赖氨酸发酵工艺学

• ②ASA脱氢酶
• ③DDP合酶 • ④DDP还原酶 • ⑤二氨基庚二酸脱羧酶
L,L – α, ε –二氨基庚二酸
⑤
L-赖氨酸
第二节 赖氨酸的代谢机制
• 3C6H12O6+4NH3+4O2→2C6H14O2N2+6CO2+10H2O
• 180
146
• 2×146/（3×180）×100%=54.1%
• 1891年，Fisher和Drechsel分别得到纯 的赖氨酸化合物。并并命名为赖氨酸。
• 1902年， Fisher确定了赖氨酸的组成。
• 随后，赖氨酸的生产一直采用提取法， 由于工艺复杂，成本较高，限制了赖氨 酸的使用。
• 1960年，发酵法在日本诞生，使其产量 大幅度上升。
• 1977年，化学合成与酶法结合生产赖氨 酸在日本诞生。
⑤
L-赖氨酸
L-异亮氨酸
• ⑥ 高丝氨酸脱氢酶；⑦琥珀酰高丝氨酸合酶； • ⑧高丝氨酸激酶；⑨苏氨酸脱氨酶
苏氨酸浓度对赖氨酸生成的影响
S-20（Thrs Mets) H1013（Hse– ) FA-3-115（AECr )
赖 氨 酸 产 量
苏氨酸浓度
草酰乙酸生成的途径
葡萄糖
丙酮酸
TCA
草酰乙酸
天冬氨酸
– 使高丝氨酸脱氢酶缺失，切断通向苏氨酸 和蛋氨酸的代谢流。通过控制培养液中的 高丝氨酸（或苏氨酸+蛋氨酸）亚适量， 控制苏氨酸浓度，接触协同反馈抑制。
– 实例：黄色短杆菌H1013，积累赖氨酸达 42g/L
第二节 赖氨酸的代谢机制
• ③抗AEC突变株 • AEC：S-（2-氨基乙基）-L-半光氨酸，为赖
• 赖氨酸在食品添加剂和营养补剂中是最 重要的一种氨基酸。
– 赖氨酸是人体必需的八种氨基酸之一（Lys、 Met、Ile、Lue、Thr、Val、Phe、Trp）。
– 赖氨酸是唯一的只有L型光学异构体才能被 有效利用的氨基酸。
– 在谷类蛋白中，赖氨酸是第一限制氨基酸。
பைடு நூலகம்
第二节 赖氨酸的代谢机制
• 一、赖氨酸的代谢途径
– 降低高丝氨酸脱氢酶的活性，使代谢流转向优先 合成赖氨酸。当高丝氨酸脱氢酶活力低，所合成 的苏氨酸少，不足以与赖氨酸共同对天冬氨酸激 酶产生协同反馈抑制作用。
– 实例：黄色短杆菌No.2247，其高丝氨酸脱氢酶 的活力仅为野生菌的1/30，可积累赖氨酸25g/L。
第二节 赖氨酸的代谢机制
• ②高丝氨酸缺陷型
型的菌株，产量会大幅提高。
不同赖氨酸产生菌产酸能力比较
菌种 谷氨酸棒杆菌
黄色短杆菌 黄色短杆菌 乳糖发酵短杆菌 黄色短杆菌 钝齿棒杆菌
遗传特性 Hse–
Thrs +Mets AECr AECr
AECr+ Hse– AECr+ Hse–
赖氨酸产量 13g/L 25g/L 32g/L 29g/L 55g/L 50g/L
• ⑦温度敏感性突变株 – 利用温度控制某些与赖氨酸代谢有关的氨 基酸的生成。
第二节 赖氨酸的代谢机制
• 真菌中合成赖氨酸的α-氨基已 二酸途径没有分支途径，其代谢 机制与细菌完全不同，无法用调 解体系中的其他代谢产物来控制 代谢，也就是不存在用营养缺陷 型菌来解决控制问题。
• 目前，尚无用真菌为菌种工业化 生产赖氨酸，仅限于生产高赖氨 酸饲料酵母。
• 赖氨酸产品一般以盐酸盐的形式存在，因此赖氨 酸盐酸盐对糖的理论收率为67.6%。
第二节 赖氨酸的代谢机制
• 二 代谢调解机制 • 微生物体内的赖氨酸代谢调解机制具有
多样性的特征。 • 大肠杆菌、枯草杆菌等的赖氨酸调解十
分复杂。 • 黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵
短杆菌等的赖氨酸调解机制相对简单。
第二节 赖氨酸的代谢机制
• 1、黄色短杆菌的赖氨酸调解机制
– 赖氨酸在天冬氨酸系氨基酸中不是优先合成，菌 体完成蛋氨酸、异亮氨酸、苏氨酸的合成后才会 合成赖氨酸。
– AK受到来自苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制。
• 2、乳酸发酵短杆菌的赖氨酸调解机制
– 除了前述二条外还存在代谢互锁，其DDP合成酶 的合成受到亮氨酸的阻遏。
– 代谢互锁(Metabolic interlock)：某一种氨基酸的 生物合成途径受到其他一种完全无关的氨基酸的 控制。一般在很高的浓度下才能显示部分抑制或 阻遏作用。
第二节 赖氨酸的代谢机制
• 代谢机制的改变： – 优先合成的转换或者切断代谢支路，并解 除苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制。
• 3、选育赖氨酸产生菌 • ①高丝氨酸渗漏缺陷型
• ⑤其他调解
增加前体物的合成和阻塞副产物生成
➢ 选育丙氨酸缺陷型
丙酮酸
草酰乙酸
天冬氨酸
转氨酶
丙氨酸
赖氨酸
第二节 赖氨酸的代谢机制
选育抗天冬氨酸结构类似物突变株 ➢ 在黄色短杆菌中，天冬氨酸对磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶有反馈抑制作用，在α-酮戊 二酸存在下，抑制作用增强。
选育适宜的CO2固定化反应酶/TCA循环酶活 性比的突变株
赖氨酸发酵
第一节、赖氨酸简介
• 化学名称：2，6-二氨基己酸
• 分子式：C6H14O2N2 • 分子量：146
• 结构式：有D型和L型两种消旋体
COOH H2N-C-H (CH2)3 CH2NH2
• 赖氨酸广泛存在于动植物蛋白中，以 干酪素中含量最高。
• 1889年，Drechsel得到赖氨酸和精氨酸 的混合物。
氨酸的结构类似物
– 通过诱变使天冬氨酸激酶编码的结构基因突变， 使天冬氨酸激酶对赖氨酸或其类似物不敏感，即 使在过量存在苏氨酸时，该酶的活性也不受影响。 可以解决应用营养缺陷型和渗漏缺陷型生产赖氨 酸时，产率受所要求物质影响过大，生产不稳定 的问题。
– 实例：黄色短杆菌FA-I-23，可积累赖氨酸32g/L • 单纯抗性菌产量一般不高，而兼有营养缺陷
草酰乙酸的获得途径有两条。 ✓ 使菌体的碳代谢以途径二为主，赖氨酸的 产量就能大大提高。 ✓ 实例：乳糖发酵短杆菌AJ11204(AECr+MLr+Ala– +Fps),赖氨酸积累量达到70g/L
第二节 赖氨酸的代谢机制
• ⑥细胞膜渗透性的影响 –乳糖发酵短杆菌，黄色短杆菌等可以通过 细胞膜排出。 – 大肠杆菌的AEC突变株不能产赖氨酸，估 计是没有解决赖氨酸从细胞膜透过性的问 题。 – 酵母产生的赖氨酸也很难透过细胞膜，在 胞内会有适度积累。
葡萄糖
丙酮酸
CO2固 定化反
应
草酰乙酸
天冬氨酸
途径一反应式：
2C6H12O6+2NH3+1.5O2+7NAD→C6H14O2N2+6CO2+H2O+7NADH2
途径二反应式
C6H12O6+2NH3+2NADH2→C6H14O2N2+4H2O+2NAD
• 赖氨酸发酵过程中的溶氧控制；生物素的 影响；乙酸的影响；流加糖的影响
黄色短杆菌的赖氨酸代谢调解机制
天冬氨酸
①
天冬氨酰磷酸
⑥
②
高丝氨酸 天冬氨酸-β-半醛（ASA)
⑧
⑦
③
2,3 -二氢吡啶-2,6-二羧酸（DDP)
琥珀酰高丝氨酸
④
L-苏氨酸
Δ-呱啶-2,6-二羧酸
⑨
L-蛋氨酸
L,L – α, ε –二氨基庚二酸
– 二氨基庚二酸途径，主要存在于细菌、 绿藻、原生虫、高等植物中。
–α-氨基已二酸途径，主要存在于酵 母、霉菌中。
细菌合成赖氨酸的二氨基庚二酸途径
天冬氨酸
①
天冬氨酰磷酸
②
天冬氨酸-β-半醛（ASA)
③
• ① 天冬氨酸激酶（AK）
2,3 -二氢吡啶-2,6-二羧酸（DDP)
④
Δ-呱啶-2,6-二羧酸
第二节 赖氨酸的代谢机制
• ④解除代谢互锁 • 在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸合成与亮
氨酸之间存在代谢互锁，由丙酮酸向赖 氨酸的代谢受阻，导致代谢转向丙氨酸、 缬氨酸。
– 选育亮氨酸缺陷型菌株，如(AECr+ Ala – +Leu–，赖氨酸积累量可达110g/L)
– 选育抗亮氨酸结构类似物突变株
第二节 赖氨酸的代谢机制