RNA提取标准流程图
提取组织RNA,反转录,qPCR流程图
一、Total RNA的提取：1.取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，10min左右，研磨充分后加入1.5ml的EP管，加入1ml Trizol，充分匀浆。
（另一种，加入trizol会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。
）2.室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中3.加入1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移至新管；4.加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min5.弃上清，留沉淀，加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。
重复三次6.弃上清留沉淀，自然风干（5~10min），加入32ul DEPC处理过的水，测OD260/280的值，根据结果调整至1μg/μl=1000ng/μl，立即进行反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。
附：1OD260=40μg/ml用样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。
（可无）可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边一条不太明显的5SRNA的条带。
证明RNA完整无降解。
二、反转录：说明书：10 μl 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。
20/1μg（以前用的40，下次用20）20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH0和enzyme 配成mix25×PrimeScript Buffer（ for Real Time）：4μlPrimeScript RT Enzyme Mix I ：1μlOligo dT Primer（50 μM）：1μlRandom 6 mers（100 μM）：1μl总RNA ：1μl(1μg/μl)RNase Free dH2O ：12μl反转录反应条件如下:37℃ 15 min （反转录反应）85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）4℃-20℃分装保存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）三、内参检测β-actin 50µl体系试剂使用量10*taq buffer 5µldNTP 4µlPrimer-F（100µM）0.5µlPrimer-R（100µM）0.5µlTaq E 0.25µl模板<500 ng 1µl灭菌蒸馏水加至50µlPCR 反应条件:扩增 1 kb 的 DNA 片段的 PCR 反应条件如下：预变性：95℃，3min98℃ 10 sec.55℃ 30 sec.（下次60℃，去掉非特异性）72℃ 30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）72℃ 5min. 4℃保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。
RNA提取操作流程
RNA提取操作流程1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。
样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
总RNA的提取和RCRPPT课件
加 样 枪 的 使 用
操作步骤
样品处理
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行 裂解；
RNA酶污染来源
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌 等。
严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于 操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器 械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各 种试剂的污染。
最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中 则含有大量内源性的RNA酶。
悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 ×106个细胞加1ml Trizol后，反复用 枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。
培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体 积按10cm2/ml比例加入。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与 Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)
难溶解。） 10. 加入10 ul无RNase的水，充分震荡混匀。
紫外光吸收法
原 理：
1. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2. 而且物质对光的吸收是具有选择性的 3. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱
因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会 被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度 有一定的比例关系.
操作步骤
5. 加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4℃放置5 min。 6. 4℃ 12,000g离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉
qPCR流程图
一、Total RNA的提取：1.取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，15min左右，研磨充分后加入1.5ml的EP管，加入1ml Trizol，充分匀浆。
（另一种，加入trizol会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。
）2.室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中3.加入1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移至新管；4.加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min5.弃上清，留沉淀，加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。
重复三次6.弃上清留沉淀，自然风干（5~10min），加入32ul DEPC处理过的水，测OD260/280的值，根据结果调整至1μg/μl=1000ng/μl，立即进行反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。
附：1OD260=40μg/ml用样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。
（可无）可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边一条不太明显的5SRNA的条带。
证明RNA完整无降解。
二、反转录：说明书：10 μl 反应体系可最大使用500 ng 的Total RNA。
20/1μg（以前用的40，下次用20）20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH20和enzyme 配成mix 5×PrimeScript Buffer（for Real Time）：4μlPrimeScript RT Enzyme Mix I ：1μlOligo dT Primer（50 μM）：1μlRandom 6 mers（100 μM）：1μl总RNA ：1μl(1μg/μl)RNase Free dH2O ：12μl反转录反应条件如下:37℃15 min （反转录反应）85℃5 sec（反转录酶的失活反应）4℃-20℃分装保存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）三、内参检测β-actin 50µl体系PCR 反应条件:扩增1 kb 的DNA 片段的PCR 反应条件如下：预变性：95℃，3min98℃10 sec.55℃30 sec.（下次60℃，去掉非特异性）72℃30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）72℃5min.4℃保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南
Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南（破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA）1 试剂：三氯甲烷（氯仿），异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水、Trizol reagent2 材料与仪器：EP管匀浆器移液枪漩涡振荡器低温高速冷冻离心机冰袋电泳仪琼脂糖凝胶超净工作台3 操作步骤：3.1 准备工作A 玻璃匀浆器、75℅乙醇预冷，离心机预冷至4℃打开超净工作台紫外灯15分钟以上B 用酒精擦拭台面EP管标记3.2. 匀浆处理1 取一定量的纯化过的孢子悬浮液，12000rpm ，离心5min，弃上清a 或者用匀浆仪进行匀浆处理，悬浮液不经离心，直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.，然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器，转移至1.5ml EP管中b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次.（离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。
加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理）2 1ml Trizol Reagent，震荡混匀3. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
4. 可选步骤:4 ℃12 000rpm离心10min，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
5. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。
如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。
6. 4 ℃12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。
RNAiso Plus提取总RNA
-1-
●实验操作
1. RNAiso Plus的使用量情况如下。 样品量
10 cm2的贴壁培养细胞 107的悬浮培养细胞 100 µl 的白细胞 50～100 mg 的普通组织样品 50～100 mg 的特殊组织样品（肝、脾、骨及软骨等） 15～30 mg 的植物材料（多糖和多酚含量不高的）
RNAiso Plus 使用量（ml） 1
●制品组成
RNAiso Plus*
100 ml
* RNAiso Plus 中含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若 不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。
【试剂盒之外所需准备试剂】
◆ 氯仿 ◆ 异丙醇 ◆ 75%乙醇（DEPC 处理水配制） ◆ RNase-free 水（制备方法：使用 RNase-free 的玻璃瓶，向超纯水中加入 DEPC 至终浓度 0. 1%（v/v），
过夜搅拌后，高温高压灭菌。）
●保存和运输
1. 可以在室温下保存，建议在 2-8℃下避光保存，效果更佳。 2. 可以在常温下运输。
●RNA 提取实验前的准备
RNA 制备的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在 实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。 通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
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4. RNA 沉淀的清洗。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75％的乙醇 l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管 管壁，12,000 g 4℃离心 5 分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制 RNA 中的盐离子含量，应尽量除净 乙醇）。
5. RNA 的溶解。 室温干燥沉淀 2～5 分钟（不可以离心或加热干燥，否则 RNA 将会很难溶解，有关 RNA 溶解可以参考 Troubleshooting 中的相关说明），加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打 沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80℃保存。
总RNA提取及QPCR标准操作流程
总RNA提取及反转录标准操作流程一、仪器试剂Trizol试剂三氯甲烷（4℃预冷）异丙醇（4℃预冷）75%乙醇（DEPC处理水配置）（4℃预冷）DEPC处理水/RNase free water（反转录试剂盒）1.5mL无酶EP管200μL无酶PCR管冷冻离心机Nano Drop 2000反转录试剂盒（Takara RR036A）二、实验须知1. 选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。
2. 操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。
3. 尽可能在冰盘上操作。
3. 取EP管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管后，袋子及时封好。
4. Trizol含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。
三、样品处理1. 组织样品将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。
注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。
胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。
2. 贴壁细胞样品弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量 Trizol溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml 无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。
注：加入Trizol溶液后，可将培养皿放入-80℃冰箱，20min后取出化开，通过冻融增加细胞裂解效果。
3. 悬浮细胞500g×5min离心收集细胞，弃去培养基，约5-10×106细胞加入1mLTrizol 溶液，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。
注：某些酵母或细菌细胞须超声裂解。
4.注意事项1）样品裂解液可室温存放数小时，-80℃可至少存放一月。
2）若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质，如脂肪、肌肉或块茎植物等样品，可增加一步离心操作，具体步骤如下：12000g、4℃离心10min，胞外基质、多糖、高分子量DNA将会形成颗粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。
（完整版）提取细胞RNA的步骤
（完整版）提取细胞RNA的步骤提取细胞RNA的步骤：1) 六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，枪头吹打。
2) 将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。
15－30℃下孵育2-3min，离心（4℃，12，000g，15min）。
3) 离心后液体分为三层（上层－无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一新的EP 管中。
4) 加入等体积异丙醇，0.4－0.5ml，混匀，15-30℃下孵育10－30min，离心（4℃，12，000g，10min）。
其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。
5) 去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心（4℃，7，500g，5min）。
6) 小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。
最好是用枪头吸取上清，尽量除去。
7) 加入20ul DEPC水溶解，分装5ul/管，-70℃冰箱保存。
8) 细胞总RNA的鉴定：0.9-1.2％琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察出现条带及各条带亮度。
紫外分光光度计测定：分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA 的含量和纯度。
1、实验目的提取人体细胞的总RNA和mRNA。
2、本实验所需试剂1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，2）、PBS缓冲液，TRIZOL试剂，3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。
3、实验流程3.1 细胞总RNA的提取1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司）1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
拟南芥总RNA提取流程图
实验一、拟南芥总RNA 的提取 植物组织匀浆处理: 将50-100mg 样品置于液氮中研磨成粉末，加入1ml TRIzol ，使之充分混匀，室温下静置5min加入220µl 氯仿，充分振荡混匀，静置3min（以下要格外小心，防止RNA 降解）6℃，11,800g ，离心15min ；再次抽提，取650µl 上清，加130µl 氯仿。
充分振荡，静置3min 6℃，11,800g ，离心15min离心期间可先加500µl 的异戊醇，离心完后吸取上清（约500µl ） 上下颠倒几次，混匀，室温下静置10min6℃，11800g ，离心10min弃上清，加入1ml 75%的乙醇，充分洗涤沉淀6℃，7000g ，离心5min弃上清。
离心30s ，将残余液体除去室温下干燥，加200µl DEPC ，20µl NaAC ，660 µl 无水乙醇，混匀后，-80静置1hr 以上6℃，11800g ，离心20min弃上清，离心30s ，将残余液体除去晾干，加10µl DEPC 水，冰上静置10 min ，弹匀溶解吸取0.5ul 的RNA 样品+1µl 10x loarding buffer+0.1µl EB+8.5µl DEPC 水用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量所用试剂：2、氯仿3、异丙醇4、乙醇200ml NaAC(3M,PH 5.0)配制：分子量82.03称取49.38 g NaAC，加100多ml DEPC水,加冰醋酸调PH值（约20ml左右）边定容边条PH值，加水会使PH值下降。
RNA抽提详细步骤
RNA抽提指南(TRIZOL法)RNA抽提指南(TRIZOL法)注意事项：* 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A 或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。
* 在TRIZOL 中，RNA 是隔离在RNA 酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4 小时。
塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
抽提步骤：1．匀浆化作用通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，将匀浆样品在15—30°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。
（每5—10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL。
在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。
）2．分离阶段每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 秒并将其在30°C 下孵育2—3 分钟。
在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。
离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。
RNA 无一例外地存在于水样层当中。
水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60%3．RNA的沉淀将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。
最初均化时的每1 m lTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。
提RNA及反转步骤
提RNA,反转一．Trizol法抽提总RNA1.Trizol用量：组织：50-100mg tissue—1ml T rizol贴壁细胞：1ml Trizol—10cm2培养面积/30mm 细胞平皿；悬浮细胞：1ml Trizol—5-10×10∧6 cell 2．加入Trizol后用枪吹打均匀，室温静置10min，吹打均匀的溶液室温下保存数小时，在-60或-70℃至少保存一个月；3．1ml Trizol溶液中加入氯仿200ul，剧烈震荡15s，室温下静置两分钟；4.离心：4℃，12000g，15min5.取上层水相至新的无酶EP管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温静置10min6.离心：4℃，12000g，10min7.弃上清，沉淀即为RNA，加入1ml 75%乙醇（1ml Trizol所提RNA）(此时的RNA可在-20℃保存至少一年，在4℃保存至少一周)涡旋8.离心：4℃，7500g，5min9.弃上清，超净台干燥5-10min（不可完全干燥），溶于20-50ul 无酶水，并用枪吹打均匀，于55-60℃水浴10-15min10.测量总RNA浓度：RNA 260/280＞1.8DNA 260/280 1.6~1.8二．反转Takara反转体系（10ul）：2ul mix≤500ng RNA无酶水补齐体积至10ml条件：37℃15min→85℃15sPromega反转体系（25ul）：RNA 2.5ugOligoDT 1ul 17.05ul无酶水70℃，5min，立即置于冰上（使RNA变性，打开二级结构）5×M-MLV Buffer 5ulDNTP MIX 1.25ulRNA Inhibitor 0.7ul 7.95ulM-MLV 1ul42℃，1h。
RNAiso Plus提取总RNA
③ 将匀浆液转移至离心管中，室温静置 5 分钟。 ④ 12,000 g 4℃离心 5 分钟。 ⑤ 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。
3. Total RNA 的提取。 ① 向上述步骤 2 的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈 振荡 15 秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现 象）后，再室温静置 5 分钟。 ② 12,000 g 4℃离心 15 分钟。 ③ 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜 色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 ④ 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在 15～30℃下静置 10 分钟。 ⑤ 12,000 g 4℃离心 10 分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
图1.动物组织RNA提取结果电泳图
2. 从植物组织中提取Total RNA。
使用本试剂盒从马铃薯块根、香菇子实体、烟草叶片、水稻叶片、芒果果实、花生果实等组织中提取了
Total RNA，电泳结果见图2。
1 2 3 4 5 6 M1
1% Agarose凝胶电泳图
M1：DL2,000TM DNA Marker 1：马铃薯块根 2：香菇子实体 3：烟草叶片 4：水稻叶片 5：芒果果实 6：花生果实
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RNA提取标准流程原理：TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。
预防RNase污染注意事项：1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3．RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。
4．配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37ºC放置过夜，高压灭菌。
注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。
）RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20ºC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。
所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。
10×Loading buffer （宝生物工程（），货号：D603，35元，1mL×5支）准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppe ndorf管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。
操作步骤:1. 研磨+匀浆：将组织在液氮中磨碎（大体积不均一的样品，如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体，必须对整个组织研磨），取50～100 mg组织样品（肝脏可减少样品量到30 mg）放入2 mL离心管中，称重记录；均一组织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。
每50～100 mg组织加入1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10%。
2．将匀浆样品在室温（15～30ºC）放置5 min（可延长到15 min），使核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉）可于2～8℃ 10000 × g离心10 min，取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。
3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置3 min。
（可延长震荡时间和放置时间到15 min，同GTC 法）4. 4ºC 10000 × g离心15 min。
样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
（即1mL最多600µl，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层）5. 记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。
a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。
b. 可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）：每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。
6. 4ºC 10000 × g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。
弃上清。
8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。
每使用1 mL TRIzol 至少加1 mL 75%乙醇。
4℃不超过7500×g离心5 min，弃上清。
9.室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，大约晾5～10 min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。
加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥0.5 μg/μL，但不影响溶解，浓度在4 μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情况），使之充分溶解（可选择4℃放置1 h以上或55～65ºC水浴10 min），之后才可以进行测浓度、DNA污染的PCR验证、RNA变性电泳等后续操作。
RNA应尽快转移至-70ºC保存。
也可用100%的去离子甲酰胺溶解（用于northern的RNA 可这样保存于-20ºC）。
补充说明：1. 从少量样品（1～10 mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许线性丙烯酰胺等助沉剂以促进RNA沉淀。
操作示例：加800 µL TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加浓度为5 mg/mL的线性丙烯酰胺2～3μL RNase-free线性丙烯酰胺溶液。
它在使用时最终工作浓度应该为10～20 μg/mL。
线性丙烯酰胺会与R NA一同沉淀出来，线性丙烯酰胺浓度不高于5 µg/µL不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
线性丙烯酰胺制备方法见附录1。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70ºC保存至少一个月。
3.若提取的组织源性RNAase含量较高（如胰腺），可将全部过程置于冰上操作，同时适当延长放置时间。
预期产量：1 mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6～10 μg，肾3～4 μg，骨骼肌和脑组织1～1.5 μg，胎盘1～4 μg，上皮细胞8～15 μg，成纤维细胞5～7 μg。
RNA的质量控制：1.使用nanodrop测量RNA吸光值时的几点说明：图一、RNA 紫外吸收光谱1.RNA的吸收峰应在260nm，左偏峰少见，右偏峰提示可能有酚污染。
2.对于RNA纯品：A260/A280=1.81 (溶于水)；A260/A280=2.04 (溶于TE：10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH=8.0)；A260/A230>2。
3.nanodrop使用0.2mm光径，但默认显示的是换算后的1cm光径吸光值，并非其精度能够检测3以上的吸光值（2%以下的透光率）。
4.对于ND-1000（本实验室机器型号），其RNA检出限为2-3000ng/μL，大于3000ng/μL需要稀释后再测。
2.PCR验证基因组DNA污染：使用RNA作为模板，使用不跨含子的引物采用进行普通PCR反应，若可以扩增出条带，则说明存在DNA污染。
注：验证时，必须有阴性和阳性对照，阴性对照的模板为DEPC水，阳性对照的模板为cDNA。
3.RNA甲醛变性胶验证质量：变性胶做法（每100 mL）：72 mL水，1.4 g Agarose (1.4%，胶浓度可调)，加热煮沸，待冷却到约60ºC时，加入10 mL 10×MOPS （配制方法见附录1），18 mL 甲醛溶液（37%，pH > 4.0），混匀（避免产生气泡）倒入胶槽，冷却2 h后使用。
（放置过长时间会导致甲醛挥发，影响电泳结果）样品处理方法：将RNA稀释到1 μg/μL，取4.4 μL（可减少点样RNA量，但需要保证体积），加2 μL的10×MOPS，3.6 μL的甲醛，10 μL的去离子甲酰胺，共20 μL，混匀之后将样品置于65ºC水浴变性15 min，迅速置于冰上冷却。
之后加入2 μL10×loadin g buffer，0.1 μL EB（10 mg/mL），混匀后即可点样。
电泳：5 V/cm电压，电泳约40 min后（或指示剂到胶的2/3处）照相。
注: 若成像结果不佳，可选择EB后染，即不将EB混入样品中，在电泳完成后，使用1 μg/mL（储存液稀释10000倍即可）的EB染胶15 min，清水脱色15 mi n或更长时间，图像对比度会更高，且不会出现反向的EB亮斑。
电泳结果分析：好的RNA电泳图可见28S和18S的清晰图像，且亮度呈2倍的关系。
图四、RNA电泳示例图，2%的变性胶，对比度经过调整美化常见问题分析：得率低：A．样品裂解或匀浆处理不彻底B．RNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65 ：A．检测吸光度时，RNA样品没有溶于TE，而溶于了水中，低离子浓度和低p H值条件下A280值偏高，水中1.5～1.8的比值都可能是质量较好的RNA B．样品匀浆时加的试剂量太少（造成蛋白未分离完全）C．匀浆样品时未在室温放置5 minD．吸取水相时混入了有机相E．RNA沉淀未完全溶解RNA降解：A．组织取出后没有马上处理或冷冻B．待提取RNA的样品没有保存于-60至-70ºC，而保存在了-5至-20℃C．细胞在用胰酶处理时过度D．溶液或离心管未经RNase去除处理E．电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染:A．样品匀浆时加的试剂量太少B．样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲体系或碱性溶液附录Ⅰ一、线性丙烯酰胺制备方法1.配5%的丙烯酰胺（acrylamide）溶液：A．配制buffer 100 mL（40 mM Tris-HCl （pH= 8），20 mM 醋酸钠, 1 mM EDTA）：称取2.72 g无水醋酸钠，溶于50 mL DEPC水中，向其中加入1 M Tris-Cl （pH=8.0）4 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.2 mL，加入盐酸调节pH至8.0，再加DEPC水至100 mL。
B．称取5 g 丙烯酰胺，加入100 mL buffer中，高压灭菌后分装至高压过的1.5 mL管中，每管0.2 mL。
2.加过硫酸铵（AP）到终浓度为0.1 %（w/v）：A．配制10 % AP储存液（w/v）：称取0.1 g AP，溶解于1 mL DEPC水中。
B．向每管5%的丙烯酰胺溶液中加入2 μL 10 % AP。
3.加TEMED到终浓度为1/1000（v/v），即向每管中加入0.2 µL TEMED，室温聚合30min。
4.待溶液变粘稠，向管中加入2.5倍体积（500 µL）的乙醇沉淀聚合物，-20℃沉淀30 min以上。
5.12000×g离心5 min，沉淀即为线性的丙烯酰胺，每管加入1mL 1×TE buffer溶解（溶解时间较长，可4 ℃过夜），即得到终浓度为10 mg/mL的线性的丙烯酰胺1 mL。
封口膜密封保存于-20 ℃，可保存2年。
1×TE buffer（10 mM Tris-Cl，pH=8.0；1 mM EDTA）配制方法：加入1 M Tris-Cl （pH=8.0）1 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.2 mL ，加入DEPC水至100 mL，高压灭菌备用。