载玻片、盖玻片的处理：洗液浸泡24 95％酒精中浸泡， 涤，95％酒精中浸泡，再用软绸布或纱布擦干待用 。 （3）为了使切出的薄片能粘贴在载玻片上，可用蛋清与甘油（1:1） ）为了使切出的薄片能粘贴在载玻片上，可用蛋清与甘油（ ） 混合物均匀抹在载玻片上，再使切片附贴在玻片上。 混合物均匀抹在载玻片上，再使切片附贴在玻片上。 （4）另外，准备水浴锅、蓬松的中号毛笔，眼科镊，水槽等物。 另外，准备水浴锅、蓬松的中号毛笔，眼科镊，水槽等物。
酒精固定液： 酒精固定液： 无水乙醇（纯酒精） 无水乙醇（纯酒精）85ml（或95ml） （ ） 15ml（或5ml） 蒸馏水 （ ） 优点：有固定兼脱水作用，固定后可直接放入 ％－ ％－95 优点：有固定兼脱水作用，固定后可直接放入85％－ 酒精中脱水。对糖原、 ％酒精中脱水。对糖原、纤维蛋白和弹性纤维等固定效 果好。 果好。 缺点：但固定速度较慢，易使组织变脆。一般先用 ％ 缺点：但固定速度较慢，易使组织变脆。一般先用85％ 酒精固定数小时再放入95％酒精继续固定。 酒精固定数小时再放入 ％酒精继续苦味酸、升汞、醋酸、丙酮 重铬酸钾 等单纯固定液。 等单纯固定液。
七、包 埋 步骤： 步骤： 将熔化好的石蜡倒入包埋框， 将熔化好的石蜡倒入包埋框，用加温的镊子将组织块切 面朝下放入，将准备好的标签放在待凝固的石蜡面上， 面朝下放入，将准备好的标签放在待凝固的石蜡面上，冷 完全凝固后，修整蜡块。 却。完全凝固后，修整蜡块。 包埋温度：与浸蜡的温度接近或高 ℃左右。 包埋温度：与浸蜡的温度接近或高2℃左右。
2 切片制作过程 （1）冷冻组织蜡块，固定 ）冷冻组织蜡块， 刀架、刀片和蜡块 蜡块。 刀架、刀片和蜡块。 切片厚度： （2）切片 ：切片厚度： ） 5μm；转速：40至50次/分 ；转速： 至 次 钟。 3） （3） 展片 烫片（ （4）捞片 、烫片（45o ）、 ） 捞片 （5）切片过程中，固定好蜡块、刀片，注意刀与蜡块的角度（5o ）。 ）切片过程中，固定好蜡块、刀片，注意刀与蜡块的角度（ 出现蜡片上卷、裂隙、刀痕等立即移动刀片或切片刀， 出现蜡片上卷、裂隙、刀痕等立即移动刀片或切片刀，换至刀刃锋利 处。毛笔必须由下向上拔动，烫片时水温不宜过高等等。 毛笔必须由下向上拔动，烫片时水温不宜过高等等。 载玻 片
中性福尔马林固定液 100ml 甲醛 900ml 蒸馏水 4g 磷酸二氢钠 6.5g 磷酸氢二钠 渗透性好，组织收缩小，固定效果好。 渗透性好，组织收缩小，固定效果好。
此外，还有辛克(Zenker)氏液、酒精福尔马林液 氏液、 此外，还有辛克 辛克 氏液 酒精福尔马林液(A·F·)等混 等混 合固定液 。
或水洗） 三、 洗 涤（或水洗） 目的：组织在固定后要把渗入里面的固定液洗去， 目的：组织在固定后要把渗入里面的固定液洗去，否则留在 组织中的固定液有的会妨碍染色，有的会产生沉淀或结晶。 组织中的固定液有的会妨碍染色，有的会产生沉淀或结晶。 原则： 原则： 1、固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗。 、固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗。 2、固定液为甲醛水溶液或以水配制的可用流水冲洗。 、固定液为甲醛水溶液或以水配制的可用流水冲洗。 3、冲洗的时间与组织的种类，组织块大小和固定时间长 、冲洗的时间与组织的种类， 短有关。 一般10-24h。 短有关。 一般 。 方法：流水缓慢冲洗。小组织可不冲洗， 方法：流水缓慢冲洗。小组织可不冲洗，多次换水浸泡即 可。
五、透 明 为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后，必须经过一种既 为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后， 能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂， 能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒 介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。 介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。 常用透明剂： 常用透明剂：二甲苯 注意事项： 注意事项： 1、组织不能在二甲苯透明过久，在时间上应加以控制。 组织不能在二甲苯透明过久，在时间上应加以控制。 组织不能在二甲苯透明过久 2、组织在入二甲苯透明前最好先放入纯酒精与二甲苯等量 组织在入二甲苯透明前最好先放入纯酒精与二甲苯等量 混合液中半小时至1小时处理。 混合液中半小时至 小时处理。 小时处理 二甲苯透明，一般15 30分钟 其间需更换一次二甲苯。 15至 分钟， 3、二甲苯透明，一般15至30分钟，其间需更换一次二甲苯。 对着光线观察组织呈半透明或透明状态即可。 4、对着光线观察组织呈半透明或透明状态即可。
一般组织酒精脱水的浓度及时间如下： 一般组织酒精脱水的浓度及时间如下： 酒精浓度 70％ ％ 80% 90%或95% 或 无水乙醇I 无水乙醇 无水乙醇II 无水乙醇 脱水时间 2~4h 2~4h 2~4h 2h 2h 45~50℃恒温箱中脱水时间 ℃ 30~40min 30~40min 1h 1h 1h
适当地增加温度可缩短固定时间。 适当地增加温度可缩短固定时间。
3 常用固定液 （1） 单纯固定液 ） 福尔马林固定液： 福尔马林固定液： 甲醛 蒸馏水 10ml 90ml
优点：透渗能力强，固定均匀，组织收缩小。 优点：透渗能力强，固定均匀，组织收缩小。 缺点：但经乙醇脱水后收缩较大。 缺点：但经乙醇脱水后收缩较大。
组织切片技术
概述
制片方法的种类： 制片方法的种类：非切片法、切片法 制片方法的一般步骤： 制片方法的一般步骤：
1 2 3 切片法（1）杀死、取材与固定（2）洗涤（3）脱水 （4）透明（5）透入（6）包埋（7）切片（8）贴片 （9）染色（10）封藏
非切片法（1）整体封藏法（2）涂片法（3）磨片法
（4）分离法（浸渍分离法、撕碎法）（5）压碎法
六 浸 蜡 组织透明后，放入熔化的石蜡内浸渍， 组织透明后，放入熔化的石蜡内浸渍，使石蜡渗入组织同时 取代组织内的二甲苯，这个过程称浸蜡。 取代组织内的二甲苯，这个过程称浸蜡。 注意事项： 注意事项： 1、夏季：采用熔点高的石蜡（56－60℃）；冬季，应用熔点 、夏季：采用熔点高的石蜡（ － ℃）；冬季 冬季， 略低一点的石蜡（ － ℃）。一般常用石蜡熔点为 一般常用石蜡熔点为52－ ℃ 略低一点的石蜡（52－54℃）。一般常用石蜡熔点为 －60℃。 2、浸蜡前可在石蜡二甲苯等量混合液内处理半小时至 小时。 小时。 、浸蜡前可在石蜡二甲苯等量混合液内处理半小时至1小时 3、浸蜡温度（恒温箱温度）：比石蜡的熔点高2℃。 浸蜡温度（恒温箱温度）：比石蜡的熔点高2℃。 ）：比石蜡的熔点高2℃ 浸蜡时间： 小时，其间更换一次石蜡。 4、浸蜡时间：3至5小时，其间更换一次石蜡。
3 切取组织，刀要锋利，动作要轻，不可来回切割，也 切取组织，刀要锋利，动作要轻，不可来回切割， 不要挤压或牵拉组织， 不要挤压或牵拉组织，以免组织变形或内部细胞结构 受损伤而发生变化。 受损伤而发生变化。 切取的组织块必须小而薄。 4 切取的组织块必须小而薄。 组织块的大小一般为0.5× × 组织块的大小一般为 ×0.5×0.2cm、1×1×0.3cm或 、 × × 或 1.5×1.5×0.3~0.5cm，最厚不能超过 × × ，最厚不能超过0.5cm。 。 柔嫩组织、被膜厚而坚实的器官、 另：柔嫩组织、被膜厚而坚实的器官、小动物的器官及组织 采取消化道组织时应保持清洁。 5 采取消化道组织时应保持清洁。
二、固 定
固定就是将采取的新鲜组织，放入固定液内， 固定就是将采取的新鲜组织，放入固定液内，借助化学 药品的作用使细胞内的蛋白质、脂肪、 药品的作用使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成份沉 淀保存下来。同时，使组织硬化不变形，有利于固定以后的 淀保存下来。同时，使组织硬化不变形， 处理。 处理。
（２）混合固定液 波音(Bouin)氏固定液： 氏固定液： 波音 氏固定液 饱和苦味酸水溶液 75ml 75ml 甲醛 5ml 冰醋酸 渗透迅速，固定均匀，组织收缩小，切片着色良好。 渗透迅速，固定均匀，组织收缩小，切片着色良好。 卡诺氏(Carnoy)固定液： 固定液： 卡诺氏 固定液 60ml 无水乙醇 三氯甲烷（氯仿） 三氯甲烷（氯仿） 30ml 冰醋酸 10ml 可固定细胞浆和细胞核， 适宜染色体的固定. 固定速度快 ，可固定细胞浆和细胞核，尤其适宜染色体的固定. 可固定细胞浆和细胞核 尤其适宜染色体的固定