《噬菌体展示技术》课件
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噬菌体展示技术和其应用ppt课件
2024/3/30
25
应用举例：
部分做过的工作
2024/3/30
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
2024/3/30
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
2024/3/30
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
2024/3/30
34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
演示版抗体噬菌体展示技术.ppt
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介 ppt课件
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融合蛋白的表达是低价的，只有不到10％的噬菌体可以表 达融合基因，其余噬菌体展示的均是野生型噬菌体的p3蛋PPT课件
36
淘筛—亲和淘筛
1.噬菌体肽库与靶分子相互作用
2.洗涤去未结合的或是非特异性结合 的噬菌体
3.将特异性结合的噬菌体洗脱下来
M13噬菌体遗传图谱和结构示意图
PPT课件
17
3.6.2次要衣壳蛋白PⅢ展示系统
次要衣壳蛋白PⅢ
PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位 于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染 大肠杆菌所必须的。每个病毒颗粒 都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结 构上可分为N1、N2和CT 3个功能区 域，这3个功能区域由两段富含甘氨 酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1 和N2与噬菌体吸附大肠杆菌菌毛及 穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体 外壳蛋白结构的一部分，并将整个 PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体 的一端。
PPT课件
18
PⅢ展示系统，PⅢ有2个位点可供外源序列插入， 当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ) 和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体 仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的 CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌 体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。 PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌 体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融 合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。
PPT课件
12
3.3 噬菌体侵染大肠杆菌
PPT课件
13
3.4 λ噬菌体展示系统
（1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分。PV有
两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或 替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白 质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表 明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。 （2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。当突变 型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况 下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源 多肽在空间上是可以接近的。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融 合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于 展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
噬菌体课件
将待检细菌的噬菌体与样品混 合，37度培养1h，仅待检细菌 被噬菌体吸附侵染
加入灭病毒剂灭活5min，灭活 所有未侵染宿主细胞的噬菌体；
将辅助菌加入到样品中，中和 灭病毒剂，并立刻混合后倒入 琼脂平板进行培养 释放出来的子代噬菌体裂解辅 助菌；平板中形成清晰可见的 噬菌斑。
3.1生物扩增法
• 原理：
当样品中的待检细菌数目较少时，将不利于 噬菌斑的形成，影响检测结果。如果加入能够被 噬菌体裂解的辅助菌，被侵染的待检细菌裂解释 放出来的子代噬菌体会立刻继续吸附裂解辅助菌 ，从而形成清晰的噬菌斑。因此根据噬菌斑的数 目检测样品中病原菌的含量。
宿主菌
含有报告基 因的噬菌体
常用的报告基因有：
with high-density arrays • 2001 Automated phage display
selection
2.2 噬菌体展示技术的原理
以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白 的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因 的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新 组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达 有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量 富集，从而获得目的多肽或蛋白质。
2.RNA噬菌体：
线状单链RNA（多数） 线状双链RNA（少数）
1.6 噬菌体分类
1.6 噬菌体分类
根据噬菌体与宿主的关系： （1） 烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能
够使宿主细胞裂解的噬菌体。 （2）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其
2.7 噬菌体抗体库的分类
(1)根据 免疫抗体库
插入基
因片段 非免疫抗体库 天然抗体库
的来源
半合成抗体库
噬菌体展示技术及其应用.ppt
噬菌体展示的基本原理
在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源 基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒 蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可 保持分子，采用适当的淘洗方法（亲 和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤）多 肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码 基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌 体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现 型）和编码基因（基因型）之间完美地结合 起来，为生物科学提供高效而实用的研究手 段。
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝 状噬菌体表面蛋白g 融合展示在噬菌体表面, 建立了噬菌体展示随机肽库。
Scott J K, Smit h GP. Searching for peptide ligands wit h an epitope library. Science , 1990 ,249 :386.
1985年Smith首次通过基因工程的手段,将 外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表 达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示 在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。
Smith GP. Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface . Science ,1985 ,228 :1315 - 1317.
Lytic phages specifically kill pathogenic bacteria as an alternative to antibiotics
Example of a successful phage therapy treatment.
接受过噬菌体治疗的病人对细菌和病 毒感染的抵抗力增强, 噬菌体能上调感染 病人的免疫应答。噬菌体治疗能改变血清 α肿瘤坏死因子(TNF-α) 水平, 体外加入 噬菌体能提高血细胞培养物中的TNF-α和 白细胞介素6水平。IL-6 涉及Th2 型应答, 对诱导B细胞分化成抗体形成细胞特别重要。 总之, 这些结果表明噬菌体能作为细胞和 体液免疫的天然佐剂。
抗体噬菌体展示技术ppt课件
polystryrene surfaces, or on columns, or is .
used in solution as biotinylated antigen and
Advantages of Phage Display for
Recombinant Antibody Selection
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
.
Contents
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
used in solution as biotinylated antigen and
Advantages of Phage Display for
Recombinant Antibody Selection
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ pIII protein is essential for infection of
bacteria
▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage
and special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
Antibody Phage Display
Meiling Xiong 20180629
.
Contents
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
噬菌体展示技术的原理及应用ppt课件
完整版ppt课件
32
5. 酶： 例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类， 等等
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33
6. 底物与抑制剂： 主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
完整版ppt课件
34
7. 信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，
如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一 个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促 生素、 α-bungarotoxin， 和一些大蛋白分子 中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。 从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与
2
噬菌体展示技术是将
各种多肽或蛋白质以融合
蛋白的形式表达并展示在
噬菌体表面，同时将其遗
传密码包含于噬菌体内部，
这使得蛋白质的功能与其
基因密码有机的连结在一
起。
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3
选择方法： 淘选（Panning)
而不是 筛选（Screening)
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4
非展示系统
展示系统
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应用前景:
单克隆抗体 杂交瘤技术
杂交瘤 ~103 几个月 繁杂
噬菌体抗体 展示技术
细菌 107109 几周 相对简
必须
高 有限 再克隆
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有限
可避免
+ 低 无限 直接
28
不可估
二、噬菌体展示技术的应用现状
1. 抗体：
2.
抗狂犬病毒的单链抗体，
抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，
此抗体可专一性杀死被HIV-1感染
完整版ppt课件
13
•
•
• 毒）
• 表面展示系统 • • •
噬菌体展示技术PPT精选文档
噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位 置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽 或蛋白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
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噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
[课件]噬菌体展示及酵母展示PPT
![[课件]噬菌体展示及酵母展示PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/5af84c69c850ad02de804179.png)
丝状噬菌体属于单链环状DNA病毒
• 主要外壳蛋白PVIII和4种次要外壳蛋白PIII、PVI、 PIX、PⅦ。PIII与PVIII蛋白一般主要用作展示外 源蛋白的锚定蛋白。 • PIII蛋白位于病毒颗粒的尾端，有3．5个拷贝，其 在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，其 功能是在噬菌体感染大肠杆菌时与F菌毛结合，使 噬菌体能吸附到细菌上。 • PIII蛋白展示系统最突出的特点是对外源多肽或蛋 白质的大小无严格限制，可用于生物大分子的表 达和功能分析等方面研究。PIII的拷贝数只有3．5 个，故可用于选择高亲和力的配体，但在免疫学 和生物疫苗研制中受到了限制。
酵母表面展示系统
• 酵母表面展示系统中研究较多的宿主主要 是酿酒酵母。
• ①酵母是一种理想的真核生物表达载体宿主，其 基因的表达调控及蛋白质的翻译后加工、分泌机 制比较接近高等真核生物。可以表达多种不同大的展示 有独特的优越性； • ②酵母颗粒大，可利用流式细胞仪进行方便的筛 选和分离； • ③酵母展示的外源蛋白可紧密锚定在细胞壁上， 能耐受SDS的抽提； • ④酵母遗传学操作简单，具有发酵性，生长快， 并且安全无毒，可用于基因治疗及开发口服疫苗 等。
噬菌体展示技术的局限
性使噬菌体扩增中会不可避免地 造成20种氨基酸合成具有明显倾倾向性； • ④大肠杆菌的生物合成系统本身的局限性，不能 进行蛋白质的翻译后修饰； • ⑤展示的多肽或蛋白分子量不能太大，否则会影 响噬菌体的装配与感染。
• PVIII是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于 噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬 菌体外，每个病毒颗粒有2700个左右PVIII 拷贝。 • 由于PVIll分子较小，只能融合较小的外源 肽段。但优点在于它的拷贝数多，因此该 系统一般用于筛选亲和力较低的配体，在 疫苗开发上具有潜在的应用价值。
抗体噬菌体展示技术(课堂PPT)
▪ Easy isolation and expression of the cloned gene in a bacterial
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
host.
▪ Excellent potential to further improve binding properties of the
selected antibody by protein engineering techniques.
▪ Amber codon TAG: supE strains (glutamic acid
codon), non-suppressor strains (stop codon)
▪ Protease cleavage site
▪ Promoter
▪ Signal peptides: phage protein translocation, crucial
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most
6
▪ More efficiently than through conventional hybridoma system.
▪ Cheaper to produce recombinant antibodies using bacteria,
rather than mammalian cell line.
polystryrene surfaces, or on columns, or is used in solution as biotinylated antigen and
噬菌体展示技术
16
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
17
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合旳噬菌体
18
第四步：洗脱—将特异性结合旳噬菌体洗脱下来
19
第五步：扩增—将洗脱旳噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
背面旳筛选逐渐加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合旳克隆序列
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及处理方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证明外源DNA能够插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
• 有供筛选旳抗生素标识基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要旳全部蛋白和酶。
13
筛选旳措施－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简朴直接。 缺陷：偶尔会造成配体结合位点难以进入 可能是因为分子旳立体封阻 或者是靶分子表面旳部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体 复合物。 优点：克服直接包被旳出现旳问题 缺陷：轻易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合旳克隆。
23
谢谢
24
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 构成，5个拷贝，位于噬菌 体旳尾部。
2. 由三个功能区构成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
17
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合旳噬菌体
18
第四步：洗脱—将特异性结合旳噬菌体洗脱下来
19
第五步：扩增—将洗脱旳噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
背面旳筛选逐渐加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合旳克隆序列
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及处理方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证明外源DNA能够插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
• 有供筛选旳抗生素标识基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要旳全部蛋白和酶。
13
筛选旳措施－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简朴直接。 缺陷：偶尔会造成配体结合位点难以进入 可能是因为分子旳立体封阻 或者是靶分子表面旳部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体 复合物。 优点：克服直接包被旳出现旳问题 缺陷：轻易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合旳克隆。
23
谢谢
24
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 构成，5个拷贝，位于噬菌 体旳尾部。
2. 由三个功能区构成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
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《噬菌体展示技术》
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噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互作用
• 洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱下来，并扩增， 用扩增产物进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
《噬菌体展示技术》
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噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合 Bind to Streptavidin coated magnetic bead
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
《噬菌体展示技术》
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，没有其他噬菌体
基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
• 有供筛选的抗生素标记基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有 蛋白和酶。
《噬菌体展示技术》
噬菌体展示系统
Phage on display
《噬菌体展示技术》
1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
《噬菌体展示技术》
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上, 外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋 白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。
《噬菌体展示技术》
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噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M13 •烈性噬菌体---T7
《噬菌体展示技术》
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噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
《噬菌体展示技术》
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淘选过程中常见问题及解决方案
《噬菌体展示技术》
23
谢谢
《噬菌体展示技术》
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合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
《噬菌体展示技术》
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成：
• N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上 的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。
biotin -antigen
《噬菌体展示技术》
16
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
《噬菌体展示技术》
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第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合的噬菌体
《噬菌体展示技术》
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第四步：洗脱—将特异性结合的噬菌体洗脱下来
《噬菌体展示技术》
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第五步：扩增—将洗脱的噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
• N2 受体结合区：负责结合F菌毛。
• CT 疏水区：组装前黏附在细菌内 膜上；与噬菌体组装终止有关。
• G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程 中，增白 pVIII
• 每子个病毒含约2700个拷贝， 约10%能有效地融合外源多肽。 以pIII融合子方式表达的是单 价的，而以pVIII融合子方式表 达的则是多价的。
后面的筛选逐步加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合的克隆序列
感染 和扩增
E.coli
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噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
• 这种多价pVIII展示所增加的亲 和力有利于筛选到亲和力非常 低的配体，而单价pIII展示则 将筛选限制在具有较高亲和力 的配体上。
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pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。 • pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。 • 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pI
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M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
筛选到的分子亲和力相 对低 高拷贝数增加了抗原性 应用于肽库
pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
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噬菌体展示技术流程
《噬菌体展示技术》
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噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
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《噬菌体展示技术》
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噬菌体质粒-phagemid
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筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。