磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法

实验方案镧铈对铜胁迫下豌豆种子萌发和生长的影响

(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发影响的显效剂量筛选

(1)浓度梯度设计：

LaCl3/ CeCl 3溶液配置：先配置1g•L-1的LaCl3/ CeCl 3溶液母液，然后将母液分别稀释成浓度为5、10、20、40，60 mg•L-1梯度浓度，调节PH（HCL/NAOH）至6.5，对照(CK)为PH调节至6.5的去离子水。

重金属Cuso4浓度的设置：10、25、50、100、200、400 mg•L-1，对照用蒸馏水。

(2)试材培养

种子预处理：选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分别用自来水和去离子水洗净，常温下晾干备用。

（3）实验设置：CK，La，Ce，Cu（共4组18个浓度57个样品）

（4）试材处理：

选取LaCl3、CeCl3和CuSO4各个梯度溶液溶液，豌豆种子经预处理后用各个梯度溶液浸没处理，对照用蒸馏水，置于25±1℃浸种24h后，将处理后种子均匀排列在直径9cm、垫有2层滤纸的培养皿中，每处理加入一定量水培养（以没过种子2/3为标准），每处理3皿重复，每皿20粒。

指标测定方法：

种子发芽第三天测α—淀粉酶，第四天测发芽势，前三天测发芽指数和发芽率，第五天测量根长、茎长，第六天测根系活力、叶绿素含量、可溶性蛋白质、可溶性糖、SOD、POD、CA T、MDA.

2．La(Ⅲ)和Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发及保护酶的影响

(1)试材培养

种子预处理：选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分别用自来水和去离子水洗净，常温下晾干备用。

（2）实验设置：在上一步骤中分别筛选出LaCl3、CeCl3的低剂量、适宜剂量、高剂量三个有效浓度和CuSO4的一个有效浓度，分别记为A1，A2，A3；B1，B2，B3；C。

（3）实验步骤：有以下几组：

A+C:A1+C、A2+C、A3+C

B+C:B1+C、B2+C、B3+C

A+B+C：A1+B1+C 、A1+B2+C 、A1+B3+C、A2+B1+C、A2+B2+C、A2+B3+C、A3+B1+C 、A3+B2+C、A3+B3+C

酸盐缓冲液（PBS）配制方法

磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M）

pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml

7.0 61.0 39.0

7.7 89.5 10.5

7.8 91.5 8.5

Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/L

Na2HPO4·12 H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/L

NaH2PO4·H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/L

NaH2PO4·2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L

0.01M PBS

PBS (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, and 8 mM K2HPO4，pH 7.2) PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L

称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L。保存于4℃冰箱中即可。

母液的配制：

0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水

0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水

各种浓度PB(pH=7.4)的配制：

先配0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4， 81ml 0.2mol/L 的

Na2HPO4, 即可。

然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如：

0.1M PB（PH=7.4）：取500ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。

0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。

0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至1000ml 即可。

若需要NaCl的话，加入NaCl 至0.9%（g/100ml）即可。

另：其它各种另PH值的0.2M PB（100ml)配方：

pH 0.2M NaH2PO4（ml）0.2M Na2HPO4（ml）

7.0 38 62

7.8 8.5 91.5

0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存存于室温或4℃冰箱中。

需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。如果是用于免疫组化的话，则需要在配置的时候分别加入100 u/ml青霉素和链霉素之后再调PH、定容、灭菌消毒。 PH 7.6 7.4 7.2 7.0

H2O 1000 1000 1000 1000

NaCl 8.5 8.5 8.5 8.5

Na2HPO4 2.2 2.2 2.2 2.2

NaH2PO4 0.1 0.2 0.3 0.4

PBS缓冲液

称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。

0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)的配制：

甲液：0.05mol/L Na2HPO4溶液：称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸馏水至1000ml ;

乙液：0.05mol/L KH2P04溶液: 称取磷酸二氢钾, 9.07g 6.803g,加蒸馏水至1000m1。

将甲乙液分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表:

pH 甲液ml 乙液mI