蛋白质组学期末答案

2013——2014第一学期蛋白质组学试题
一名词解释（6分题，共30分）
1. 基因组：生物细胞中的全部基因。

蛋白质组：生物细胞中由全套基因编码控制的蛋白质
2. 基因组学：是研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。

提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。

蛋白质组学：研究蛋白质组中蛋白质表达与功能变化的科学。

可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。

3. 质谱：被分析样品经离子化，成为分子离子及其碎片，后利用离子在电场或磁场中的运动性质，把离子按其质量与所带电荷比（m/z）的大小依次排列并记录下来成为质量波谱，称为质谱。

质谱分析：是通过对样品分子的离子质量和强度进行测定来分析样品成分和结构的一种分析方法。

4. MALDI与ESI
MALDI：即基质辅助激光解吸电离，在波长为775-1250nm的真空紫外光辐射下光致电离和解吸作用使生物分子电离为分子离子和含有结构信息的碎片。

ESI：即电喷雾电离，采用强静电场（3-5kV），以喷雾形式使液体样品形成高度荷电的雾状小液滴，小液滴经过反复的溶剂挥发-液
滴分裂后，产生多种质子化离子。

两者均属于软电离技术。

5. SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠（SDS）构成SDS-PAGE系统用于分离蛋白质，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。

2-D：即双向凝胶电泳，根据蛋白质的等电点和分子质量的差异使之在二相平面上分开
是目前使用最广泛的蛋白质组学分离技术。

二简答题（6分题，共30分）
1 简述CHIP技术的原理
被剪切，与所研究蛋白相关的DNA片断被选择性免疫沉淀；相关DNA 片断被纯化，顺序被测定。

2 简述ICAT技术的原理
ICATS是一种蛋白质组学定量研究常见方法，ICAT试剂结构，包括3个部分，SH反应集团， biotin标签，同位素
其原理是来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。

3 蛋白质组学的目的是什么
在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律。

具体指：阐明生命细胞代谢、信号传导和调控网络的组织结构和动力学，并理解这些网络如何在病理和生理中执行和失去功能，又如何通过干预（如药物或基因）改变它们的功能。

4 简述2D电泳图像分析流程
凝胶图像的扫描，图像加工，斑点检测和定量，凝胶配比，数据分析，数据呈递，2-DE数据库的建立
5简述EMSA技术的原理
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。

这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA 探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。

DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。

同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。

在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。

竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合
蛋白的特异性。

在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

三论述题（20分题，共40分）
1 试述四种蛋白质相互作用研究方法的原理，并比较优缺点。

酵母双杂交
原理：酵母双杂交该系统由Fields 和Song[3]首先在研究真核基因转录调控时建立。

利用真核生长转录因子的两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNAbinding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)，分别与目标蛋白X 及可能与目标蛋白相互作用的蛋白Y 相连，并共同转入酵母细胞。

如果蛋白X与Y能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因。

通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用[4~5]。

优点：1. 高敏感性。

2.真实性。

检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，
在一定程度上代表细胞内的真实情况。

3.简洁性。

融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质
的繁琐步骤。

4.广泛性。

采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建
cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。

缺点：假阳性较多、转化效率偏低、存在阴性干扰
免疫共沉淀
原理：根据抗原与相应抗体的特异性结合原理在细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物。

对收集到的蛋白免疫复合物进行SDS-PAGE及蛋白质印迹分析。

优点：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

（4）灵敏度没有亲和色谱高。

噬菌体展示技术
原理：将外源肽或蛋白基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达。

优点：1.可以呈现出“靶分子—模拟位”反应的自然态
2.高通量的筛选
3.易于纯化
缺点：1. 始终需要借助于其它的分析系统 2. 细胞毒性分子和真核生物蛋白难以表达和展示；构象型表位由于不具备线性表位的“一体性”结构，所以研究难度相对增大。

蛋白质芯片技术
以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间相互作用关系。

优点：快速易行高效，所需样品量极少，有较高的信噪比，一次实验可提供大量数据
缺点：成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器，存在芯片的标准化问题，有待提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等。

2 试述四种定量蛋白质组研究方法的原理，并比较优缺点。

1，代谢标记法—15N标记法
在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。

根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。

优点：
高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%；
重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；
灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。

缺点：
（1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。

（2）由于使用的15N培养基纯度>96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。

DIGE
DIGE —双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。

优点1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量； 2：与常规银染相比灵敏度更高；
3：检测动态范围更大；
4：定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差；
5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差
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