植物细胞悬浮培养技术

植物细胞悬浮培养技术

一、基本原理

利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。

一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。

在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。

二、器材

超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子

三、操作步骤

1．配制培养基

按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。

2．水稻种子的消毒

（1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。

（2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。

（3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。

（4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。

3. 接种

在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。

4．悬浮培养的开始：

当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。

5．悬浮培养物的保持

进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞

生长速度有关，因此当发现培养瓶中培养物密度较大时，应及时用无菌的吸管吸取部分培养物到一新的50mL 培养基中继续培养。同时还要及时淘汰一些大的组织团块和黄褐色的坏死组织。一般每隔4～7d 就要继代一次。

植物组织培养技术

2011-05-08 19:21

第五章细胞培养

教学目的：掌握植物单细胞培养与细胞悬浮培养的方法和技术，熟悉细胞培养的影响因素，了解细胞培养的应用。

教学重点：1、单细胞培养的方法与技术；

2、细胞悬浮培养的方法与技术；

3、悬浮细胞的同步化技术。

教学难点：细胞培养的影响因素及其生长调控。

教学内容：

1、植物细胞培养：指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其繁殖的技术。

2、植物细胞培养的类型：

（1）根据培养规模：分为小规模培养和大批量培养；

（2）根据培养方式：分为悬浮培养、平板培养和看护培养；

（3）根据要求的产物不同：分为诱变的细胞培养和生产次生代谢物的细胞培养。

第一节单细胞培养

意义：在进行细胞株（种子细胞）的选择以及一些需要对细胞活动跟踪观察的情况下必须进行真正意义上的单细胞培养。

一、单细胞的分离：

1、由培养组织中分离单细胞：

（1）松散的愈伤组织：通过液体振荡培养、分离过筛获得，最常用；

（2）幼胚、幼苗等：通过破碎、酶解等方法获得。

2、由完整植物器官分离单细胞：

（1）机械破碎法：刀刮或研碎，如叶肉细胞

特点：细胞不受酶毒害，无质壁分离，生活力强，但应用不普遍，仅适用于排列松散的植物组织。

（2）酶解法：果胶酶、纤维素酶

特点：可获得大量游离细胞，但必须对细胞给予渗透压保护。

（3）化学方法：秋水仙素

二、单细胞培养的方法：

1、看护培养法：

（1）方法：在固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织，上放一小片滤纸（一般放置过夜），滤纸上接种细胞悬浮液，待细胞长出微小细胞团后直接转至琼脂培养基上让其迅速生长，即可获得单细胞无性系。

（2）特点：操作简便，易于成功，但不能在显微镜下观察。

2、微室培养：便于观察

（1）方法：采用载玻片和盖玻片用石蜡油或其它物质密封做成微室进行细胞悬浮液的培养，待细胞团长至适当大小时转入新鲜半固体培养基上继续培养。

（2）特点：便于显微观察记录，但营养液容易变干，需及时转接。

3、平板培养法：应用最广泛

（1）平板培养：指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。

（2）方法：将琼脂或琼脂糖培养基冷却至35℃左右（不凝固），与细胞悬浮液混合后进行植板（厚度约1mm），使细胞被包埋在固体培养基中形成一个平板，培养于25℃、黑暗的条件下。

（3）特点：筛选效率高、筛选量大、操作简单，且便于定位观察。

（4）效果：一般用植板率衡量

植板率：指能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。