小鼠骨髓微核试验
实验五小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞的采集与处理
小鼠麻醉
将小鼠麻醉，并固定在 操作台上。
暴露骨髓
用消毒手术刀切开小鼠 的腿骨，暴露骨髓腔。
采集骨髓细胞
用注射器吸取生理盐水， 冲洗骨髓腔，收集骨髓
细胞。
细胞处理
将采集的骨髓细胞进行 洗涤、离心、分离等处 理，得到所需的细胞样
本。
骨髓细胞的培养与观察
细胞培养
将处理后的骨髓细胞接种在细胞 培养皿中，加入适量的细胞培养 基，在适宜的温度和湿度条件下 进行培养。
率之间存在正相关关系。
本实验为进一步研究致突变物的 致突变作用提供了有力证据，有 助于深入了解致突变物的致癌机
制。
对实验结果的理解与讨论
本实验结果表明，致突变物能够诱导小 鼠骨髓细胞微核的形成，这可能是致突 变物导致基因突变和细胞恶性转化的重 要机制之一。
实验结果还提示，致突变物的致突变作用可 能与其在体内的代谢活化有关，因此需要进 一步研究致突变物的代谢活化过程及其与微 核形成之间的关系。
实验五小鼠骨髓细胞 微核试验
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 结论与讨论
01 实验目的
了解微核试验的原理
微核试验是一种用于检测染色体畸变和DNA损伤的细胞遗传 学方法。它通过观察细胞中微核（微小的细胞核）的数量， 来评估细胞受到的遗传损伤程度。
染色体结构畸变
分析实验组和对照组的染色体结构畸变类型，如断裂、倒位、重 复等。
染色体数目畸变
观察染色体数目畸变情况，包括非整倍体、多倍体等。
畸变类型与实验条件关系
探讨不同实验条件下染色体畸变类型的差异及其与实验条件的关系。
实验结果与预期结果的比较
小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
实验三小鼠骨髓细胞微核试验
实验三小鼠骨髓细胞微核试验实验三：小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的本实验旨在通过观察小鼠骨髓细胞微核率的变化，了解并评估骨髓细胞受到的损伤程度，为进一步研究生物样品中的毒性物质及其潜在危害提供依据。
二、实验原理微核试验是一种检测染色体畸变的快速、敏感的方法，常用于评价各种因素对机体的遗传毒性。
微核是由染色体的片段或整个染色体在细胞分裂后期或末期未能进入子代细胞核而形成的，因此微核率的高低可反映细胞染色体受损的程度。
骨髓细胞微核试验常用于检测体内外接触毒物的程度及检测药物的遗传毒性。
三、实验步骤1.选取健康的成年小鼠，进行试验前处理，包括脱毛、称重等。
2.对小鼠进行腹腔注射或口服给予不同剂量的待测毒物。
3.分别于24小时、48小时和72小时三个时间段采集小鼠骨髓细胞，制备骨髓细胞涂片。
4.对涂片进行染色处理，以便观察和计数。
5.在显微镜下观察每个涂片，记录微核数并计算微核率。
6.统计分析数据，对比不同剂量组与对照组的微核率差异。
7.根据实验结果，评估待测毒物的遗传毒性及对骨髓细胞的损伤程度。
四、实验结果与数据分析经过对小鼠骨髓细胞微核率的观察和计数，我们得到了不同剂量组与对照组的微核率数据。
通过对比分析，我们发现随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
这表明待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致骨髓细胞的损伤。
为了更直观地展示实验结果，我们可以使用柱状图或折线图来表示不同剂量组与对照组之间的微核率差异。
通过观察图表，可以清楚地看到随着毒物剂量的增加，微核率也逐渐升高。
这进一步证实了待测毒物的遗传毒性和对骨髓细胞的损伤作用。
五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1.待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致小鼠骨髓细胞的损伤。
2.随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
3.实验结果提示，待测毒物可能对机体产生一定的危害作用，需要进一步研究其对人体健康的潜在影响。
4.微核试验作为一种快速、敏感的检测方法，可用于评估生物样品中的毒性物质及其潜在危害。
实验3-小鼠骨髓细胞微核试验-20121101
3.染毒次数及取样时间： 一般采用多次染毒方法，常用的 比较合理、方便的方法是 4 次染毒，即 每天染毒一次，连续 4 天，第 5 天（即 最 末 一 次 染 毒 后 24 小 时 ） 取 样 。 这 样 ， 仅 仅 取 样 一 次 就 能 复 盖 24~72 小 时，而且如果高峰在96小时，也不会漏 掉。（2次染毒，末一次染毒后6小时） 取样）
４.染毒剂量选择： 如有受试化学物的LD50资料，通常选 1/2 LD50作为高剂量，1/20 LD50为低剂 量，中间再安排两个剂量，并同时设立 阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组 一般用环磷酰胺（小鼠按50～100 mg/kg )，按0.1ml/10g的体积，腹腔注 射一次或二次；阴性对照使用等体积的 溶剂注射.
实 验 四 小鼠骨髓细胞微核试验
一．实验目的
1.了解遗传毒理学技术和方法 2.掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE） 微核测定方法
二. 实验原理
染色体 断裂
影响纺 缍丝
染色体 化学致突变物
无着丝点,片或环
作用于纺锤丝
整条染色体 带着丝粒的环和断片
形成微核
于细胞分裂末期细胞质中
微核成因
1. 正常细胞在有丝分裂后期其染色体 逐渐从赤道向两极移动并在末期成为 两个子细胞的核心，若染色体断裂或 损伤，则它们在有丝分裂后期不能正 常向两极移动而滞留形成微核，从而 在有丝分裂的间期看到微核。
四、注意事项
1.Giemsa染液pH6.8是细胞染色质量的 重要保证； 2.推制良好的骨髓涂片是本试验的关 键步骤； 3.正确区分PCE细胞、NCE细胞及白细 胞； 4.正确区分微核与染料颗粒。
成熟红细胞模式图
红细胞
电镜
MN NCE
Thanks!
小鼠骨髓多染红细胞微核试验
小鼠骨髓多染红细胞微核试验实验原理微核是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞浆内形成的游离团块物质。
微核实验作为细胞遗传损伤的标志之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。
当骨髓成红细胞发展成为红细胞时，主核排除，成为多染红细胞，这些细胞保持其碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血中。
在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。
由于这些细胞没有主核，便于观察微核。
观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。
本次试验的检测终点为染色体损伤。
一、实验动物健康的成年ICR小鼠50只，体重18-22g，每组10只，雌雄各半，随机分组。
二、试剂与其器材40%工业久效磷，环磷酰胺，PH6.8的小牛血清，甲醇，PH6.8的磷酸缓冲液，Giemsa 染液；注射器、小鼠灌胃针头、动物秤、剪刀、镊子、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜。
三、试验方法1.实验动物：采用配伍组设计法对小鼠进行分组。
每组10只，共5组。
2.剂量分组：设置阳性对照及阴性对照组。
阳性对照物采用120mg/kg环磷酰胺，阴性对照物采用蒸馏水。
此外设计三个剂量组，分别为高中低剂量组。
通常取受试物LD50的1/2,1/4,1/8等剂量。
剂量分别为13.2mg/kg，6.6mg/kg，3.3mg/kg。
3.染毒途径：经口灌胃染毒。
4.染毒次数及骨髓采样时间：一次染毒，24小时后取样测定。
5.取材：按照上述步骤染毒24小时后，颈椎脱臼处死动物，仔细剥离并取下一侧后肢股骨。
用纱布擦净碎肉，减去股骨两端，露出骨髓腔，用注射器吸取少量小牛血清冲洗骨髓腔数次，冲洗物滴在玻片上。
6.制片：蘸取骨髓液，推片3张，干燥后取其中较好的两张用甲醇固定5分钟。
7.染色：用1:9的Giemsa-磷酸缓冲液（PH6.8）染色约10-15分钟，自来水冲洗后，自然干燥。
8.镜检：每只小鼠选择一张染色最成功的片子，在低倍镜下观察染色及分散情况。
小鼠骨髓细胞微核试验
动物骨髓细胞染色体畸变分析
目的和意义:
1、学习动物骨髓细胞染色体标本的制作 2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型
染色体畸变：
指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的 改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞 有丝分裂中期的染色体来发现
染色体畸变分析： 指观察染色体形态结构和数目改变，又称为 细胞遗传学实验
注意事项： 1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块 胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断 2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时 要涂匀，以便推片 4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细 胞分散度是否良好 5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
流程图
处死小鼠，取胸骨
图 1：正常精母细胞（× 1000 ） 图 2 ：精母细胞染色体环（× 1000 图 3 ：精母细胞链状四价体（× 1000 ） 图 4 ：精母细胞染色体数目减少（× 1000 ）
注意事项：
低渗是本实验的关键，控制好低渗时 间，做出分散良好的染色体标本，关系到 实验结果的准确性
流程图
处死小鼠，取股骨 取骨髓，离心
结果分析与评价
结果： 以每只动物为观察单位，每只动物观察100个中 期分裂相，计算其畸变细胞率 分析与评价： 1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物 的种属及有关资料相符 2 试验结果可以用多种统计方法处理，所得 结果应该是相同的 3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较， 应该有显著性差异，还应有剂量反应关系
注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中
操作步骤：
一 染毒：
染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次， 0、24小时各染毒一次，6h后取样 染毒剂量：50mg/kg
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验是一种用于检测物质对小鼠骨髓细胞基因毒性的方法。
骨髓细
胞微核是正常细胞中小核细胞数量的标志。
在受到某些化学物质的影响后，骨髓细胞可以
形成异常小鼠骨髓微核和形态不规则的细胞，这是指指出该物质可能是致癌物或基因毒物，因此，这种试验可以用于评估某种物质对人类健康的风险。
在小鼠骨髓微核试验中，通常将小鼠的骨髓细胞放置在培养基中进行培养，然后将待
检物质加入培养中。
待检物质可能是化学物质、辐射或生物质等。
随后，经过一定时间后，分离的细胞会被染色并进行显微镜检查，以确定细胞数量和微核的数量。
通过小鼠骨髓细胞微核试验得出的结果可以帮助研究人员判断待检物质是否是基因毒
物和可能是致癌物，是否影响细胞的正常生长和健康。
因此，小鼠骨髓细胞微核试验已成
为一种广泛使用的实验室技术，以评估物质的潜在致癌性和毒性。
总之，小鼠骨髓细胞微核试验是一种快速且有效的实验室技术，用于评估化学物质、
辐射等物质对人类健康的影响和风险。
虽然该方法需要一定的经验和技能，但它已被广泛
使用于实验室中，并成为确定制定公众卫生政策的重要工具之一。
小鼠骨髓细胞微核试验
操作步骤
• 1.取材：实验动物最后一次染毒后，按确定的时间将 小鼠颈椎脱臼（大鼠断头）处死后，剪取一侧股骨， 剔净肌肉，用纱布擦掉附在股骨上的血液和肌肉，剪 掉股骨头，露出骨髓腔。用带７号针头的注射器吸取 小牛血清（小鼠需１ml，大鼠需２ml），插入骨髓腔
微核。
试验设计
• 1.动物选择 一般常用的实验动物为大、小
鼠。以小鼠用的最多，要求体重18-20g，
7-12周龄。每组小鼠数量10只，雌、雄各
半。
试验设计
• 2.染毒途径 根据研究目的或受试化学毒物
性质不同，可分别选用经口、经皮、经呼
吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可
能采取如人接触化学毒物相同的途径。
原 理
• 微核试验是用于检测染色体损伤和干扰细
胞有丝分裂的化学毒物的快速方法。微核
是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，
大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或
杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细
胞中可以出现一个或多个。
原 理
• 一般认为微核使细胞内染色体断裂或纺锤
丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细
10min。如当日不染色，也需固定好保存。
• 4.染色：片子固定后，滴加瑞氏-姬姆萨A溶液于涂
片上，让染液覆盖整个标本涂片染色1分钟；再将
B溶液滴加于A液上面（滴加量为A液的2~3倍），
以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液
充分混合，染色8分钟；水洗、干燥、镜检。
• 注意：（不要把细胞冲洗掉）
胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检
测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体
小鼠骨髓细胞微核试验.
五、作业
1. 观察并记数细胞微核率； 2. 用统计学软件SPSS统计结果。Biblioteka 三、实验材料小鼠骨髓
四、实验步骤
1. 实验前6小时用对苯二酚80mg/kg注射于小鼠腹腔内， 处死动物，用0.85%的生理盐水吹出股骨骨髓，离心1000 转/分5分钟，除上清液，滴入少量小牛血清混匀后涂片。 2. 固定：放入甲醇和冰醋酸固定液中固定5-10分钟； 3. 染色：直接在Gimsa染液中染色10分钟，然后冲洗； 用滤纸擦干载片背面的水分，再用滤纸轻轻吸干载片上面 的水分，取出盖上盖片； 4. 观察：嗜多染红细胞呈灰兰色，成熟红细胞呈桔红色， 每只动物计数1000-2000个嗜多染红细胞，微核率为千分 之2.58+0.41。
小鼠骨髓细胞微核试验
一、实验目的
1． 观察诱变物质产生的微核； 2． 了解微核测定的方法与意义，计算微核 率。
二、实验原理
微核（Micronuclei）是真核类生物细胞中的一种异常结构， 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间 期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主 核1/3 以下。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈 正相关，这一点和染色体畸变一样。所以，可用间期的微 核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。 目前国内外不少部门已经把微核测试用于辐射损伤，辐射 防护，化学诱变剂，新药实验，染色体遗传疾病及癌症前 期诊断等各方面。
实验四.小鼠骨髓细胞微核试验
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠实验四：小鼠骨髓细胞微核试验1、实验目的通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。
主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。
2、实验原理微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。
红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，但微核仍保留于PCE细胞中，因此可通过计数PCE细胞中的微核来判断受试物的致突变作用。
3、实验材料3.1实验动物7～12周龄健康小鼠，体重20~30g，10只，雌雄各半。
3.2试剂小牛血清（灭活）；甲醇；姬姆萨染色液：磷酸盐缓冲液（pH6.8）：丝裂霉素C。
3.3器材生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、玻璃染色缸、塑料吸瓶、吸管、乳钵、干净纱布、滤纸等。
4、操作步骤4.1试剂的配制4.1.1小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30 min进行灭活。
4.1.2磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4) 9.47 g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 9.07g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸氢二钠溶液50ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50ml混合即可。
4.1.3姬姆萨染色液将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。
置37℃恒温箱中保温48h。
保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。
取出过滤，即为姬姆萨储备液，两周后可使用。
实验前取姬姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀，即可。
4.2实验动物的处理步骤如下:（1）给药根据急性LD50，选用使动物出现中毒，但不引起动物死亡的剂量，受试小鼠腹腔注射丝裂霉素C1.5～2mg/kg（2）骨髓细胞液的制备在给与受试物6h后，小鼠脱颈椎处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，用滤纸擦干血污（3）PCE及微核的观察涂片在洁净的玻片一端滴小牛血清1滴，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液至血清中，混匀，推片（长度约2～3cm），在空气中晾干（一般以两节胸骨髓液涂一张片子为宜）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干染色固定好的涂片放入姬姆萨应用液中染色15～30min，蒸馏水冲洗，干燥镜检先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。
小鼠骨髓细胞微核试验
叶及核的突起难以鉴别） 2.胞内含核糖体，染色后成灰蓝色（区别于成熟红
细胞，其无核糖体、染色呈淡橘红色） 3.骨髓中PCE数量充足，满足实验计数的要求
三、意义及应用
检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体 完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学 终点。
试验组微核率与阴性对照组相比有显著差异时， 可认为受试物为具有遗传毒性。
骨髓微核观察的步骤
取胸骨
擦净血污，剔去肌肉
剪去骨骺端
小牛血清
混匀、推片
晾干
Gie 骨髓液制备：迅速。在胎牛血清中迅速制取骨 髓液。
涂片及染色：涂片均匀，防止细胞重叠 染色层次分明（染液新鲜配制、pH、染色时间）
观察与计数
五、操作步骤
骨髓液制备及涂片 猝死：颈椎脱臼、麻醉 取组织：胸骨、股骨 获取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：均匀
五、操作步骤
染色 涂片充分晾干后 染色：1. 平置涂片于染色架上，滴加试剂一5滴，
迅速均匀盖满涂片，染色1.5 min 2. 不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二10滴， 轻轻均匀摇晃涂片使染液均匀覆盖涂片，染色8 min 3. 水洗涂片30s, 待干后镜检
五、操作步骤
观察 显微镜的使用 低倍镜：细胞群 高倍镜：分布均匀、染色良好 油镜：细胞形态、微核
五、操作步骤
观察
镜下有3种细胞：
PCE:
灰蓝色
NCE： 橘黄色
有核细胞：蓝紫色
微核：
蓝紫色、 圆形、 边缘规则
五、操作步骤
计数及结果分析
1. 总共200个细胞中，计数PCE与NCE的比值 正常范围 0.6-1.2 PCE/NCE评价细胞毒性的指标 P值具有统计学意义：受试化学物剂量过大，PCE形成受
小鼠骨髓细胞微核试验
（三）固定、染色 推片晾干 加6~10滴染液盖满玻片30秒 加水10~15滴混匀 染色6~8分钟 洗去 染液
（五）观察结果 1.先在低倍镜下选择分布均匀，染色的区域 2.在油镜下观察计数。
3.计数 300~600个PCE中含微核的 PCE数， 并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 （PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞呈桔黄色）
3.实验试剂：甲苯、环磷酰胺、小牛血清、 生理盐水、快速染液等。
四、操作步骤
（一）试验动物及处理
1.动物选择：小鼠，体重18～20g，7～12周龄。每 组小鼠数量4只。
2.染毒途径：经口染毒。 3.染毒次数：每天染毒一次，连续4天，第5天取样。 4.剂量选择：1/2 LD50为最高剂量。甲苯灌胃 0.06ml/20g、0.03ml/20g、0.02ml/20g。 5.对照组：阳性对照组环磷酸胺（60mg/kg）腹腔注 射一次。阴性对照组使用等体积的溶剂。
六、注意事项
该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片 及优质的染色。
（微核多呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核 质一致，呈紫红色或蓝紫色。）
五、结果分析与评价
微核率以千分率表示。每只动物为一观察单 位。 正常的PCE／NCE比值约为1（正常范围为 0.6～1.2）。 阳性对照组微核发生率一般大于千分之五， 且与阴性对照组比较有统计学意义。 阳性结果：受试物至少一个剂量组与对照组 比较有统计学意义，且有剂量反应关系。
小鼠骨髓Hale Waihona Puke 胞微核试验公共卫生学院 冯昶
一、目 的
学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞 （PCE）微核测定方法
二、原 理
1.微核的形态： 2.观察、检测对象： 3.微核试验的意义：
实验17 小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验金一和大連理工大学環境与生命学院微核形成机理微核实验原理微核是染色体断裂或纺锤丝受损, 在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。
RBC在成熟之前最后一次细胞分裂后，主核排出细胞外，微核仍滞留在PCE细胞中。
因此，可以根据PCE细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性。
实验目的1.掌握小鼠骨髓细胞微核试验方法2.掌握骨髓多染红细胞（PCE）中微核的观察方法实验器材1.手术刀2.手术剪3.无齿镊4.小型弯止血钳5.干净纱布6.带橡皮头吸管7.台式离心机8.刻度离心管9.电吹风机10.玻璃蜡笔11.2ml注射器及针头12.载玻片及推片13.定时钟14.带油镜头显微镜15.细胞计数器16.玻璃染色缸17.晾片架主要试剂甲醇（分析纯）生理盐水小牛血清pH6.8的磷酸盐缓冲液分别取1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。
阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C实验操作步骤•染毒次数连续 4 次染毒取样时间最后一次染毒后，经过24h，取骨髓制作骨髓涂片骨髓涂片的固定、染色和封片微核观察和细胞计数骨髓细胞染色方法取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉小牛血清Giemsa 应用液10~15min 甲醇中，固定15min 混匀、推片冲洗、晾干晾干冲洗、晾干细胞计数嗜多染红细胞和微核微核率计算方法结果分析与评价阳性判断实验组中至少一个剂量组微核阳性率显著大于对照组，并具有重现性和剂量-反应关系。
阴性结果试验剂量不够、采样时间不合适、细胞计数量不足、实验动物自发微核率高等原因，均可以造成实验结果阴性。
当实验设计符合标准，试验剂量足够大，其他染毒方式的微核试验结果仍为阴性时，可认为受试物微核试验阴性。
注意事项1. 实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。
2. 骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。
小鼠骨髓微核实验骨髓细胞悬液制备的基本实验流程
小鼠骨髓微核实验骨髓细胞悬液制备的基本实验流程1.测试动物和治疗（1）动物的选择：常用的实验动物是大型和小鼠。
小鼠是使用最广泛的，需要18至20克体重和7至12周龄的体重。
每组中的小鼠数量为10只，雌雄各占一半。
（2）中毒途径：根据研究目的或所测试化学毒物的性质，可选择口服，经皮，呼吸和注射途径。
但原则上，应采用与人接触化学毒物相同的方式。
（3）中毒频率和采样时间：研究已经证实，化学毒物需要在目标器官中积累到一定浓度才能产生诱变作用。
不同化学毒物诱导的微核的峰值时间也不同。
波动范围可达24?72h。
这就要求在接触化学毒物后建立不同的采样时间点。
考虑到上述两个原因，建议使用多种曝光方法。
其中，四次曝光更方便合理。
也就是说，每天一次，连续4天，第5天采样。
这样，样品可以覆盖24?72h 的峰，并且如果峰延迟至96h，则不会错过。
（4）剂量选择：被测化学毒物的最大剂量应为最大耐受量，但溶解度极限除外。
如果是叶子，应设定3至5个或更多剂量组。
剂量范围应正确且连续。
腹腔注射环磷酰胺（50?100mg / kg）或丝裂霉素C（10mg / kg）一次即可。
或2次。
静脉注射使用等体积的溶剂。
2.骨髓液的制备和涂片在最后一次暴露测试动物后，在确定的时间通过颈脱位或麻醉处死它们。
将四肢固定在解剖板上，用头发浸透腹部的中线，切开胸腹部，除去胸骨，并清洗血液。
，去除肌肉，切断骨the，使用小的弯曲止血钳在干净的玻璃载玻片上挤入骨髓，并滴加小牛血清，混合均匀，然后推动载玻片。
或者，在处死动物后，用手术剪刀除去股骨，除去肌肉，用生理盐水洗净血液和碎肉，切掉分离的骨physi，并使用带针的2ml注射器吸小牛血清。
插入骨髓腔，将颗粒冲洗到离心管中，然后使用移液管吹动微观肿块以校正均匀性。
以1000r / min的速度离心10分钟，弃去多余的上清液，并与沉淀物混合约0.5ml。
用滴管吸出并将一滴滴在干净的玻璃载玻片上，然后推动载玻片。
实验三小鼠骨髓细胞微核试验
实验三小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法。
二、实验原理微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。
微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。
一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。
所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。
由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。
三、器材与试剂1、器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片染、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。
2、试剂－甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液（取Giemsa染料lg，甘油66m1，甲醇60ml。
先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60oC水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。
该储备液存放的时，间越长，染色效果越好。
临用时用pH6.8的磷酸盐缓冲液配制为10％的应用液）、pH6.8的磷酸盐缓冲液。
（1）1/15mol/L磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液：称取分析纯KH2PO49.06g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
（2）1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液：称取分析纯Na2HPO49.45g/kg或Na2HPO42H2011.87g;Na2HPO47H2017.87g;Na2HPO412H2023.88g）用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
小鼠骨髓细胞微核试验
四、
操作步骤
1． 动物一般选用 7~12 周的、体重 20~30g 的小鼠，也可选用体重 150~200g 的大鼠。 每个剂量组至少用两种性别的动物各 5 只。 若需多次采样， 则每组的动物数需增加， 每个采样时间至少有 8 性质 （尤其是溶解度、 水溶性或脂溶性） ， 确定溶剂。 一般采用水或食用植物油，不容者可用淀粉制成混悬液。 一般在受试物的 1/2~1/30LD50 范围内选择 3~4 个剂量组。 也可采用急性毒性试验中出现中毒 而不致死的剂量作为染毒最高剂量组，以畜禽的可能摄入量作为最低剂量组，中间插入 1~2 个剂量组。同时设对照组，即空白对照、溶剂对照和阳性对照。阳性对照组用环磷酰胺生理 盐水溶液一次腹腔注射 30~50mg/kg，或以环磷酰胺水溶液 80~120mg/kg，经口染毒两次， 间隔 24h。 3．染毒途径根据受试物的性质及畜禽接触方式不同，可分别选用灌胃、腹腔注射、皮 下或肌肉注射等染毒途径。 4．染毒方法一般采用 2 次染毒方法，两次间隔 24h。 5．制片 （1）骨髓细胞液的制备在第二次给予受试物 6h 后，小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股 骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，减去股骨两端。用配有 6 号针头 1ml 注射器 吸取小牛血清约 0.05ml 冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。 （2） 涂片将玻片上的冲洗物调匀后， 推片若干张。 迅速干燥， 可在酒精灯上短时烘烤。 （3）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定 5~10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应 固定后保存。 （4）染色固定好的涂片用 1:10 的吉姆萨-磷酸缓冲液（pH6.4）染色 15~30min。用蒸馏 水冲洗，干燥，待检。 为了便于诊断，可选用吖啶橙染色法。固定好的涂片放入 0.24mmol/L 吖啶橙磷酸缓冲 液内，染色 2~3min。用 Ph6.8 磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 1~2min。晾干后在荧光显微镜下 观察，如微核带红色荧光，可再冲洗数分钟，直至发黄绿色荧光。在染色、干燥过程中均应 避光，以防荧光减弱或消失。 （5）封片染色干燥后的涂片，若需长时间保存，可放入二甲苯透明 6min，取出后趁湿 滴上适量中性树脂胶， 盖上盖玻片， 平置。 待干后却可收入盒内备检。 若在短时内进行观察， 涂片不需制成涂片。 （6）镜检先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色良好的区域，再 以油镜检查计数。 可用细胞形态是否完好， 作为判断制片优劣的标准。 嗜多染红细胞 （PCE） 呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（NCE）呈粉红色。 每只动物需计数 1000 个嗜多染红细胞， 并计算含微核的嗜多染红细胞数， 列入表实 6-1。 在一个嗜多染红细胞中出现两个或多个微核，仍按一个为细胞计算。微核率按下式计算，并 以千分率表示。 微核率列入表实 6-2。 另外， 在计数 PCE 时， 计数见到的 NCE 数， 求出 PCE/NCE 的比值。 嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数× 100% 表示 6-1 出现微核的嗜多染红细胞数统计 性别 空白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 阳性对照组
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小鼠骨髓细胞微核试验
一、目的与要求
1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。
2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤，嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。
3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。
二、实验原理
微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。
无论是断片还是整条染色体，其实质都是遗传物质，一但发生畸变，就有能形成遗传物质方面的问题，造成突变，因此，微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测，现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标。
微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。
主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。
传统的微核试验是体内试验，它观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。
微核可位于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，所以只有在无核的红细胞中才易辨认。
在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞（呈灰蓝或浅蓝色）和成熟红细胞（呈粉红或桔红色）两种，正常情况下嗜多染红细胞占多数，所以观察骨髓嗜多染红细胞。
PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞，但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体，因此Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色，使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC（NCE）有所不同。
微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成，也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。
三、实验设计
1. 动物选择：常用小鼠，体重18~20 g，7~12周龄，每组10只，雌雄各半。
2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。
3. 染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒。
两次染毒：第1次染毒后24小时进行第2次染毒，6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天，末次染毒后24小时取样。
4. 剂量选择：至少设置3个剂量组。
高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量。
一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50剂量。
当受试样品的LD50大于5 g/kg时，可取5 g/kg为最高剂量，以下设3~5个剂量组。
另设溶剂对照组（阴性对照组）和阳性对照组。
阳性对照组可用环磷酰胺（50~100 mg/kg）或丝裂霉素C（10 mg/kg）腹腔注射1次。
四、操作步骤
1. 骨髓液的制备及涂片
颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片一端，另取一块边缘整齐的载玻片，在血清上轻轻按摩，使骨髓完全混匀，然后以45~50度角快速推片，推片后在空气中晾干。
2. 固定
将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15分钟，晾干。
3. 染色
将固定晾干后的涂片用新鲜配制的Giemsa应用液染色10~15分钟，然后用缓冲液冲洗掉玻片上的染色液，晾干。
4. 观察计数
先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在油镜下观察计数。
嗜多染红细胞（PCE）通常为灰蓝色，一般被形容成多云的天空。
正染红细胞（NCE）通常呈淡黄、橘黄等鲜艳明亮的颜色。
微核多呈圆形，边缘光滑整齐，直径相当于细胞直径的1/20~1/5，染色与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。
一个细胞内可出现一个或多个微核。
计数1000个PCE中含微核的PCE数（嗜多染红细胞中出现两个或更多个微核，仍按一个微核细胞计算），并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。
五、结果分析及评价
微核率以千分率表示。
每只动物为一观察单位。
每组的雌、雄动物分别计算
微核PCE的均值及标准差。
雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果。
正常的PCE/NCE比值约为1（正常范围为0.6~1.2）。
如比值＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如比值＜0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。
阴性对照组及阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。