中文论文集-离子色谱原理综述

一、 离子色谱原理综述

聚合物基质弱阳离子交换整体柱的制备及其色谱性能研究

丁明玉，彭虹，郑睿

（清华大学化学系，北京，100084）

摘要：在0.32mm的弹性石英毛细管内，制备了聚合物基质的毛细管整体柱。优化了试剂配比、反应时间等合成条件，制备出了大孔径且孔径均一的甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱。用亚胺基乙二酸对整体柱进行改性，得到了弱酸型阳离子交换整体柱。考察了改性时间、改性温度和pH值与离子容量的关系，并将该整体柱用于蛋白质的分离。

关键词：离子色谱，毛细管整体柱，甲基丙烯酸，弱阳离子交换

毛细管整体柱微柱液相色谱在生物物质分离以及与质谱等仪器的联用上显示出了优越的性能，因而成为近年色谱的一个热点研究领域。目前有关离子色谱整体柱的报道大多是在常规尺寸（4.6mm ID）的商品无机硅胶整体柱上进行修饰，用于无机阴、阳离子的分离分析。用于离子性成分分离的毛细管离子色谱整体柱的研究还很少。Yuji等[1]报道在250μm内径毛细管内原位聚合有机整体柱，分离了一价和二价阳离子。Haddad等[2]在250μm石英毛细管柱内制备聚合物整体基质后，在其表面涂敷季铵功能化乳胶颗粒，30s内分离了无机离子和有机酸。以往报道的弱阳离子交换整体柱通常采用两步法改性，即先用乙二胺处理，再和氯乙酸反应。我们利用亚胺基乙二酸进行一步改性，简化了合成步骤。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

加厚0.32mm ID（0.69mm OD）弹性石英毛细管柱(河北省永年锐丰色谱器件有限公司),KYKY 2800 扫描电镜(中国科学院北京科学仪器研制中心),AutoPore IV 9510汞渗透测孔仪(美国Micromeritics Inc.)。

甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，东京化成工业株式会社），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，Acros Organics，USA），γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS，东京化成工业株式会社）；正丙醇和1，4-丁二醇（北京市化学试剂三厂）；偶氮二异丁腈（AIBN，天津福辰化学试剂厂），使用前重结晶出去杂质；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 毛细管壁预处理

对石英毛细管壁做预处理，主要是引入双官能团试剂γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）。γ-MAPS的一端含有烷氧基团，与石英毛细管壁的硅羟基反应，另一端含有双键，在下一步单体聚合时参与聚合反应。毛细管壁预处理的具体步骤如下：利用水泵的负压将0.1mol/L的氢氧化钠、水、丙酮依次通过毛细管；通入氮气，吹干毛细管；将30%的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷/丙酮溶液充满处理后的毛细管，密封过夜；用丙酮冲洗毛细管，氮气吹干，备用。

1.3 聚合物整体固定相的制备

将单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（0.90mL）、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(0.30mL)和三元致孔剂（正丙醇1.05mL、1，4-丁二醇0.60mL、水0.15mL）溶液混合后，加入12mgAIBN，超声震荡5min，使其充分溶解，然后通氮气除氧3min。溶解后，立即将反应混合溶液注入经双官能团试剂处理过的毛细管中，并用硅橡胶将两端密封，放入60ºC恒温水浴中连续加热24小时，通过热引发在柱管中原位聚合得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱。反应完成后，将整体柱连接在高压液相色谱泵上，用乙醇和水冲洗毛细管，去除致孔剂、未反应单体及其它可溶性化合物。

配制50mL 2mol/L的Na2CO3缓冲液，加入5g亚胺基乙二酸和2g NaCl，超声震荡使其充分溶解，然后用NaOH调节pH至11。利用水泵负压将该溶液以10μL/min流速循环流过甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱，保持70℃恒温反应12 h。反应完成后，用水冲洗毛细管，再用0.1mol/L的NaOH溶液以0.05ml/min流速冲洗整体柱，整体柱上即引入羧酸基阳离子交换基团。

2. 结果与讨论

2.1 毛细管内壁予处理

虽有文献报道[3]可在未处理的毛细管中制备整体固定相，并在连续床层未与毛细管内壁键合的情况下直接进行色谱实验。我们对比了石英毛细管内壁经过预处理和未经预处理的整体柱的稳定性。结果显示，在相同流速和柱压下，未经预处理的整体柱的连续床层发生移动，整体柱基质被冲出管外；经过预处理的整体柱则表现出良好的稳定性。因此本实验中毛细管均做了预处理。

2.2 温度对聚合物孔结构的影响

实验结果表明，随着聚合温度的升高，整体柱材料的最大孔径变小。首先，温度影响引发剂的分解速度，反应温度越高，引发剂形成的自由基数目越多，形成的核的数目也越多，使得每个核的尺寸减小，而大孔材料是由相互交联的小球组成的，所以小球的尺寸决定了小球间空隙的尺寸。其次，高温下形成的小孔聚合物质紧密，能够承受较高的压力。

2.3 致孔剂组成对聚合物孔结构的影响

随着致孔剂/单体的比值增加，整体柱的渗透性增加。致孔剂通过在反应的早期影响聚合物链在反应溶液中的溶解度来控制整体柱的孔隙性质。

致孔剂经常是由多种有机溶剂组成的。当致孔剂中作为聚合物良溶剂（本实验中的正丙醇）的溶剂的含量降低，由于聚合物在良溶剂中溶解度较高，因而形成的“核”的数量也更少，所得聚合物微球粒径增加，聚合过程中相分离发生较早，孔径也相对增大。

2.4 交联剂含量对聚合物孔结构的影响

实验结果表明，交联剂含量增加，孔径变小。交联剂含量增加，其与单体之间的聚合度相应增加，在聚合初期出现高度交联的聚合物，从混合溶液中析出，使得相分离提前。增加交联剂含量会使得核的交联度增加，并且会影响核随单体膨胀，因此最终形成的核较小。先形成的小球与后形成的核之间虽然仍有吸附作用，但不会发生共聚，形成的多孔结构由较小的“簇”组成，因此孔径较小。

2.5 离子交换基团的导入与柱性能评价

通过实验优化确定弱阳离子交换整体柱的最佳改性条件为：改性温度75ºC，改性时间24h，改性pH值为12。实验表明：制备的多根整体柱之间的重复性以及同一整体柱多次进样时的重复性都很好。

利用前沿色谱分析法研究了溶菌酶溶液浓度、流速及缓冲盐溶液浓度等因素对分离时间、突破曲线形态等色谱性能的影响，实验结果显示制备的弱阳离子交换整体柱具有优异的动力学传质特性，而且能够在高流速、低样品消耗量的条件下实现蛋白质的快速分离。 2.6 蛋白质的分离

在生物大分子的离子交换色谱分析分离中，控制流动相的pH值非常重要。流动相pH 的变化不但会改变蛋白质的净电荷，还会影响配体的电离程度，从而影响蛋白质在离子交换色谱上的保留。使用离子交换色谱分离蛋白质时，通常流动相的pH高于或低于pI一个单位。实验表明，流动相pH值偏离pI越多，蛋白质的保留值就越大。

本文采用10mmol/L Na2HPO4-HCl缓冲体系，pH控制在6。在长度为1.5cm长的弱阳离子交换毛细管整体柱上快速分离了三种蛋白质，色谱图如图1所示。