引物设计流程
snorna 引物设计流程
snorna 引物设计流程snorna是一类非编码RNA，其主要功能是在转录后修饰和加工rRNA 和snRNA。
为了研究snorna的功能和机制，需要进行snorna引物的设计。
下面将介绍snorna引物设计的流程。
1. 确定snorna序列：首先需要确定研究的snorna序列。
可以通过文献检索、数据库查询等方式获取目标snorna的序列信息。
2. 引物设计原则：在进行snorna引物设计时，需要遵循一些基本原则。
首先，引物的长度应该在18-25个碱基对之间，以确保特异性和敏感性。
其次，引物的GC含量应在40%-60%之间，以保证引物的稳定性。
此外，还需要避免引物之间的自身互补性和异源互补性。
3. 引物设计工具：为了方便snorna引物的设计，可以使用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等。
这些工具可以根据用户输入的snorna序列，自动设计合适的引物。
4. 引物特异性检验：设计好引物后，需要进行引物特异性检验。
可以使用BLAST等工具，将引物序列与相关数据库进行比对，判断引物的特异性。
引物的特异性越高，说明其在目标snorna上的结合效果越好。
5. 引物合成：合成合适的snorna引物后，可以选择将其合成或购买商业合成的引物。
引物的合成需要选择可靠的合成厂家，确保引物的质量。
6. 引物验证：合成的snorna引物需要进行验证。
可以通过PCR扩增、实时荧光定量PCR等方法，验证引物的特异性和敏感性。
同时，也可以通过Northern blot等方法，检测snorna在不同组织或条件下的表达情况。
7. 引物优化：在验证过程中，如果发现引物存在特异性不好、敏感性不高等问题，可以进行引物的优化。
可以尝试调整引物的长度、GC含量等参数，或者设计新的引物，以提高引物的性能。
总结：snorna引物的设计是研究snorna功能和机制的重要步骤。
通过确定snorna序列、遵循引物设计原则、使用引物设计工具、进行引物特异性检验、引物合成、引物验证和引物优化等步骤，可以设计出合适的snorna引物。
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计随着基因研究的不断深入，质粒测序成为了分析基因信息的重要工具之一，同时，为了获得更真实、更准确的序列，准确设计序列特异性强的引物是非常重要的。
本文将重点讲述质粒测序所需的引物设计流程及其注意事项，以期为大家提供参考。
1. 引物设计的基本原则引物是一种在PCR反应体系中使DNA聚合酶特异性扩增所需的寡核苷酸。
正确认识引物的作用和特点，对于准确设计合适的引物具有很重要的意义。
引物的主要特点有以下几个方面：（1）序列特异性：引物应特异性地与目标序列结合，确保扩增出的片段为所需的序列，而非与其它非靶DNA结合。
（2）稳定性：使其与模板DNA的双链DNA进行稳定的配对。
（3）温度特异性：引物与模板结合的温度应该略低于生产它们的反应体系的温度。
基于以上特点，我们需要基于引物设计的原则进行质粒测序引物的设计。
具体来说，主要考虑以下几个方面：（1）序列特异性：引物应设计成特异性的，避免产生与目标序列无关的PCR产物。
其特异性应通过序列比对和BLAST进行验证，以确保最终设计出的引物能够对所需的目标序列特异性扩增。
在引物设计时，还应注意要在引物中避开GC/AT区域和重复序列的部位。
（2）长度优化：引物的长度应该合适，过短容易导致扩增不全，过长则容易出现引物间的竞争关系，同时也容易产生温度特异性方面的问题。
一般来说，引物长度应该控制在20个核苷酸左右，但是对于某些特殊的情况，比如复杂基因组、高度变异基因等，可能需要设计更长的引物。
（3）序列特征：引物中不应含有重复结构、长程序列、寡聚物或者常见的RNA序列，这些都可能导致不特异扩增、引物二聚或聚合酶滞留等问题。
2. 引物设计流程在对质粒进行测序之前，需要先设计合适的引物，紧密契合上述引物设计原则，具体流程如下：（1）数据获取：首先需要获取目标DNA序列，并确定所需要进行的PCR扩增区域。
（2）引物设计：根据目标区域，按照上述设计原则进行引物的设计。
一般来说，可以利用一些公共的软件或者在线工具进行引物设计，比如Primer 3、OligoCalc、Primer Premier等。
简述引物设计流程及结果
简述引物设计流程及结果英文回答：Primer design is a crucial step in many molecular biology experiments, including PCR, qPCR, and DNA sequencing. It involves designing short DNA sequences, known as primers, that specifically bind to the target DNA region and initiate DNA synthesis. The primer design process typically consists of several steps, including target sequence identification, primer design software selection, primer design parameters setting, primer specificity checking, and primer optimization.The first step in primer design is to identify the target DNA sequence that needs to be amplified or analyzed. This could be a specific gene or a region of interest in the genome. Once the target sequence is identified, the next step is to select a primer design software. There are several software tools available, such as Primer3, OligoAnalyzer, and NCBI Primer-BLAST, which can assist indesigning primers based on various parameters.After selecting the primer design software, the next step is to set the primer design parameters. These parameters include primer length, melting temperature (Tm), GC content, and potential secondary structures. The primer length is usually between 18-25 nucleotides, with 20 nucleotides being the most commonly used length. The Tm is the temperature at which half of the primers are bound to the target DNA sequence, and it is typically set to be around 55-65°C. The GC content is the percentage of guanine (G) and cytosine (C) bases in the primer sequence, and it is usually set to be around 40-60%. Potential secondary structures, such as hairpins or primer dimers, should also be avoided.Once the primer design parameters are set, the next step is to check the specificity of the primers. This can be done using the primer design software or by performing a BLAST search against the target DNA sequence. The primers should only bind to the intended target sequence and not to any other regions in the genome. This is important toensure accurate and specific amplification or analysis ofthe target DNA.After checking the specificity, the final step isprimer optimization. This involves adjusting the primer design parameters, such as the Tm and GC content, toimprove the efficiency and specificity of the primers. It may also involve designing multiple primer pairs andtesting them experimentally to determine the bestperforming primers.The result of the primer design process is a set of primers that are specific to the target DNA sequence and have optimal design parameters. These primers can then be used in various molecular biology experiments, such as PCR, qPCR, and DNA sequencing, to amplify or analyze the target DNA.中文回答：引物设计是许多分子生物学实验中的一个关键步骤，包括PCR、qPCR和DNA测序。
质粒目的基因插入及引物设计流程
在AflI后至BamHI 前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1
在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：
寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）
选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基； 注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，
则说明CDS序列稳定可用；
将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该 段序列中的可能酶切位点
三.克隆引物设计
2量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个， 因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。
5端引物序列即为atggctgtggagtcccag，
01
但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG
02
最后可得Forward primer为AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccag
03
tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct
目的基因的20个碱基
3端引物设计的起点（不含BamHI酶切位点）和方向
最后要把引物顺序调整过来，点击“5→3”既得Reverse primer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct
（本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取
PCR实验室操作流程
PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种可以通过体外合成DNA的方法，也是现代生物技术中一项重要的分子生物学技术。
PCR技术的应用广泛，包括基因测序、基因突变检测、表达定量等。
下面是PCR实验室操作的一般流程。
1.设计引物：PCR实验的第一步是设计引物。
引物是用于扩增目标DNA片段的短链DNA序列。
两个引物分别对应目标序列的两端，其长度通常在18-24个碱基对之间。
引物的碱基序列必须与目标序列互补，以确保引物的结合和扩增特异性。
2. 制备PCR反应液：将PCR反应所需的试剂制备成PCR反应液。
PCR 反应液包括模板DNA、引物、聚合酶、反应缓冲液、dNTPs和Mg2+等。
聚合酶可以是常见的Taq聚合酶，也可以是其他高保真度的热稳定聚合酶。
反应缓冲液包含缓冲盐、pH调节剂和聚乙二醇等成分。
3.加热变性：PCR反应开始前，需要对DNA模板进行热变性，将其双链DNA解开成单链DNA，以供引物结合。
一般在95℃左右进行加热变性步骤，持续1-5分钟。
4.循环扩增：PCR实验主要包括循环扩增的步骤。
循环扩增主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
变性温度一般设置在94-98℃，可以使DNA双链变为单链；退火温度根据引物序列的特性来设计，一般设置在50-70℃之间，可以使引物与DNA模板序列结合；延伸温度一般为72℃，此温度下聚合酶能够合成新的DNA链。
5.PCR循环反复：PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸的三个步骤。
这样可以进行指数级扩增，生成大量目标DNA片段。
6. PCR产物检测：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测。
将PCR产物与DNA分子量标记物一起电泳，可以通过与标准品比较得知扩增片段的大小。
也可以通过染色剂如SYBR Green等进行荧光定量，或者使用定量PCR方法定量扩增产物的数量。
7.结果分析和数据处理：根据PCR产物的结果进行数据分析和处理。
引物设计具体步骤
引物设计一、引物设计简介引物设计是以一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的起点而起作用的多核苷酸链。
我们根据根据蛋白的基因序列及所选取的目的片段，设计引物。
二、引物设计的一般原则（一）抗原性：引物设计在完整的Domain区域或者抗原表位集中区域；（二）PCR产物长度：PCR产物长度不应过长，最佳长度为500bp左右。
；（三）长度：15-30bp，其有效长度[Ln＝2(G+C)+(A+T)]一般不大于38，否则PCR 的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃)，从而降低产物的特异性；（四）GC含量：应在40％-60％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5℃；（五）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。
尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发；（六）互补、错配、二级结构：引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
两个引物之间不应有多于4个互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；（七）引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应，应尽量避免3’端发生错配。
而且尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T；（八）特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。
三、常用软件DNAman5，Primer Preimer5，DNAStar/EditSeq、Snapgene四、信息检索常用数据库（一）uniprot（二）ncbi五、引物设计流程以蛋白Actin Beta的Met1-Phe375为例，说明引物设计具体流程：（一）根据蛋白名称或uniprot等信息，点开uniprot数据库；（二）在uniprot数据库中最左侧的菜单栏中，点击“sequence”，找到氨基酸序列；注：若此蛋白有多个isoform，一般以isoform1的序列为准设计引物（三）在“sequence databases”中找到这个蛋白对应的NM号；注：每一个isoform对应唯一一个NM号（四）点击NM号，进入NCBI数据库，找到对应的CD S序列，图中棕色部分即为此蛋白的碱基序列，根据研究需要，截取对应片段长度，如氨基酸片段为1-375，则碱基序列为1-1125；（五）打开Primer Preimer5引物设计软件，输入选取的碱基序列，点击“Primer”示anti-sense；再点击“Edit Primers”进行编辑；（七）当信息栏显示的发夹结构、二聚体、错配等信息为“None”时，初步认为此引物为最佳选择；（八）进入NCBI数据库，点击“BLAST”，选择“Primer-BLAST”，再次分析确认此引物是否为最佳引物。
基因沉默引物的设计流程
基因沉默引物的设计流程基因沉默引物的设计可是个很有趣的事儿呢，就像搭积木一样，有它自己的一套流程哦。
一、了解基因沉默的原理。
咱们得先明白基因沉默是咋回事。
基因沉默呢，简单说就是让基因不表达或者低表达啦。
这就像是给基因这个小调皮使个魔法，让它乖乖听话。
而引物就像是找到这个基因的小钥匙，所以我们得先知道基因沉默的原理，这样才能设计出合适的引物。
比如说RNA干扰，这是一种常见的基因沉默方式，通过小RNA分子和基因的mRNA结合，阻止它翻译成蛋白质，那我们设计引物的时候就要考虑到这些小RNA分子的特点，要针对我们想要沉默的基因去设计引物，就像射箭要瞄准靶心一样精准。
二、确定目标基因序列。
这一步超级重要哦。
我们要先找到我们想要沉默的那个基因的序列。
这就像是在基因的大森林里找到我们要标记的那棵树。
我们可以从各种基因数据库里去找，像NCBI（美国国立生物技术信息中心）这样的大宝藏库。
在里面输入基因的名字或者相关的关键词，就能找到它的序列啦。
不过有时候会找到好多相似的序列，这时候我们就得像侦探一样，仔细分辨哪个才是我们真正要的目标基因序列。
一般来说，我们要找那种经过验证的、比较完整准确的序列。
找到之后，要把这个序列好好保存下来，就像珍藏宝贝一样，因为这可是我们设计引物的基础呢。
三、引物设计软件的选择。
有了目标基因序列之后，我们就需要找个好用的引物设计软件啦。
市面上有好多选择呢，像Primer Premier这样的软件就很不错。
这些软件就像是我们的小助手，能帮我们轻松设计引物。
不同的软件有不同的特点，有些操作简单易懂，有些功能特别强大。
我们可以根据自己的需求和熟悉程度来选择。
比如说，如果我们是刚刚开始接触引物设计的新手，那可能就选一个操作界面比较友好的软件。
而如果我们已经有了一定的经验，想要更多个性化的设计，那就可以选功能更复杂的软件。
在使用软件的时候，也要多摸索摸索，就像探索一个新的游戏世界一样，说不定会发现很多有趣又有用的功能呢。
(完整word版)PCR引物流程设计详解
PCR引物设计流程详解本文目的：复制出IL-4基因片段一、查找基因序列1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因,即IL—4，点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类(Homo sapiens）2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列3、查看基因的相关信息外显子区域CDs区域4、点击FASTA格式,并将序列保存到文档二、使用primer premier 5。
0设计引物1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内2、点击搜索按钮，搜索引物3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知,外显子区域分别为：1—200、201-248、249-425、426-618,又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100—150bp，故设定上游引物位置为201—248,下游引物位置为249—425,产物长度为100-150bp）4、确认条件后，显示搜索结果4、双击选中得分最高的引物查看引物情况(上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）5、将设计的上下游引物复制出来,保存到文档中三、使用oligo 6.0对设计的引物进行评价1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收2、接收后显示出该序列的相关信息3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收4、同理,录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成情况6、分析上下游引物发卡形成情况7、分析上下游引物GC％8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况9、分析PCR整体情况四、引物特异性检验（primer blast）1、进入NCBI主页,并选择blast2、选择primer blast3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击get primer进行对比4、查看blast结果Blast 结果显示，尽管IL—4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。
质粒 pcr传代稳定性引物设计流程或方法
质粒 pcr传代稳定性引物设计流程或方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计
PCR引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）一．流程图二．确定模板1.确定模板来源物种近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。
如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。
2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入NCBI主页/，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。
B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。
基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。
如下图。
另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考/refseq/about/。
C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）。
D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions，transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。
E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。
3.整理下载的模板序列三．寻找保守区域保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。
详尽的引物设计心得及具体流程操作
详尽的引物设计⼼得及具体流程操作本⽂作者：张慧慧（长沙湘雅附⼆）本⽂系参加解螺旋段⼦⼿招募作品查看更多段⼦⼿招募详情，请回复“悬赏”1 克隆载体： 表达载体⼀般需要的是编码序列（起始密码⼦ATG到终⽌密码⼦TAA/TGA/TGA的序列），也就是NCBI的 coding sequence（CDS）。
⼀般情况是全长序列，直接取ATG开始的20bp为上游引物，TAA/ TGA/ TAG端的20bp的反向互补序列反向引物。
根据载体的酶切位点、读码框的要求在引物的5’端碱基即可。
要注意的是： ①选⽤的酶切位点在编码序列上是否存在，存在就选择其他酶切位点或者选⽤同尾酶。
②载体的标签实在插⼊序列的上游还是下游，在上游编码序列的终⽌密码就要留，在下游编码序列的终⽌密码就要去掉。
③读码框是否正确，有些酶切位点会破坏插⼊序列的读码顺序，这个时候在引物上添加碱基使其正常读码即可。
例如构建EGFP-C1-P53质粒。
① P53序列 绿⾊表⽰选取的引物位置（EGFP-C1的GFP标签在插⼊序列的上游，所以终⽌密码保留。
） 引物序列是：上游引物（与绿⾊标⽰的序列⼀致）5'-ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3'；下游引物（与绿⾊标⽰的序列反向互补）5'-TCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3' ②载体多克隆位点（MCS）分析 我选择酶的原则是价格便宜，常⽤的酶，例如XhoI/BamHI/HindIII等，这样的酶在很多载体中都会有，有时候可以通⽤。
分析p53的序列中是否有XhoI/BamHI两个酶切位点，结果是没有，那就可以放⼼的⽤这两个酶了。
于是引物可以变成 上游引物5’-CTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’（XhoI） 下游引物5’-GGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’（BamHI） 酶在发挥作⽤的时候要有个保护碱基，我认为就是给它⼀个空间让它发挥作⽤，保护碱基在百度百科可以查到，于是引物就会变成 上游引物5’-ccgCTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’ 下游引物5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’③读码分析 XhoI的序列CTC GAG与载体的读码框不⼀致，载体的读码是 TCT CGA GCT，当⽤XhoI/BamHI双酶切载体时，最后的CT需要插⼊序列的AT来代替，就会使插⼊的序列移码，这时候，只要在插⼊序列ATG的前⾯加CT即可，所以引物序列就变成上游引物5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’下游引物5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’ 所以当你给公司发引物序列时就是上游引物5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’下游引物5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’ 因为是全长序列，就表⽰引物已经定了，没有选择。
引物设计流程
2010级动科2班杨教童2220103282101511.引物设计的原理和步骤PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
1.引物设计的原则（1）碱基组成：GC含量应在40%-60%（45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。
没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；（2）引物长度：引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。
（3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。
（4）上下引物的互补性：一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。
当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。
（5）解链温度（Tm 值）：计算出来的两个引物的Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的Tm 值与引物的Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的Tm 值一般为50-70℃。
这些特性保证了扩增产物在每一个PCR 循环可有效变性。
（6）3’末端3’末端的性质非常关键。
如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；（7）5’端序列添加限制性酶切位点：2.用Primer Premier 5.0 软件设计两对引物（1）在网页上找到要制作引物的一段序列，最好在1000左右，比如：ORIGIN1 atgaatccaa atcaaaagat aataacaatt ggttctgttt ctctcatcat tgccacaata61 tgtttcctta tgcaaattgc tatcctagta actactgtaa cattacattt caagcagcat121 gactacaact cccccgcaaa caaccaagca atgctgtgta aaccaacaat aatagaaaga181 aacacaacag agattgtgta tttgaccaac accaccatag agaaagaaat atgccccaaa241 ctagtagaat atagaaactg gtcaaagccg caatgtaaca ttacagggtt tgcacctttt 301 tccaaggaca attcaattcg gctttctgct ggtggggaca tctgggtgac aagagaacct361 tatgtgtcat gcgatcctga caagtgttat caatttgccc ttgggcaggg aacaacatta421 aacaacggac attcaaataa cactgtacat gataggaccc cttatcgaac cctattgatg481 aatgaattgg gtgttccatt tcatttagga accaggcaag tgtgcatggc atggtccagc 541 tcaagttgtc acgatggaaa agcatggctg catgtttgta taactgggga tgatagcaat 601 gcaacagcta gcttcattta caatgggagg cttgtagata gtattggttc atggtccaaa 661 aatatactca gaacccagga gtcggaatgc gtctgtatca atggaacctg tacagtagta721 atgactgatg ggagcgcttc aggaaaagct gatactaaaa tactattcgt tgaggagggg781 aagatcgttc atgttagcac attgtcagga agtgctcagc atgttgagga gtgctcctgt 841 tatccacgat ttcctggtgt cagatgtgtc tgcagagaca actggaaagg ctccaatagg901 cccatcgtag atataaatgt aaagaattat agcattgttt ccagttatgt atgctcagga961 cttgttggag acacacccag aaaaggcgac agcgtcagca gtagttattg cctagatcct1021 aacaatgaga aaggtggtca tggggtgaaa ggctgggcct ttgatgatgg aaatgacgtg1081 tggatgggaa ggacaatcaa cgagacgtta cgcttaggtt atgaaacctt caaagtcatt1141 gaaggctggt ccaaagctaa ctccaaatta cagacaaata gacaagtcat agttgaaaag1201 ggcgacaggt ccggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg catcaatcgg 1261 tgcttttatg tggagttgat aaggggaagg aaagaggaaa ctaaagtctg gtggacctca1321 aacagtattg ttgtgttttg tggcacctca ggtacatatg gaacaggctc atggcctgat 1381 ggagcggata tcaatctcat gcctatataa（2）将序列粘贴到制作区域（3）点击Primer后点击Search开始搜索引物，如：上述设计得如下一对引物5’CCTAAGCGTAACGTCTCGT3’TGGGAG GCTTGTAGATAGT优点：转化率为80%，产物长度比较长，为495bp.能够很到限度的利用所选序列的，在5’端没有A或者多聚A结构，引物的Tm值的差距小于5，GC含量在45%到55%之间。
引物设计及测序结果分析
3
5 CACTACAAGGACTGCCATGAG 3
GTGATGTTCCTGACGGTACTC TAAAGTCACCGTGGACGGACC
5
Forward primer/sense primer: 5 CACTACAAGGACTGCCATGAG Reverse primer/anti-sense primer : 5 CCAGGCAGGTGCCACTGAAAT
应(即错配)
（二）一般原则
1、引物的长度 一般15～30 bp，常用18～24 bp。
引物过短容易引起错配现象，引物过长会导致PCR延伸温度大于
74℃，不适于Taq DNA聚合酶。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜 在的退火位点(3 x 109/412=200 )。而一个长度为20bp的引物在 人基因组上存在的退火位点只有1/400个。
Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC Reverse primer : 5 CTGTGCTCTCTCATCATCATATTC
6、引物的GC含量
G+C含量以40-60%为宜。 G+C太少，PCR扩增效
果不佳；G+C过多，易出现非特异条带。
7、引物的Tm
引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到
PCR的特异性和实验能否成功。
PCR技术的基本过程
三步循环：变性、退火、延伸
������
1.变性：双链DNA解链成为 单链DNA������
2.退火：部分引物与模板的
单链DNA的特定互补部位相 配对和结合
3.延伸：以目的基因为模板，
③ 新建一个word文档，报告引物搜索结果的第1#引物及扩
pcr引物设计操作流程
pcr引物设计操作流程
PCR引物设计是PCR技术中非常重要的一步，引物的设计质量直接影响到PCR反应的效果和结果。
下面是PCR引物设计的操作流程：
1. 确定目标序列：首先需要确定要扩增的目标序列，这个序列可以是基因、DNA片段或RNA序列等。
2. 选择引物设计工具：选择合适的引物设计工具，比如NCBI Primer-BLAST、Primer3等在线工具或者专业的引物设计软件。
3. 设定引物设计参数：根据实验需求设定引物设计的参数，比如引物长度、GC含量、Tm值等。
4. 引物设计：根据目标序列和设定的参数，使用引物设计工具进行引物设计。
通常需要设计一对引物，一个用于扩增目标序列的前端，一个用于扩增目标序列的后端。
5. 引物评估：对设计出的引物进行评估，包括检查引物的特异性、二聚性、自身互补性等。
6. 引物合成：将设计好的引物提交给引物合成公司进行合成。
通常引物的长度在18-25个碱基对之间。
7. PCR反应：将合成好的引物与DNA模板、PCR反应缓冲液、
DNA聚合酶等混合，进行PCR反应。
根据引物的设计，可以选择不同的PCR条件进行扩增。
8. PCR产物分析：对PCR反应产物进行分析，比如琼脂糖凝胶电泳、测序等，确认扩增的目标序列是否正确。
总的来说，PCR引物设计是PCR技术中至关重要的一步，需要仔细设计和评估引物，确保PCR反应的准确性和可靠性。
通过以上的操作流程，可以有效地设计出高质量的引物，为PCR实验的成功提供保障。
blast引物设计流程
blast引物设计流程Blast引物设计是基因组、转录组和蛋白质组研究中不可或缺的一环。
BLAST（基本局部序列比对工具）是用于在数据库中相似序列的一种工具。
它能够在数据库中找到一条或多条与查询序列相似的序列，并计算相似度分数。
利用BLAST工具进行引物设计可以帮助研究人员快速鉴定和选择目标基因、转录本或蛋白质，并进行后续实验。
下面将详细介绍BLAST引物设计的流程。
1.确定目标序列：确定要设计引物的目标序列，可以是基因组、转录组或蛋白质组中的一个特定基因、转录本或蛋白质。
2. 数据库选择：选择适当的数据库进行BLAST。
根据实际需要，可以选择不同的数据库，包括NCBI的GenBank、RefSeq、EST、非冗余蛋白质数据库等。
3.引物设计参数：根据实验需求和目标序列的特点，设置合适的引物设计参数。
参数包括引物长度、引物Tm值、引物GC含量、引物之间的距离等。
4. 引物设计工具选择：选择合适的引物设计工具进行设计。
目前有许多在线工具和软件可以进行BLAST引物设计，例如Primer-BLAST、Primer3、Geneious等。
5.引物设计：根据设置的参数和目标序列，使用选择的引物设计工具进行引物设计。
工具通常会生成多个潜在的引物序列，根据设计要求和实验条件进行筛选。
6.引物特性分析：对设计的引物进行分析，包括引物的Tm值、互补性、二聚体形成、酶切位点等。
高Tm值可增加引物与目标序列的稳定性，互补性较低可以避免二聚体的形成，酶切位点可能会影响后续实验的结果。
7.引物合成：选择合适的引物合成厂商进行引物合成。
根据实验需求，可以选择合成标记有荧光染料或其他分子的引物。
8.引物验证：将合成的引物进行验证，可以通过聚合酶链反应（PCR）或其他测序技术进行验证。
验证引物的特异性和效率，并根据需要进行优化。
9.实验应用：将验证通过的引物应用于实验中，如PCR扩增、基因表达分析、基因组重组等。
BLAST引物设计的流程如上所述，通过合理设置参数、使用适当的工具和对引物进行验证，在基因组、转录组和蛋白质组研究中可以选择出最合适的引物。
pcr实验室流程
pcr实验室流程PCR实验室流程PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增特定DNA片段。
PCR实验室流程是进行PCR实验的一系列步骤，下面将详细介绍。
1. 设计引物PCR实验的第一步是设计引物。
引物是用于扩增目标DNA片段的短序列，通常由20-30个碱基组成。
引物应具有高度特异性，能够与目标DNA片段的两端互补结合。
此外，引物的长度、GC含量和熔解温度也需要考虑，以确保PCR反应的特异性和效率。
2. DNA模板提取接下来，需要从样品中提取DNA模板。
DNA模板可以来自各种生物样品，如细胞、组织、血液等。
提取方法通常包括裂解细胞膜、蛋白酶处理和有机溶剂萃取等步骤。
提取的DNA应具有高纯度和完整性，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
3. PCR反应体系准备准备PCR反应体系是PCR实验的关键步骤。
PCR反应体系包含DNA 模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶（如Taq聚合酶）、缓冲液和Mg2+等组分。
这些组分的浓度和配比需要根据实验要求进行调整，并保持反应体系的稳定性和特异性。
4. PCR反应条件设定PCR反应的条件设定是为了使PCR反应在最佳温度和时间下进行。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤将DNA 双链解开，退火步骤使引物与目标DNA片段互补结合，延伸步骤用于合成新的DNA链。
PCR反应的温度和时间应根据引物的特性和目标DNA片段的长度进行优化。
5. PCR反应程序设置PCR反应程序的设置是为了控制PCR反应的温度和时间变化。
常用的PCR反应程序包括常规PCR、逐渐升温PCR和快速PCR等。
不同的PCR反应程序适用于不同的实验目的，可以提高PCR反应的特异性和效率。
6. PCR反应进行将PCR反应体系加入PCR反应管中，放入PCR仪中开始PCR反应。
PCR反应的时间通常在数十分钟到数小时之间，具体时间取决于目标DNA片段的长度和引物的特性。
blast引物设计流程
blast引物设计流程BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 引物设计是分子生物学研究中一个非常重要的步骤。
它用于通过比对已知的DNA或RNA序列来选择特定区域的引物，以进行PCR（聚合酶链式反应）、RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链式反应）和荧光原位杂交等实验技术。
在本文中，我们将详细介绍设计BLAST 引物的流程。
1.收集目标序列数据：首先，我们需要收集目标序列的数据。
目标序列可以是基因序列、mRNA序列或其他DNA/RNA序列。
这些数据可以从公共数据库（如GenBank）或实验室内部的数据库获得。
2.确定引物长度：下一步是确定引物的长度。
通常，引物的长度在18到25个碱基对之间，相对长度和GC含量对于PCR引物尤为重要。
3.构建BLAST数据库：在设计引物之前，我们需要构建一个BLAST数据库。
选择适当的引物长度和需要比对的目标序列，将这些序列导入数据库中。
BLAST数据库可以通过使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）或其他Bioinformatics软件来构建。
4.查询引物序列：使用BLAST软件，将具有已收集的目标序列信息的引物序列输入到BLAST数据库中。
BLAST会在数据库中寻找与引物序列相似的序列。
基于比对结果，可以评估引物的特异性和亲合性。
5.分析BLAST结果：根据BLAST比对的结果，需要对引物进行评估和筛选。
主要考虑以下几个方面：-特异性:引物应该与目标序列非常特异性地结合，而不会与其他非靶DNA或RNA结合。
特异性可以通过比对结果中的E值（期望值）和匹配长度来评估。
-互补性:引物应与目标序列互补，以便正确结合并形成PCR产物。
通过比对结果来评估引物序列与目标序列的互补性。
- 引物结构: 引物应具有适当的物理参数，如长度、GC含量和熔解温度等。
这些特征可以使用Bioinformatics工具来评估和优化。
PCR引物流程设计详解
PCR引物流程设计详解PCR（Polymerase Chain Reaction）引物流程设计是在进行PCR反应过程中引物的设计。
PCR反应是一种体外的DNA复制技术，可在短时间内扩增特定DNA序列。
引物在PCR反应中起到了至关重要的作用，因此设计合适的引物是成功进行PCR反应的关键。
1.目标序列选择：首先需要明确PCR反应的目标序列，即要扩增的特定DNA序列。
选定目标序列后，需要使用相应的软件分析该序列的特性，如GC含量、碱基组成、互补性等。
这些特性将有助于引物的设计和优化。
2. 引物长度：引物的长度通常在18-30bp之间。
较短的引物能提高PCR反应的特异性，但较长的引物能提高PCR反应的特异性和效率。
引物长度不宜超过30bp，以免在PCR反应过程中产生副产物。
3. 引物序列设计：PCR反应通常需要设计两个引物，一个称为前向引物（forward primer），另一个称为反向引物（reverse primer）。
两个引物应该在目标序列两侧的互补区域上设计，以确保引物能够结合在目标序列的两端。
为了提高特异性，引物的3'端应尽可能与目标序列互补，而5'端则可根据需要进行一定的修改，如添加限制性酶切位点、引入Tm值调整等。
4.引物Tm值计算：Tm值可用于估计引物与目标序列结合的稳定性。
Tm值是引物在PCR反应中的解链温度，通常在50-60°C之间。
使用软件计算引物的Tm值时需要考虑引物的长度、碱基组成和浓度等因素，确保引物的Tm值相近。
5.引物特异性检验：根据引物设计的序列，使用引物设计软件进行特异性检验，确保引物只结合在目标序列上而不结合在其他非特定序列上。
特异性检验可通过引物序列的BLAST分析和二聚体结构预测等方法进行。
6.引物修饰：在一些情况下，可以根据需要对引物进行特定的修饰，以增强PCR反应的效果。
常见的修饰方法包括添加引物标记（如荧光标记）、引物末端修饰（如磷酸化）等。
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Premier 5强大的功能。
所以，设计引物的时候我们可以将两个软件结
合起来。
■软件使用前的准备工作
1、下载并安装Primer Premier 5和Oligo 6。
2.进入NCBI的基因库查找所需的基因序列。
序列的查找方法
CDS是编码序列，所以一般选择此序列作为设计的基因 源序列
给出的基因序列为全序列，设计引物只要CDS中的序列
Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。没有连线的，表示单条引物与该基因一致。
谢谢！
间。但是往往有时候达不到那么严格的要求
，因此我们可以适当放宽要求，但是二聚体 和发夹结构是不能有的，Tm值也不能相差超 过2 ℃ 。
Oligo 6引物结构分析
打开新序列
ctrl+v输入序列
3个弹出窗口
Melting temperature
∆G Internal Stability
Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
实时荧光定量 PCR引物设计及 相关软件使用
主要内容
1.背景
2.引物设计原则
3.常用引物设计软件
Premier 5和Oligo 6 介绍 5.引物BLAST
4.Primer
一、背景
■实时荧光定量PCR是通过实时监测PCR扩增产
物并进行分析的方法，它是在PCR反应体系
中加入荧光物质并通过real-time PCR检测
用Oligo 人工设计引物时的3个特点
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有 利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的 片段。 Δ G 值在5’端和中间值比较高，而在3’ 端相对低
输入引物
选中引物
上游引物
下游引物
引物结构分析 引物关键信息
引物二聚体 发夹结构
验。
Sense primer
3’
→
5’
Antisense primer
←
5’ 3’
二、引物设计原则
引物的设计原则可以根据实际需求自己灵活 把握。
三、常用的引物设计软件
Primer Premier 5（自动搜索）* Oligo 6 （引物评价）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer 3 （在线服务）
，
，
比对条件设置
3、比对结果
图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分 匹配的得分值位于80～120分， 分值越高，特异性越好。线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。
图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（
最终 PCR 信息
五、引物BLAST
判断一个引物是否合适最重要的一步就是比对，如 果你所设计的的引物通过比对不能返回到你设计引
物的源基因，那么你的引物就是不合格的，即使你
设计出来的引物其余的条件都符合，必须放弃。
1.进入BLAST界面
2、输入引物对
引物对要从5 端到3 端输入，上游引物和下游间输入20以上n
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
保存引物信息
保存时要安装一个虚拟打印机
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结 构，因此最好的情况是最下面的分析栏都没 有出现红色，而且评分较高，Tm值55-60℃之
四、Primer Premier 5 和Oligo 6介绍
■ Primer Premier 5主要功能： 1、引物自动搜索和设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
Oligo 6主要功能：引物设计与分析
■Primer Premier 5 和Oligo 6比较 Primer Premier 5在引物搜索上较Oligo 6有 优势，并可以对引物序列进行综合评分。 Oligo 6在引物结构分析上有比Primer
系统对PCR产物反应进程中的荧光信号进行
实时监测，最终对实验数据进行分析处理
的方法。
■引物是该技术中至关重要的一环。使用不合
适的引物容易导致实验失败：表现为扩增出 目的条带之外的多条带（如形成引物二聚体
带），不出带或出带很弱等。引物可以通过
参考文献获得，也可以进行自己设计，无论
哪种方式引物都是要通过计算机软件进行检
GC含量 错配信息 PCR 总信息
引物筛结构分析条件
1.Key Information：3，端得△G≤9kcal/mol。Tm尽量一 致，最好控制在55 ℃ ～60℃。 2.Duplex Formation：≤3base， △G≤4.5kcal/mol 。 3.Hairpin Formation： ≤3base，△G≤4.5kcal/mol 。 4.GC%：GC含量在40～60%之间，两条引物最好保持 一致。 5.False priming sites：要使错误引发效率在100以下，当 然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400 ～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以 接受。
Primer Premier 5引物搜索
选择序列
Preimer Premier 启动界面
基本信息
源序列 序列名称
输入序列
只能用ctrl+v才能输入目的序列
引物设计界面
上游和下游链
引物信息栏
引物搜索选项设定
引物类型 搜索模式 引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
搜索结果