纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准纤维素酶活力测定方法张瑞萍 南通工学院(226007)摘　要　用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。

确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。

结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。

叙　词:　测试　纤维素酶　活度中图分类号:　TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。

纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。

我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。

由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。

本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。

1　实验方法1.1　化学药品、材料纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。

1.2　FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。

酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。

1.3　针织物酶减量率的测定将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。

减量率=处理前织物干重-处理后织物干重处理前织物干重×100%2　结果与讨论2.1　显色剂的选择选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。

碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下:O 2NOHO 2NCO OH +还原糖　H 2N OH CO OHO 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。

2.2　最大吸收波长的确定选取490～580nm 波长对显色液进行比色。

由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。

为了排除DNS 的干扰,选择在波长530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。

图1　D NS 与葡萄糖的吸收曲线2.3　底物及酶本身含糖量的影响在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。

而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。

为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。

2.4　葡萄糖标准曲线用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。

标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。

38印　染(2002No .8) www .cdfn .com .cn 图2　葡萄糖标准曲线2.5　底物的选择对酶活力的影响目前理论认为,大多数由微生物产生的纤维素酶是一个多组分酶系,主要含有三种组分:内切- -1,4-葡聚糖酶、外切 -1,4-葡聚糖酶和 -1,4-葡萄糖苷酶。

其中,内切(endo-)酶能进攻纤维素大分子链的中间部位,任意地切断大分子,而生成较短的链;而外切(ex o-)酶仅从纤维素大分子链的非还原性末端切下一个个纤维二糖; -葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催化分解成葡萄糖。

纤维素酶复合体与纤维素纤维作用的最终效果,是由其中各种酶综合作用所决定的。

作为底物的滤纸其结构较为松散,可及区较多,非还原性末端也较多,容易同时被内切酶和外切酶降解,再由 -葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖。

用比色法定量测定还原糖的生成量,可反映纤维素酶的总酶活力。

由于外切酶对纤维素链专一性高,而内切酶专一性较低,在降解羧甲基纤维素(CMC)时,主要是反映内切酶的活力。

我们选择三种酸性纤维素酶,分别以滤纸和CM C 为底物,其酶活力(FPA和CM C ase)的测试数据结果如表1所示。

表1　不同酶种的滤纸酶活(FPA)和C MC酶活(CMC ase)酶活, 杰能科NOVO L PLU S LFPA71.6330.9227.27CM C ase528.16417.40327.83 从表1可知,CMCase和FPA两种酶活的大小顺序是:杰能科>NOVO L>PLUS L。

这几种酶的内切酶活(CM C ase)较高,且比总酶活(FPA)大,几乎相差一个数量级,这说明酶对水溶性底物有很高的活力.而滤纸与酶属多相催化,酶也是高分子物,所以反应的空间阻碍较大,这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。

2.6　纤维素酶活与织物酶减量率的关系用这几种酶对织物进行整理,织物的减量率与酶种及酶量的关系如图3所示。

从图3可看出,当三种酶的用量分别为2%、4%、6%、8%、10%(ow f)时,对应的减量率的比值平均(杰能科∶NOVO L∶PLUS L =1∶0.87∶0.76),这与不同酶的CM C ase酶活比值(杰能科∶NOVO L∶PLU S L=1∶0.79∶0.62)是相近的。

图3　酶用量对减量率的影响2.7　纤维素酶活与酶用量的关系从图3看出,不同酶种在织物上获得相同减量率时的酶用量如表2所示。

表2　不同酶种相同减量率的酶用量单位:%(o wf)酶种减量率,%1234杰能科0.6528 1.7970 3.1578 4.9424NOVO L0.8115 2.1057 3.7156 6.1567PLUS L 1.0272 2.5678 4.6404- 从表2知,织物减量率为1%、2%、3%、4%时的酶用量比值平均为:杰能科∶NOVO L=(0.83∶1),杰能科∶PLUS L=(0.67∶1)。

这与不同酶的CM C ase酶活比值(杰能科∶NOVO L∶PLUS L=1∶0.79∶0.62)也是一致的。

从纤维素酶活CMCase与织物的酶减量率和酶用量的关系发现,织物的酶减量率与内切酶活(CM C ase)关系密切。

所以,在实际生产中,使用不同牌号的纤维素酶时,制订处方要根据酶活力,特别是内切酶活力的大小,通过测定织物的整理效果来决定。

3　结论3.1　试验表明,葡萄糖浓度与吸光度OD值的相关系数在0.9991,确定该标准曲线可用于酶活力测定。

3.2　确定DNS为显色剂,酶活力测定用波长为530 nm,参比溶液为失活酶、底物和DNS等共热反应物。

3.3　底物不同,活力的测定值也不同。

以羧甲基纤维素为底物测得的酶活值CMC ase,比以滤纸为底物测得的酶活值FPA高。

这说明酶对水溶性底物有较高的活力,同时也表明,吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。

3.4　对于不同牌号的纤维素酶,织物酶减量率与内切酶活(CM Case)有密切的比例关系。

(收稿日期:2002-03-15)39　纤维素酶活力测定方法 印　染(2002No.8)DYEING AND FINISHING(Monthly) Vol.28,No.8,Aug.,2002 feasi ble and more stabl e shade than tw o bath process.Key Terms　Dip d y eing　One bath method　Disp erse dye　Reactive d y e ……………………………………………………………………………………………………………………………Li Congyuan(28) Enzyme Treatment of Silk-Ramie Mixture FabricEnzyme treatment of silk ramie mixture fabric w i th cell ula se was ca rri ed out.The opti mum process condition to control enzyme finish w a s studi ed.Key Terms　Finish　Cellulase　Mixture f abric　Ramie　M ulberry silkworm …………………………………………………………………………………………………………………………Huang C uirong(30) Clean Production of Lyocell Dyeing and FinishingBased on the practice production,the possi bili ty of clean producti on of dyeing and finishing to Lyocell fabric was discussed.The process of envi ronmental friendly production for Lyocell fab ri c was determ i ned.Key Terms　D yeing and f inishing　Environmental protection　Cellulose f iber　Lyocell ……………………………………………………………………………………………………………………………Gao Peng et al(33) The Application of Alkali Deweighting Process to LiningsIn this a rti cl e,soft and ela stic l ini ngs substrates employed super micro polyester DTY in b oth weft and w arn yarns.The alkali deweighti ng process w a s moni tored by rea l ti m e on li ne system on high temperature pressure overflow dyeing machine. The process parameters w ere a nal yzed and the suitable process was summ a rized.Key Terms　Base deweighting f inish　Process p arameters　Padding cloth ………………………………………………………………………………………………………………………………Du Shuf ang(36)・MEASURING TEC HNIQUES・Activity Determination of CellulaseUsing DNA a s developer,fil ter pa per a nd CM C as base,the activity of cell ula se was determ i ned and compared by FPA and CM Case,under the conditi on of w avelength530nm,and usi ng deacti vati on enzyme,ba se,D NS as reference solution.The result showed that the activity of cel lul ase of CM Case was hi gher tha n that of FPA.Thi s m eans that cell ula se ha s higher acti vity to sol ubl e base.As for different cellulase with di fferent trademark,there is close rel ationship betw een dewei ghting rate of cell ul ase and activity of CM C.Key Terms　Testing　Cellulase　Activity …………………………………………………………………………………………………………………………Zhang Ruiping(38)・LECTURES・Anti-Mite Finish of Textiles(II)Anti mite finish of textil es w i th chemicals can reduce breedi ng of i ndoor mite a nd i mprove the indoor sanitati on.The sym bi osis of i ndoor mi croorgani sm,kinds of mite and its harm,anti mite agents,test method of anti mite effects a s well as the anti mi te effect using carboxyl ic ester are all i ntroduced.Key Terms　Anti-microbial f inish　Chemical f inish　Textile …………………………………………………………………………………………………………………………Yang Dongliang(40)・COMPREHENSIVE REVIEW・Progress and Developments in Reactive Dyestuf f and Its Dyeing Process(Ⅶ)The progress i n reactive dyestuff w a s reviewed.This included col or b odi es,reactive groups,especia lly the relati onships betw een eco dyeing properties a nd d yestuff structure.The relati onshi ps betw een m i xture,after treatment of dyestuffs and sha de,deep dyeing,washabil ity a nd col or fastness w ere ana lyz ed.It is pointed out tha t ra tional mixture of dyestuff i s a feasi ble technique w hi ch is not only for dyestuff manufacture,but a lso for the appli cati on of the dyestuff.The devel opments of rea cti ve dyestuff process w ere review ed i n the second part of this paper,for i nsta nce the relati onshi ps betw een substanti vity and l ow salt dyei ng,l evel ling dyeing a nd control led dyeing,deep dyeing a nd deep shad e dyestuff,col or fastness a nd fast col ors.At la st,the dyeing processes of new fiber,non cellulose fiber and multi components fiber w ere introduced.The achievements a chi eved by the author in some research fi el ds w ere introduced.Key Terms　D yeing　Reactive d y e　Technique　Develo pmentSong Xinyuan et al(44)………………………………………………………………………………………………………………………・OVERSEAS NEWSBRIEFS・・DOMESTIC NEWSBRIEFS・・ABSTRACT OF DYEING AND FINISHING・………………………………………………………………………………………………………Advertising Index(53) 54。