引物设计流程

间。但是往往有时候达不到那么严格的要求
，因此我们可以适当放宽要求，但是二聚体 和发夹结构是不能有的，Tm值也不能相差超 过2 ℃ 。
Oligo 6引物结构分析
打开新序列
ctrl+v输入序列
3个弹出窗口
Melting temperature
∆G Internal Stability
Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
验。
Sense primer
3’
→
5’
Antisense primer
←
5源自文库 3’
二、引物设计原则
引物的设计原则可以根据实际需求自己灵活 把握。
三、常用的引物设计软件
Primer Premier 5（自动搜索）* Oligo 6 （引物评价）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer 3 （在线服务）
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
保存引物信息
保存时要安装一个虚拟打印机
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结 构，因此最好的情况是最下面的分析栏都没 有出现红色，而且评分较高，Tm值55-60℃之
Primer Premier 5引物搜索
选择序列
Preimer Premier 启动界面
基本信息
源序列 序列名称
输入序列
只能用ctrl+v才能输入目的序列
引物设计界面
上游和下游链
引物信息栏
引物搜索选项设定
引物类型 搜索模式 引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
搜索结果
用Oligo 人工设计引物时的3个特点
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有 利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的 片段。 Δ G 值在5’端和中间值比较高，而在3’ 端相对低

输入引物
选中引物
上游引物
下游引物
引物结构分析 引物关键信息
引物二聚体 发夹结构
GC含量 错配信息 PCR 总信息
引物筛结构分析条件
1.Key Information：3，端得△G≤9kcal/mol。Tm尽量一 致，最好控制在55 ℃ ～60℃。 2.Duplex Formation：≤3base， △G≤4.5kcal/mol 。 3.Hairpin Formation： ≤3base，△G≤4.5kcal/mol 。 4.GC%：GC含量在40～60%之间，两条引物最好保持 一致。 5.False priming sites：要使错误引发效率在100以下，当 然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400 ～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以 接受。
最终 PCR 信息
五、引物BLAST
判断一个引物是否合适最重要的一步就是比对，如 果你所设计的的引物通过比对不能返回到你设计引
物的源基因，那么你的引物就是不合格的，即使你
设计出来的引物其余的条件都符合，必须放弃。
1.进入BLAST界面
2、输入引物对
引物对要从5 端到3 端输入，上游引物和下游间输入20以上n
Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。没有连线的，表示单条引物与该基因一致。
谢谢！
，
，
比对条件设置
3、比对结果
图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分 图中②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分 图中③代表这些序列与引物匹配的得分值位于80～120分， 分值越高，特异性越好。线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。
图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（

四、Primer Premier 5 和Oligo 6介绍
■ Primer Premier 5主要功能： 1、引物自动搜索和设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
Oligo 6主要功能：引物设计与分析
■Primer Premier 5 和Oligo 6比较 Primer Premier 5在引物搜索上较Oligo 6有 优势，并可以对引物序列进行综合评分。 Oligo 6在引物结构分析上有比Primer
Premier 5强大的功能。
所以，设计引物的时候我们可以将两个软件结
合起来。
■软件使用前的准备工作
1、下载并安装Primer Premier 5和Oligo 6。
2.进入NCBI的基因库查找所需的基因序列。
序列的查找方法
CDS是编码序列，所以一般选择此序列作为设计的基因 源序列
给出的基因序列为全序列，设计引物只要CDS中的序列
实时荧光定量 PCR引物设计及 相关软件使用
主要内容
1.背景
2.引物设计原则
3.常用引物设计软件
Premier 5和Oligo 6 介绍 5.引物BLAST
4.Primer
一、背景
■实时荧光定量PCR是通过实时监测PCR扩增产
物并进行分析的方法，它是在PCR反应体系
中加入荧光物质并通过real-time PCR检测
系统对PCR产物反应进程中的荧光信号进行
实时监测，最终对实验数据进行分析处理
的方法。
■引物是该技术中至关重要的一环。使用不合
适的引物容易导致实验失败：表现为扩增出 目的条带之外的多条带（如形成引物二聚体
带），不出带或出带很弱等。引物可以通过
参考文献获得，也可以进行自己设计，无论
哪种方式引物都是要通过计算机软件进行检