实验六酵母菌细胞总数的测定
6细胞大小测定及数量测定
微生物： 实验目的： 掌握细胞大小的测定方法和计数板测定细胞数量的方法 实验材料： 二、实验材料： 1、菌种：酿酒酵母 、菌种： 2、器材：显微镜、血球计数板、镜台测微尺、目镜测微尺 、器材：显微镜、血球计数板、镜台测微尺、 实验内容： 三、实验内容： 1、测定微生物细胞的大小 、 2、微生物细胞的显微直接计数法 、 实验步骤： 四、实验步骤： （一）微生物细胞大小测定 1、目镜测微尺的校正 、 镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上（ 镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上（目镜测微尺已在显微镜筒 ），先 下目镜测微尺的校正值。 中），先10x，后40x，计算 ， ，计算40x下目镜测微尺的校正值。镜台测微尺放入盒中。 下目镜测微尺的校正值 镜台测微尺放入盒中。 2、细胞大小的测量 、 于载玻片滴加酵母菌悬液1滴 加盖玻片，用目镜测微尺测量细胞大小（宽和长） 于载玻片滴加酵母菌悬液 滴，加盖玻片，用目镜测微尺测量细胞大小（宽和长） （二）细胞数量测定 先将大盖玻片盖在血球计数板上，再从盖玻片边缘将酵母菌悬液滴入计数室（或者， 先将大盖玻片盖在血球计数板上，再从盖玻片边缘将酵母菌悬液滴入计数室（或者， 在计数区滴加菌悬液后再盖上盖玻片）。于10X找到计数区，再调至40X，适当减弱 在计数区滴加菌悬液后再盖上盖玻片）。于 找到计数区，再调至 ， ）。 找到计数区 光强，计数（统计5个大格中的酵母菌数量 个大格中的酵母菌数量）。 光强，计数（统计 个大格中的酵母菌数量）。
五、作 业 （一）微生物细胞大小测定 1、在40x下，目镜测微尺 相当， 、 下 目镜测微尺____格与镜台测微尺 ____相当，故目镜测微尺 格＝ ____ 格与镜台测微尺 相当 故目镜测微尺1格 2、酵母菌大小 、
1 长（格） 宽（格） 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均格数 平均长度 微米） （微米）
实验八 酵母菌细胞数量和大小的测定
二、实验材料
1、菌种：酿酒酵母培养液 2、器材：血球计数板、目镜测微尺
三、实验原理及结果记录
1、显微直接计数法 （血球计数板）
血球计数扳的构造
0.1毫米
a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)
b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)
1mm/20格
5X4
1/400mm2
1、记录目镜测微尺的标定结果，以及所测
量的酵母细胞大小。
物镜 4× 10× 40× 目尺格数 小方格数 目尺校正值（μm）
40 100 100
20 20 5
25 10 2.5
显微镜下对应的测微尺格数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值（μm）
长 宽
1、用血球计数板进行酵母菌液计数并记录结果。 一般在每个计数室中取5个中方格(左上、左下、右上、右下、 中间）进行计数，数两个计数室。可拍照后在电脑上数。
各中格中的菌数 1 第一室 第二室 1ml=1立方厘米 2 3 4 5 菌数 /ml 二室 平均数
A
B
A表示五个中方格的总菌数；B表示菌液的稀释倍数。
（二）酵母细胞大小的测定
1、利用血球计数板在中、高倍镜下（10×、40×）标定目镜 测微尺。 2、取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。 3、移去血球计数板，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到 目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体 的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位 数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于 该菌的长和宽。选取10个不同大小酵母细胞进行大小测定 并记录结果（观察到的是平均大小）。
目尺格数1cm100格一血球计数板计数1检查血球计数板2菌悬液加样先盖盖玻片3显微镜下计数并记录4清洗血球计数板用水冲洗不要用硬物或刷子去刷四实验方法二酵母细胞大小的测定1利用血球计数板在中高倍镜下1040标定目镜测微尺
酵母菌数的测定（直接计数）[经验]
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实验直接计数法及酵母菌数的测定一、目的要求1、了解血球计数板测定微生物数量的原理。
2、了解血球计数板的结构，学习并掌握利用血球计数板进行酵母菌记数的方法，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。
二、实验原理微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。
前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值。
后者是在平板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。
三、实验器材菌种：酵母菌液仪器：显微镜，血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸等四、操作方法酵母细胞数的测定操作方法1、血球计数板的构造血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。
玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。
方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。
计数室通常有两种规格。
一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。
（本实验用）2、酵母菌数量的测定(1) 取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。
(2) 将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。
也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。
(3) 静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。
(4) 计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。
如果是25中格计数板。
除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。
由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。
酵母菌大小的测定及细胞计数实验目的学会测ppt课件
(6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大 方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方 和左方线上的酵母细胞)。 (7)对每个样品计数三次，取其平均值，按下列公 式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。
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3.计算公式 (1)16格×25格的血球计数板计算公式：
酵母细胞数／ml=100小格内酵母细胞个数／ 100×400×104×稀释倍数 (2)25格x16格的血球计数板计算公式：
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4.酵母菌大小的测定 (1)取下物镜测微尺，换上酵母菌水浸制片。 (2) 测 量 菌 体 的 长 度 和 宽 度 各 占 目 镜 测 微 尺 几 格 ， 然后换算出菌体的实际长度。 (3)在同一标本上测定5-10个菌体，求其平均值。
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(二)酵母细胞数的测定操作方法 1.血球计数板的构造
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制 玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个 平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔 为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网 上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格 为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和 宽各为1m，深度为，其体积为0.1mm3。
酵 母 细 胞 数 ／ ml=80 小 格 内 酵 母 细 胞 个 数 ／ 80×400×104×稀释倍数
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4.血球计数板的清洁 血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬
物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95％ 的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。 通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。 Βιβλιοθήκη 不干净，则必须重复清洗直到干净为止。
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计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格， 每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中 格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一 种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都 是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。
实验六酵母菌细胞总数的测定
实验六酵母菌细胞总数的测定酵母菌是一类微生物，它们广泛存在于自然界的土壤、水体、植物和动物食品中。
酵母菌在工业和科学研究中具有广泛的应用，例如在制酒、制药、发酵面包、化妆品、生物污水处理等方面。
因此，酵母菌细胞总数的测定对于酵母菌应用研究和品质控制具有重要意义。
实验目的通过酵母菌细胞总数的测定，了解酵母菌数量的变化和生长规律，掌握测定方法和技巧，为酵母菌的应用研究和品质控制提供实验数据和参考。
实验原理通过显微镜观察菌落计数法和板层法两种方法来测定酵母菌细胞总数。
一、菌落计数法方法：取不同体积的发酵液，经稀释后均匀涂布于琼脂平板上，在适宜温度下培养一定时间后，计算生长菌落数。
计算公式：细胞总数=平均菌落数× 菌群系数× 稀释倍数其中：平均菌落数：每平板上的平均菌落数菌群系数：每1个菌落所包含的菌体数稀释倍数：制成平板时的涂布稀释倍数二、板层法方法：亚硫酸氢钠和碘化钾混合后加入琼脂，使其形成带有抑菌区的琼脂层，经过金属条温度下降至约40℃后加入酵母悬浮液，均匀涂布于琼脂平板上，在适宜温度下培养一定时间后，计算生长菌落数。
计算公式：细胞总数=（下限+上限）/2× 1/涂布量下限：最小生长菌落数涂布量：菌液在琼脂平板上均匀涂布的数量实验步骤1. 酵母菌培养将酵母菌培养在适宜的培养基上，70摄氏度处理，然后加入液体培养基中，继续孵育，并记录生长周期。
（1）首先制备连续稀释物，在组织均一切割后，加入纯水或盐水中，制作成一定稀释度的悬浮液。
（2）取0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml不同的稀释液，在常规琼脂平板表面均匀下板培养。
（3）在培养箱中适当的温度下培养，3~5天后，通过显微镜计算每个菌落的数量。
（4）根据菌落数，统计酵母菌细胞总数。
3. 板层法（1）准备带抑菌区的琼脂平板，和2-3ml的酵母悬浮液。
（2）用真空过滤器将酵母悬浮液过滤到无菌锥形瓶中，测定菌体数量，并按需稀释。
实验六 微生物的大小测定和显微直接计数
五、实验结果
1、微生物大小测定实验结果
（1）将目镜测微尺校正结果填入下表： ）将目镜测微尺校正结果填入下表：
接物镜 低倍镜 高倍镜 油 镜 接物镜倍数 目镜测微尺格 数 镜台测微尺格 数 目镜测微尺每格代表 的长度(μm)
接目镜的放大倍数________
（2） 酵母细胞大小的测量结果： ） 酵母细胞大小的测量结果：
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的 特制玻片制成的。 特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的 构成三个平台。中间的平台较宽， 槽，构成三个平台。中间的平台较宽， 其中间又被一短横槽隔为两半， 其中间又被一短横槽隔为两半，每半边 上面个刻有一个方格网。 上面个刻有一个方格网。 方格网上刻有9个大方格 个大方格， 方格网上刻有 个大方格，其中只有中间 的一个大方格为计数室， 的一个大方格为计数室，供微生物计数 这一大方格为边长为1mm正方形， 正方形， 用。这一大方格为边长为 正方形 深度为0.1mm，其体积为 深度为 ，其体积为0.1mm3。 。
微生物 名称 目镜测微尺每 格代表的长度 /µm 宽 目镜测微 尺格数 宽度 /µm 目镜测微 尺格数 长 长度/将结果记录于下表中， 将结果记录于下表中，A表示五个中方格中的总 菌数； 表示菌液稀释倍数。 菌数；B表示菌液稀释倍数。
各中格中菌数 1 第一室 第二室 2 3 4 5 A B 二室平 菌数/ml 均值
(1)目镜测微尺的构造 目镜测微尺是一块圆形玻 目镜测微尺的构造 其中央刻有精确的等分刻度，有等分为50小 片，其中央刻有精确的等分刻度，有等分为 小 格和100小格两种。刻度的大小是随使用的接目 小格两种。 格和 小格两种 镜和接物镜的放大倍数而改变， 镜和接物镜的放大倍数而改变，用前必须用镜台 测微尺来标定。 测微尺来标定。 (2)镜台测微尺的构造 镜台测微尺为一块特制 镜台测微尺的构造 的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度， 的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度， 将长1mm的直线等分为 小格，每小格等于 的直线等分为100小格 小格， 将长 的直线等分为 10µm。 。
实验八酵母菌细胞数量和大小的测定-医学资料
四、实验Байду номын сангаас法
（一）血球计数板计数
1、检查血球计数板 2、菌悬液加样（先盖盖玻片） 3、显微镜下计数并记录 4、清洗血球计数板（用水冲洗，不要用硬物或刷子去刷）
（二）酵母细胞大小的测定
1、利用血球计数板在中、高倍镜下（10×、40×）标定目镜 测微尺。
2、取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。 3、移去血球计数板，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到
1mm/20格
5X4
每个大方格均被分成400个小方格；根据规定每个大方格的 边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片 后，在盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的 容积为0.1 mm3（万分之一毫升）。
1、用血球计数板进行酵母菌液计数并记录结果。
一般在每个计数室中取5个中方格(左上、左下、右上、右下、 中间）进行计数，数两个计数室。可拍照后在电脑上数。
目镜测微尺每格长度（μm）=
两重合线间计数室小方格数×50 两重合线间目镜测微尺格数
1、记录目镜测微尺的标定结果，以及所测 量的酵母细胞大小。目尺格数=1cm=100格
物镜 4× 10×
目尺格数 小方格数 目尺校正值（μm）
显微镜下对应的测微尺格数
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值（μm） 长 宽
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格， 是专门用来校正目镜测微尺的。当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新 校正目镜测微尺每一格所代表的长度。也可用血球计数板来进行标定，血球计数 板每个小方格的边长为50μm。
目镜测微尺的标定：
用低倍镜观察，当看到血球计数板的小方格后，转动目镜， 使目镜测微尺与小方格平行，移动推动器，寻找两条完全重合 的刻度线，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和小方格的 格数。因为小方格每格长50μm，所以由下列公式可以算出目镜 测微尺每格所代表的长度。
实验六酵母菌细胞总数的测定
实验六酵母菌细胞总数的测定一、目的要求1.学习并掌握血球计数板计数的原理；2.掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、实验材料1.菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）麦芽汁培养液2.其它：显微镜、血球计数板、手动计数器、擦镜纸、吸水纸等三、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物总数目。
血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。
中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。
计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。
血球计数板的构造如下。
图6-1 血球计数板构造常见血球计数板的计数室有两种规格：一种是16×25型，即计数室共分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格；另一种是25×16型，即计数室先被分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。
但无论是哪一种规格的血球计数板，其计数室的小方格都是400个。
我们采用的是25×16型。
计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。
计算公式如下：1ml菌液中总菌数＝5×104 A·BA为5个中方格中的总菌数，B为稀释倍数。
四、操作步骤1.菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适当的菌悬液。
2.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细作用自动进入计数室（注意取样前要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生）。
3.找计数室：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数（注意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清晰）。
实验六、微生物细胞的大小测量和显微计数目
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计数规则：
1）要求每小格内约有5－10个菌体为宜；
2）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；
3）当细胞位于方格的线上时，一般只数上方和右边线上的细胞；
4）酵母出芽，又未脱离母体的，只有当芽体大小达到母细胞的
一半时，即作为两个菌体计算；
操作要点：
•血球计数室要清洁。
•观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。
操作要点： • 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。 • 换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏 镜头。
2、显微直接计数
1）血球计数室的观察和清洗 取血球计数板置于载物台上→ 观察熟悉计数室的中 方格和小方格 → 取下血球计数板→用自来水冲洗计 数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净→ 置 干燥箱干燥 。
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2）样品中酵母菌细胞的直接计数：
取干净血球计数板→ 在计数室上方盖上盖玻片→ 用无 菌吸管，吸取摇匀的酵母菌稀释液→ 在盖玻片边缘沾 一下，让菌液沿缝隙靠毛细管渗透作用进入计数室→ 静置5min → 低倍镜或高倍镜计算每个中方格内的细 胞数→ 完毕后清洗血细胞计数板→ 冲洗、干燥
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二、基本原理
1、微生物细胞大小的测量
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也 是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要 在显微镜下，借助特殊测量工具――测微尺（包括 镜台测微尺和目镜测微尺）。
测微尺原理：镜台测微尺是中央部分刻有精确等 分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长 0.01mm(即10μm)。镜台测微尺并不直接用来测量细 胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长 度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。
酵母菌细胞数和发芽率的测定、微生物细胞大小的测定实验报告
酵母菌细胞数和发芽率的测定、微生物细胞大小的测定实验报告实验报告一、实验目的1.了解酵母菌的基本结构和特点，能够通过显微镜观察和测量微生物的大小。
2.了解酵母菌的生长规律和判断细胞数量的方法。
3.学习正确使用显微镜、计数盘等工具的方法和技能。
二、实验原理1.酵母菌细胞数量的测定酵母菌生长的过程中，细胞数量会不断增加。
在进行数量的测定时，可以使用计数盘的方法，将酵母菌培养液进行稀释后，挑取一定数量的细胞在计数盘中进行计数，从而得出总细胞数。
计算公式：N=Nv/(Vs某d)其中，N为总细胞数，Nv为计数盘中可数的细胞数，Vs为取自培养液的样品体积，d为稀释倍数。
2.酵母菌发芽率的测定酵母菌发芽率是指在特定条件下发芽的酵母菌占总酵母菌数量的百分比。
测定方法为：将稀释后的培养液分别在不同的温度和时间条件下进行培养，待观察到发芽的细胞数后再进行计算。
计算公式：G=Nf/Nt某100%其中，G为发芽率，Nf为观察到发芽的细胞数，Nt为总细胞数。
三、实验步骤1.酵母菌细胞数量的测定（1）将酵母菌液稀释至合适浓度，取出10μl滴于计数盘的盆2中。
（2）低倍镜下计数，计算得到总细胞数。
2.酵母菌发芽率的测定（1）将酵母菌液稀释至合适浓度，分别放置于不同的温度和时间条件下培养。
（2）观察不同条件下的发芽情况，计算得到发芽率。
四、实验结果与分析1.酵母菌细胞数量的测定（1）计算盘的小方格数为16，每个小方格的面积为0.010mm²。
（2）经过计数后得到的样品的平均值为32个/小方格，计算得到总细胞数为32某16/(0.01某10)=5120个/mL。
2.酵母菌发芽率的测定（1）在不同的温度条件下，观察到的发芽率分别为：30℃1h（90%）、35℃1h（75%）、40℃1h（60%）。
（2）在不同的时间条件下，观察到的发芽率分别为：30℃1h（90%）、30℃2h（80%）、30℃3h（70%）。
五、实验思考通过本次实验，我们了解到了酵母菌的基本结构和特点，学会了正确使用显微镜、计数盘等工具的方法和技能，并且能够通过显微镜观察和测量微生物的大小。
酵母菌数目的测定
培养液中酵母菌种群数量的变化一、血球板计数法1、基本构造A、盖玻片B、载玻片玻片中有四条下凹的槽三个平台，中间的平台较宽，中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面,刻有一个方格网（共两个）。
2、方格网形态9个大格，中间大格用来计算即E格用来计算，E格（放大后两种形态计）一种是25X16形式：25中格，每一个中格又可以放大，由16个小格组成一种是16X25形成：16中格，每一个中格又可以放大，由25个小格组成总结：1、即9大格拿一大格计数2、这一大格有25中格（每个中格有16小格）或者16中格（每个中格有25小格）3、所以一大格有400小格3、取样方法两种取样方法第一种：有80小格第二种：有100小格4、计算方法以第一种的为计算方法：25X161）、五点取样，即五个中格，每个中格16个小格（共80小格）2）、如果算出80格共有总数A个，则每一个小格有酵母菌数为：G1=A/803）、则一个大格有400小格，所以一个大格有酵母菌数为：400G4)、而每一个大格的体积为：所以如果计算1ml培养液有多少酵母菌数公式为：如果是25X16400GX104=400X（A/80）X104如果是16X25400X（A/100）X104思考：书本中是2mmX2mm，深度是0.1mm，如果用25X16的进行计数，80格总数为A个，则10ml的培养液中有多少个酵母菌？大方格的长和宽各为2mm，深度为0.1mm，其体积为0.4mm3。
换算为1mL：1000/0.4 = 2.5×103，即1mL是2.5×103个0.4mm3。
则总数=（A/80）×400 X 2.5X103 X10注意：如果小方格中的酵母菌太多（培养液中酵母菌太浓）则要进行稀释。
则上面的计算就要再X稀释倍数即如果是25X16400GX104 X稀释倍数= 400X（A/80）X104 X稀释倍数三、本实验问题及注意点1、如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当采取怎样的措施？稀释2、对于压在小方格界线上的酵母菌，应当怎样计数？只计数相邻两边及其顶角的酵母细胞数（下图中红点都要计算）3、血球计数板的清洁血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。
酵母菌计数
微生物的大小测定及显微镜直接计数 一、实验目的1、学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。
2、了解血细胞计数板的构造及计数原理。
3、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理1、微生物大小测定原理微生物细胞的大小是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。
其测量工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺是中央部分刻标准刻尺的载玻片，其尺度总长为1mm ，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100小格，每一小格长度为0.01mm ，即10μm 。
如图1。
图1 镜台测微尺中央部分及镜台测微尺校正目镜测微尺目镜测微尺，如图2，是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微放大后的细胞物象。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。
图2 目镜测微尺格数两重合线间目镜测微尺格数两重合线间镜台测微尺目镜测微尺每格长度10*2、测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
本次试验采用显微直接计数法。
显微直接计数法：将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser ）细菌计数板或Hawksley 计数板。
三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
显微计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点则是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对运动性强的活菌进行计数。
酵母菌数量的测定—显微镜直接计数法
五、数据处理
各中格中的菌数（个）
二室 平均
菌数
A
B
值 （个/
1
2
3
4
5
（个 mL）
） 第一
室 第二
室
15
六、思考题 能否利用显微镜直接计数的方法测定
酵⺟菌菌液中的死细菌与活细菌？如果可 以，如何进行？如果不可以，请说明原 因。
16
式1：总菌数（个/mL）=A/5×16×10000×B 式2：总菌数（个/mL）=A/5×25×10000×B
三、实验器材 血球计数板、显微镜、盖玻片、滴管、 酿酒酵⺟菌液
8
四、实验步骤
1、加样品
•取净洁干燥的血球计数板盖上盖玻片。 •将菌悬液适当稀释（稀释1倍），摇匀。
•用滴管吸取菌悬液，加1～2滴于盖玻片边 缘，让菌液靠毛细渗透作用进入计数室。 •放置5 min左右让计数室充满菌液。
• 如遇酵⺟出芽，芽体大小达到⺟细胞一般时，即作 为两个菌体计算。
• 计算一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来 计算样品的含菌量。
• 菌体在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下 才能看全，所以，观察时必须不断调节细螺用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷； •镜检观察是否清洗干净； •洗后干燥（晾干、吹干，或乙醇、丙酮等有 机溶剂脱水干燥）。
4
5
血球计数板规格
计数室高度：0.1mm 大方格边⻓：1mm。 每个大方格分成400个小方格。
规格一：每个大方格分成16个中方格，每个中方格又分 成25个小方格。 规格二：每个大方格分成25个中方格，每个中方格又分 成16个小方格。
设五个中方格的总菌数为A，菌液的稀释倍 数为B，规格一、规格二计数板，分别采用式 1、式2计算。
酵母菌数目的测定
培养液中酵母菌种群数量的变化一、血球板计数法1、基本构造A、盖玻片B、载玻片玻片中有四条下凹的槽三个平台，中间的平台较宽，中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面,刻有一个方格网（共两个）。
2、方格网形态9个大格，中间大格用来计算即E格用来计算，E格（放大后两种形态计）一种是25X16形式：25中格，每一个中格又可以放大，由16个小格组成一种是16X25形成：16中格，每一个中格又可以放大，由25个小格组成总结：1、即9大格拿一大格计数2、这一大格有25中格（每个中格有16小格）或者16中格（每个中格有25小格）3、所以一大格有400小格3、取样方法两种取样方法第一种：有80小格第二种：有100小格4、计算方法以第一种的为计算方法：25X161）、五点取样，即五个中格，每个中格16个小格（共80小格）2）、如果算出80格共有总数A个，则每一个小格有酵母菌数为：G1=A/803）、则一个大格有400小格，所以一个大格有酵母菌数为：400G4)、而每一个大格的体积为：所以如果计算1ml培养液有多少酵母菌数公式为：如果是25X16400GX104=400X（A/80）X104如果是16X25400X（A/100）X104思考：书本中是2mmX2mm，深度是0.1mm，如果用25X16的进行计数，80格总数为A个，则10ml的培养液中有多少个酵母菌？大方格的长和宽各为2mm，深度为0.1mm，其体积为0.4mm3。
换算为1mL：1000/0.4 = 2.5×103，即1mL是2.5×103个0.4mm3。
则总数=（A/80）×400 X 2.5X103 X10注意：如果小方格中的酵母菌太多（培养液中酵母菌太浓）则要进行稀释。
则上面的计算就要再X稀释倍数即如果是25X16400GX104 X稀释倍数= 400X（A/80）X104 X稀释倍数三、本实验问题及注意点1、如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当采取怎样的措施？稀释2、对于压在小方格界线上的酵母菌，应当怎样计数？只计数相邻两边及其顶角的酵母细胞数（下图中红点都要计算）3、血球计数板的清洁血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。
霉菌、酵母菌总数测定
标准值
单项检验结论 备注 检验人员： 检验人员：
检验日期： 检验日期：
关于实测结果的填写
若所有稀释度平板上的菌落数都为“ 若所有稀释度平板上的菌落数都为“0”，则实测结果为 最低稀释倍数计算。 ＜1×最低稀释倍数计算。 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内 10~150CFU），计算两个平板菌落数的平均值， ），计算两个平板菌落数的平均值 （10~150CFU），计算两个平板菌落数的平均值，再将 平均值乘以相应的稀释倍数，作为每克中菌落总数结果。 平均值乘以相应的稀释倍数，作为每克中菌落总数结果。 若所有平板上菌落数均大于150CFU， 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高 的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计， 的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按 平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均小于10CFU， 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
去 皮 键
取（带上试管架）： 带上试管架）： 装有灭菌蒸馏水的锥形瓶1 装有灭菌蒸馏水的锥形瓶1个 装有9mL 灭菌蒸馏水的试管3 装有9mL 灭菌蒸馏水的试管3支 空试管1 空试管1支
从培养皿筒中取出培养皿。 从培养皿筒中取出培养皿。
培 养 皿 筒
取出
培 养 皿
在培养皿上编号 提示：培养皿上的标记为稀释倍数。
28℃±1℃ ℃ ℃ 5d
菌落计数 报告
检
固体样品： 固体样品：
样
在电子天平上称取 25g + 225mL灭 灭 菌蒸馏水
固体样品存放罐
固体样品称量
用镊子取酒精棉擦手，点燃酒精灯； 用镊子取酒精棉擦手，点燃酒精灯； 打开稀释瓶盖，放在天平上， 打开稀释瓶盖，放在天平上，等显示屏上的数字稳定 去皮” 当数字显示为“ 开始称量。 后，按“去皮”键，当数字显示为“0”时，开始称量。
实验六酵母菌细胞总数的测定
实验六酵母菌细胞总数的测定实验六酵母菌细胞总数的测定一、实验目的通过实验掌握酵母菌细胞总数的测定方法，了解酵母菌在发酵过程中的生长繁殖情况。
二、实验原理酵母菌是一种单细胞真菌，在适宜的条件下可以迅速生长繁殖。
通过测定酵母菌细胞的总数，可以了解其在发酵过程中的生长情况。
本实验采用血球计数板法进行酵母菌细胞总数的测定。
三、实验步骤1.准备实验材料：血球计数板、显微镜、酵母菌培养液、无菌棉签、离心管、离心机、滴管等。
2.将酵母菌培养液在离心机中离心10分钟，转速为1000转/分钟，弃去上清液，留下沉淀物。
3.用无菌棉签轻轻地将沉淀物涂抹在血球计数板的计数室底部，注意不要将沉淀物压破。
4.将血球计数板放置在显微镜下，找到计数室所在的位置，观察并计数酵母菌细胞的数量。
每个大方格内含有16个小方格，每个小方格内含有16个网格，每个网格内含有16个红细胞和白细胞或霉菌菌落等。
5.统计所有网格内的酵母菌细胞数量，并计算每毫升发酵液中所含的酵母菌细胞数。
公式如下：酵母菌细胞数/mL = （A×B×C×D×10000）/10000×W×V其中，A代表每个大方格内酵母菌细胞数，B代表每个小方格内酵母菌细胞数，C代表每个小方格内红细胞和白细胞或霉菌菌落数，D代表稀释倍数，W代表称取发酵液的质量（g），V代表发酵液的体积（mL）。
6.重复实验三次，求平均值。
四、实验结果与分析1.实验结果：在实验过程中，我们发现血球计数板的使用对于酵母菌细胞总数的测定非常重要。
通过血球计数板的统计和分析，我们得到了每毫升发酵液中酵母菌细胞的数量。
根据实验数据，我们可以得出以下表格：2.结果分析：从实验结果可以看出，三次实验的平均值为4.0×10^7个/mL。
这说明在发酵过程中，酵母菌的数量呈指数增长趋势，增长速度较快。
这也说明了酵母菌在适宜的条件下可以迅速生长繁殖。
同时，实验过程中需要注意无菌操作，避免杂菌污染对实验结果的影响。
酵母菌计数方法
酵母菌计数方法
酵母菌计数方法是一种用于测定酵母菌数量的常用方法，它可以帮助我们更好地了解酵母菌的数量，从而更好地控制酵母菌的生长和发酵过程。
酵母菌计数方法的基本步骤如下：
1.准备样品：将酵母菌样品放入容器中，加入适量的悬浮液，搅拌均匀，使样品中的酵母菌悬浮于液体中，形成悬浮液。
2.离心分离：将悬浮液置于离心机中，进行离心分离，使酵母菌从悬浮液中分离出来，形成酵母菌沉淀。
3.洗涤：将酵母菌沉淀放入容器中，加入适量的洗涤液，搅拌均匀，使沉淀中的酵母菌被洗涤液洗涤，从而清除悬浮液中的杂质。
4.浓缩：将洗涤液中的酵母菌浓缩，使其聚集在一起，形成酵母菌浓缩液。
5.计数：将酵母菌浓缩液滴入特定的计数器中，根据计数器的显示结果，计算出酵母菌的数量。
6.计算：根据计数结果，计算出酵母菌的数量，即：
酵母菌数量（CFU/mL）=计数器显示结果×浓缩倍数
以上就是酵母菌计数方法的基本步骤，它可以帮助我们准确地测定酵母菌的数量，从而更好地控制酵母菌的生长和发酵过程。
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实验六酵母菌细胞总数的测定
一、目的要求
1.学习并掌握血球计数板计数的原理；
2.掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、实验材料
1.菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）麦芽汁培养液
2.其它：显微镜、血球计数板、手动计数器、擦镜纸、吸水纸等
三、基本原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物总数目。
血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。
中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。
计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。
血球计数板的构造如下。
图6-1 血球计数板构造
常见血球计数板的计数室有两种规格：一种是16×25型，即计数室共分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格；另一种是25×16型，即计数室先被分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。
但无论是哪一种规格的血球计数板，其计数室的小方格都是400个。
我们采用的是25×16型。
计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。
计算公式如下：
1ml菌液中总菌数＝5×104 A·B
A为5个中方格中的总菌数，B为稀释倍数
四、操作步骤
1.菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适当的菌悬液。
2.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬
液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细作用自动进入计数室（注意取样前要摇
匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生）。
3.找计数室：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找
到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数（注意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清晰）。
4.显微镜计数：取左上、右上、左下、右下和中央5个中方格进行计数。
位于中方格边线
上的菌体一般只计上边和右边线上的（或只计左边和下边线上的）。
如遇到酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半以上时，即作为两个菌体计数。
计数一个样品要从上下两个计数室中得到的平均数值来计算样品的含菌量。
5.清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗
刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。
镜检，观察计数室内是否有残留菌体或其它沉淀物。
若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、实验内容
按上述方法及步骤测定所给酿酒酵母培养液的细胞浓度。
六、实验报告
2.根据你的体会，说说用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误
差，力求准确？
3.能否用血球计数板在油镜下对细菌进行计数？为什么？。