脂肪酸的β-氧化

实验二十六 脂肪酸的β-氧化
一、实验目的
（1）理解脂肪酸的β-氧化作 用。 （2）了解测定丙酮含量的原理。
二、实验原理
脂肪酸β-氧化是脂类分解代谢的主要途径，在动物肝脏中进行。 脂肪酸经β-氧化生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙 酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、 β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。 本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定，即用 过量的碘（定量）在碱性的条件下与丙酮反应，生成碘仿。以标准硫 代硫酸钠（Na2S2O3）溶液在酸性环境中滴加剩余的碘，从而可计算出 丙酮的生成量。反应式如下： 2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3（碘仿）+CH3COONa+2NaOH 剩余的碘，可用标准Na2S2O3溶液滴定。 NaIO+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 由（1）、（2）、（3）、（4）的化学反应方程式可得出： ICH3COCH3～3NaIO ～ 3I2 ～6 Na2S2O3 因此每消耗1mol的Na2S2O3相当于生成1/6mol的丙酮；根据滴定样品与滴 定对照所消耗的Na2S2O3溶液体积之差，可计算出由丁酸氧化生成丙酮 的量。
三、仪器和试剂
1、器材
恒温水浴、5mL微量滴定管、移 液管、镊子和剪刀、匀浆器、50mL锥 形瓶、漏斗、滤纸、家兔。
2、试剂
1、0.5%（m/V）淀粉溶液 2、0.9%（m/V）NaCl溶液 3、0.5mol/L丁酸溶液 4、15% （m/V）三氯乙酸溶液 5、10% （m/V）氢氧化钠溶液 6、10% （V/V）盐酸溶液 7、0.1mol/L碘溶液:称取碘12.7g和KI 25g,溶于蒸馏水中， 稀释到1000mL,混匀，用标准0.05mol/mLNa2S2O3溶液标 定。 8、标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液：临用时将已标记的 0.05mol/LNa2S2O3溶 液稀释成0.01mol/L. 9、1/15 mol/L pH7.6磷酸缓冲液：1/15 mol/LNa2HPO4 溶液86.8mL与1/15 mol/LNaH2PO4溶液13.4mL混合。
四、实验步骤
1、肝糜制备 （1）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用 0.9%NaCl溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。 （2）称取肝组织5g置研钵中，加少量0.9%NaCl 溶液，研磨成细浆。再加0.9%NaCl溶液至总体积 10ml，得肝组织糜。
2、酮体生成和沉淀蛋白质 取50ml锥形瓶2只，编号，并按下表操作。
试 剂 3 2 锥 形 瓶 编 号
1号（样品）
V(1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲 液)/ml V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml
2号（对照）
3 -
V(肝组织糜)/ml V(15%三氯乙酸溶液)/ml
V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml
2
混匀，置于43℃恒温水浴内保温1.5h
2 3
2
3
-
混匀，静置15min，过滤，滤液分别收集于2支试管中
3、酮体的测定
另取50ml锥形瓶2只，编号，并按下表操作。
试 V(1号滤液)/ml V(2号滤液)/ml V(0.1mol/L碘溶液)/ml V(10%氢氧化钠溶液)/ml V(10%盐酸)/ml 剂 2 3 3 混匀，静置10min 3 3 锥 形 瓶 编 号
A号（样品）
B号（对照）
2 3 3
V(0.5%淀粉溶液)/滴
3
3
混匀后立即用0.01mol/L标准的硫代硫酸钠溶液滴定剩余的 碘，滴至浅黄色时，记录滴定A瓶与B瓶溶液所用硫代硫酸钠溶 液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮含量。 4、计算 肝脏的丙酮含量（mmol/g）=（V对照-V样品）×C Na2S2O3 ÷6 式中：V对照为滴定对照所消耗的标准Na2S2O3溶液的体积，以mL 为单位； V样品为滴定对样品消耗的标准Na2S2O3溶液的体积，以mL 为单位； C Na2S2O3为标准Na2S2O3溶液的浓度（mol/L）。
五、注意事项
1、所用材料必须新鲜，以保证肝细胞内酶的活性； 肝组织要在冰浴中研磨成匀浆。 2、在43℃恒温水浴内保温，其目的是在酶的作用 下使丁酸充分反应；三氯乙酸的作用是使肝匀 浆的蛋白质、酶变性，发生沉淀并终止反应。 3、为减少误差，应尽量缩短滴定样品瓶和对照瓶 的时间间隔；滴定终点均为浅黄色，滴定结束 后样品平和对照品中溶液颜色应一致。
六、思考题：
1.生物体内脂肪酸是如何转变为酮体的？ 2.与正常生理状态相比，如果测定的血液 中酮体含量很高，说明什么问题？有何生 物学意义？