第二章各种工具酶.ppt
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第二章各种工具酶
内容提要
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA聚合酶 (聚合酶 I /Taq聚合酶 /反转录酶)
第一节 限制性核酸内切酶
Restriction endonuclease （RE）
一、限制性核酸内切酶的概念 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 四、影响限制性酶活性的因素 五、限制性内切酶对DNA的消化
一、概念
1. 定义 是一类能够识别双链DNA中的特定核苷
酸序列，并在特定位点切割双链DNA的 内切酶。 2. 来源 细菌的限制性内切酶。
3. 功能
(1) 限制 Restriction 侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），
能被限制性内切酶识别和降解，从而保 护自身的DNA不被降解。
图 细菌的限制系统
(4) 粘性末端 sticky end
含有几个核苷酸的单链末端。 ① 5´端突出 EcoR I ：形成5’-粘性末端。 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ ② 3´端突出 Pst I ：形成3’-粘性末端。 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
（1）识别序列与特点 双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。 识别序列长度4 ~ 8 bp。 多数是回文结构。II s型除外。 （2）酶切位点 在识别位点处，切开双链DNA，形成粘
性末端或平齐末端。
图 Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列
Hale Waihona Puke Baidu
(3) 平齐末端 blunt end
EcoR V ：产生平齐末端。 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
(2) 修饰 Modification
细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从 而防止限制性内切酶的识别和水解。
① Dam甲基化酶 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入
甲基。
图 细菌的修饰系统
图 甲基化位点：DNA上的 A/C
补就可以连接。这比连接两个平齐末端 容易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同 的粘性末端可以连接成环形分子。
图 粘性末端连接
5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进 行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几 个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端。
2. III 型限制性内切酶
与I型酶有甲基化功能。 能在DNA链上的特异位点切割。 其切割位点在识别位点以外。 反应需要ATP、 Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。 基因工程中用途不大。 如EcoP15: CAGCAG------
3. II型限制性内切酶
1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先 从流感嗜血菌中分离出HindⅡ 。
限制酶的命名
图 几种重要的限制酶
图 几种限制酶的识别位点
三、限制性内切酶的分类
分为I 型、II型和III型。
1. I 型限制性内切酶
1968年，首先由M. Meselson和R. Yuan 在大肠杆菌 B株和 K株分离。如 EcoB和 EcoK。
（1）识别序列 未甲基化修饰的特异序列：
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
（2）切割位点
切点距离识别位点约400~7000 bp。不在 识别位点。随机切开一条单链。
如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶 功能，使另一条链甲基化。
如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。 需ATP、Mg2+ 和S-腺苷甲硫氨酸。
EcoR I ：5’端凸出
5’-
GAATTC
3’-
CTTAAG
5’-
G AATTC
3’-
CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
Pst I ：3’端凸出
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
③粘性末端的意义
连接方便 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互
新位点，不能再被原来的酶所识别。
5’-GGATCC-3’ BamH I 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。
四、同裂酶 Isoschizomers
识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶 识别序列相同和切点相同。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
二、限制性内切酶的命名
1973年Smith等提出酶的命名原则。
用属名的第一个字母和种名的头两个字 母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌 （Escherichia coli）用Eco表示。用一个 大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一 宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马 字母表示。如EcoR I。
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
Bgl Ⅱ
六、限制酶的活性
限制性内切酶的识别和酶切活性，只有 在最适条件下，才表现出最大酶切能力 和位点专一性。
1. 活性的定义 在适当反应条件下，1小时内完全酶解
1g特定DNA底物，所需要的限制性内 切酶的量，为一个活性单位。
② 不完全同裂酶 识别序列相同，但切点不同。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
五、同尾酶 Isocaudamers
1. 定义 识别序列不同，但能切出相同的粘性末
端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I等为同尾酶。 2. 特点 同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的
内容提要
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA聚合酶 (聚合酶 I /Taq聚合酶 /反转录酶)
第一节 限制性核酸内切酶
Restriction endonuclease （RE）
一、限制性核酸内切酶的概念 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 四、影响限制性酶活性的因素 五、限制性内切酶对DNA的消化
一、概念
1. 定义 是一类能够识别双链DNA中的特定核苷
酸序列，并在特定位点切割双链DNA的 内切酶。 2. 来源 细菌的限制性内切酶。
3. 功能
(1) 限制 Restriction 侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），
能被限制性内切酶识别和降解，从而保 护自身的DNA不被降解。
图 细菌的限制系统
(4) 粘性末端 sticky end
含有几个核苷酸的单链末端。 ① 5´端突出 EcoR I ：形成5’-粘性末端。 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ ② 3´端突出 Pst I ：形成3’-粘性末端。 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
（1）识别序列与特点 双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。 识别序列长度4 ~ 8 bp。 多数是回文结构。II s型除外。 （2）酶切位点 在识别位点处，切开双链DNA，形成粘
性末端或平齐末端。
图 Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列
Hale Waihona Puke Baidu
(3) 平齐末端 blunt end
EcoR V ：产生平齐末端。 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
(2) 修饰 Modification
细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从 而防止限制性内切酶的识别和水解。
① Dam甲基化酶 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入
甲基。
图 细菌的修饰系统
图 甲基化位点：DNA上的 A/C
补就可以连接。这比连接两个平齐末端 容易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同 的粘性末端可以连接成环形分子。
图 粘性末端连接
5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进 行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几 个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端。
2. III 型限制性内切酶
与I型酶有甲基化功能。 能在DNA链上的特异位点切割。 其切割位点在识别位点以外。 反应需要ATP、 Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。 基因工程中用途不大。 如EcoP15: CAGCAG------
3. II型限制性内切酶
1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先 从流感嗜血菌中分离出HindⅡ 。
限制酶的命名
图 几种重要的限制酶
图 几种限制酶的识别位点
三、限制性内切酶的分类
分为I 型、II型和III型。
1. I 型限制性内切酶
1968年，首先由M. Meselson和R. Yuan 在大肠杆菌 B株和 K株分离。如 EcoB和 EcoK。
（1）识别序列 未甲基化修饰的特异序列：
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
（2）切割位点
切点距离识别位点约400~7000 bp。不在 识别位点。随机切开一条单链。
如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶 功能，使另一条链甲基化。
如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。 需ATP、Mg2+ 和S-腺苷甲硫氨酸。
EcoR I ：5’端凸出
5’-
GAATTC
3’-
CTTAAG
5’-
G AATTC
3’-
CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
Pst I ：3’端凸出
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
③粘性末端的意义
连接方便 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互
新位点，不能再被原来的酶所识别。
5’-GGATCC-3’ BamH I 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。
四、同裂酶 Isoschizomers
识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶 识别序列相同和切点相同。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
二、限制性内切酶的命名
1973年Smith等提出酶的命名原则。
用属名的第一个字母和种名的头两个字 母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌 （Escherichia coli）用Eco表示。用一个 大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一 宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马 字母表示。如EcoR I。
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
Bgl Ⅱ
六、限制酶的活性
限制性内切酶的识别和酶切活性，只有 在最适条件下，才表现出最大酶切能力 和位点专一性。
1. 活性的定义 在适当反应条件下，1小时内完全酶解
1g特定DNA底物，所需要的限制性内 切酶的量，为一个活性单位。
② 不完全同裂酶 识别序列相同，但切点不同。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
五、同尾酶 Isocaudamers
1. 定义 识别序列不同，但能切出相同的粘性末
端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I等为同尾酶。 2. 特点 同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的