蛋白质组学研究

近年来，我国的人类基因组研究正在 迅速开展，并取得了许多有意义的成果。 我国曾有很好基础的蛋白质领域方面的研 究，如人工合成胰岛素等。然而，蛋白质 组研究在国际上正如火如荼、轰轰烈烈， 我国则刚启动。如何抓住国际上蛋白质组 学研究刚刚启动的时机，迅速地进入到蛋 白质组学的国际前沿，是摆在我国生命科 学研究发展方向决策中的一个重要问题。
在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ 作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受 Gal4蛋白调控的GAL1序列。 这个改造过的LacZ 基因被整合到酵母染色体URA3位上。 而酵母的 GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因 子)被缺失, 从而排除了细胞内源调控因子的影响。 已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。 结果 发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的 酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性, 单独转化其中任 何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。
与基因重组、表达、序列分析的快速、自动化程 度相比，到最近为止，机体组织细胞内蛋白质的序列 分析只是实验室小规模研究项目。
随着对生物学、物理、化学及信息学的各种尖端 技术的综合应用，蛋白质组研究也正逐步变成高产量、 高精确度的分析过程。
现今，蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双 相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检 索系统等。为了保证分析过程的精确性和重复性，大 规模样品处理机器人也被应用。整个研究过程包括： 样品处理、蛋白质的分离、蛋白质丰度分析、蛋白质 鉴定等步骤。当前，蛋白质组分析虽然以双相电泳和 质谱分析为其技术基础，但离不开各种先进的数据分 析和图象分析软件及网络技术的支持。
HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵” 和“猎物”的相互作用所启动的。 大多数 双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报 道基因, 其中之一是LacZ。 这些改造后的基 因在启动子区有相同的转录激活因子结合 位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上 述的Gal4蛋白)激活。 通过这种双重或多重 选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性 现象。 其他还有针对“诱饵”或“猎物” 表达载体等所作的改进, 这里不一一详述。
网上蛋白质组学资源
由于蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术，internet 上有关蛋白质组研 究的技术支持以及蛋白质数据分析的专家系统、数据库等专门网站很多。
proteomeworks.bio-rad 蛋白质组研究技术、信息等。 proteinpathways 从新药开发角度，发现新蛋白及新作用。 可以找到蛋白质组研究相关企业、各 种仪ome）一词问世到现在， 虽然只有短短的几年时间，蛋白质组学研究却得到了 突飞猛进的发展。
2019年，悉尼大学Humphery Smith I实验室与 Williams等4家实验室合作，对至今已知最小的自我复 制生物（一种支原体）进行了蛋白质成分的大规模分 离与鉴定后，到2019年，蛋白质组研究对象已迅速扩 展到单细胞真核生物-酵母以及人体正常组织、病理 标本等。参与国家在2019年只有澳大利亚，而到2019 年时已有美国、丹麦、瑞士、英、法、日、瑞典、意、 德等10个国家加入。国际著名学府哈佛、斯坦福、耶 鲁、密执安、华盛顿大学、欧洲分子生物学实验室、 巴士德研究所、瑞士联邦工业学院等均挤身此类研究。 如今澳大利亚悉尼大学与Macquarie大学仍处领先水 平，但美欧多家实验室已奋起直追。
对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。 一 方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机 体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将 作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和 数据库。 一系列这样的二维参考图谱和数据库已 经建立并且可通过联网检索。 二维参考图谱建立 的意义在于为进一步的分析工作提供基础。 蛋白 质组分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理 条件下蛋白质组所发生的变化。 如蛋白质表达量 的变化, 翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分 析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。 关于 蛋白质组学的介绍可参阅文献［5,6］。
目前发展起来的各种双杂交系统大多是 以Fields等人建立的系统为基础的。 这些新 系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体 以及“猎物”表达载体等做了一些改进。 其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3基因。 经过改造带有 HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启 动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基 上生长。
实际上，往往是通过基因的转录、表达产生一个蛋白质 前体，在此基础上再进行加工、修饰，才成为一个具生物 活性的蛋白质。
• 这样的蛋白质还通过一系列的运输过 程，到组织细胞内适当的位置才能发挥正 常的生理作用。基因不能完全决定这样的 蛋白质后期加工、修饰以及转运定位的全 过程。而且，这些过程中的任何一个步骤 发生微细的差错即可导致机体的疾病。纽 约Rockefeller大学的细胞和分子生物学家 Günter Blobel博士就是因其“蛋白质内在的 信号分子活性，调节自身的细胞内转运和 定位”研究上的卓越成就，获得了2019年 诺贝尔医学奖和生理学奖。
细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混 合物, 蛋白质间的相互作用、相互协调是细 胞进行一切代谢活动的基础。 蛋白质间的 相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研 究所面临的问题。 研究蛋白质间的相互作 用有多种方法, 常用的如酵母双杂交系统、 亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等。 其 中, 酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用 广泛的主要方法。
单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不 能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和 AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转 录的功能。 如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与 大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得 到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并 激活转录［7］。
Fields等人的工作标志双杂交系统的正 式建立［8］。 他们以与调控SUC2基因有 关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者 与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的 AD结构域的酸性区域融合。 由DB和AD形 成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱 饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
不过，蛋白质组学为一种新生领域，目前 还处于初期发展阶段，仍有许多困难有待克服。 如双相电泳和质谱分析的灵敏度还很难将体内 微量的调节蛋白质精确分析。而这种微量调控 蛋白的精确表达在生命过程中起到关键性作用。 另外，当前质谱分析仪的价格十分昂贵，约为 DNA序列分析仪的十倍之多，严重影响了它的 普及和被广泛应用。再者，成千上万种蛋白质 间及蛋白质与其它生物大分子间的相互作用和 作用方式的复杂性同样也是蛋白质组研究所面 临的问题。
近年来人们又发现蛋白质间亦存在类似于 mRNA分子内的剪切、拼接，具有自身特有的活 动规律。这种自主性不能从其基因编码序列中预 测，而只能通过对其最终的功能蛋白进行分析。 因此说，基因虽是遗传信息的源头，而功能性蛋 白是基因功能的执行体。基因组计划的实现固然 为生物有机体全体基因序列的确定、为未来生命 科学研究奠定了坚实的基础，但是它并不能提供 认识各种生命活动直接的分子基础，其间必须研 究生命活动的执行体-蛋白质这一重要环节。蛋白 质组学（proteomics）研究即旨在解决这一问题。
基因组和蛋白质组到底有什么联系？
生命：遗传信息从DNA（基因）转变为一种被称作 mRNA的中间转载体，然后再合成各式各样的结构蛋白质和 功能蛋白质，构成一种有机体，完成生命的功能。
基因→ mRNA→蛋白质，三位一体，构成了遗传信息 的流程图，这即是传统的中心法则。
现在已经证明，一个基因并不只存在一个相应的蛋白质， 可能会有几个，甚至几十个。什么情况下会有什么样的蛋 白，这不仅决定于基因，还与机体所处的周围环境以及机 体本身的生理状态有关。并且，基因也不能直接决定一个 功能蛋白。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而 激活相应基因的转录与表达。 这个被激活 的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用 的基因称之为报道基因(reporter gene)。 通 过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判 别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质 之间是否存在相互作用。
但是也随之产生了新问题。 大量涌出的 新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码 的蛋白质有什么功能这个问题。 不仅如此, 在 细胞合成蛋白质之后, 这些蛋白质往往还要经 历翻译后的加工修饰。 也就是说, 一个基因对 应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十 种。 包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是 如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎 样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问 题远不是基因组研究所能回答得了的。 正是 在此背景下, 蛋白质组学(proteomics)应运而生。
Facility expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours
二、酵母双杂交技术及其在蛋白 质组研究中的应用
作为后基因组时代出现的新兴研究领域之一, 蛋白质组学(proteomics)正受到越来越多的关注。 蛋 白质组学的研究目标是对机体或细胞的所有蛋白质 进行鉴定和结构功能分析。 蛋白质组学的研究不局 限任何特定的方法。 高分辨率的蛋白质分离技术如 二维凝胶电泳和高效液相层析, 经典的蛋白质鉴定 方法如氨基酸序列分析等, 现代质谱技术, 基因组学 研究的各种手段, 现代计算机信息学和计算机网络 通讯技术等等, 任何可用于蛋白质研究的技术手段, 蛋白质组学都可能会采用。 它体现的是一个开放的 思维和研究方式。
2.酵母双杂交系统的建立与发展
双杂交系统的建立得力于对真核生物 调控转录起始过程的认识。 细胞起始基因 转录需要有反式转录激活因子的参与。 80 年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是 组件式的(modular), 即这些因子往往由两个 或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有 DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称 为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能 所必需的。