骨髓间充质干细胞培养
骨髓间充质干细胞总结
2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。
一、骨髓间充质干细胞的分离目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
1. 直接培养法（全骨髓培养法）1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增2 0-30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7 -10天传第一代，以后2-3天传代。
培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1:1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。
布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟，换液去除悬浮细胞（2）原代培养24h,48h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。
骨髓间充质干细胞形态
骨髓间充质干细胞形态
骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）是一类来源于骨髓的多能干细胞，具有广泛的应用前景。
BM-MSCs具有多向分化潜能，可以分化为成骨
细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型，因此在组织工程、再生
医学、免疫治疗等领域有着广泛的应用。
BM-MSCs的形态特征是细胞体积较大，呈梭形或星形，细胞质丰富，核浆比例低，核染色质较少，细胞质内含有丰富的细胞器，如线粒体、内质网、高尔基体等。
此外，BM-MSCs表面具有多种细胞表面标志物，如CD29、CD44、CD73、CD90等，同时不表达CD34、CD45
等造血干细胞标志物。
BM-MSCs的分离和培养需要特定的培养基和条件。
目前常用的培养
基包括DMEM/F12、α-MEM等，通常添加10%的胎牛血清或人血清，以及一定浓度的抗生素和抗真菌剂。
在培养过程中，需要控制细胞密
度和培养时间，以保证细胞的生长和分化。
BM-MSCs的应用前景非常广泛。
在组织工程领域，BM-MSCs可以
用于修复骨、软骨、肌肉等组织缺损，同时也可以用于修复心肌、神
经等组织缺损。
在再生医学领域，BM-MSCs可以用于治疗糖尿病、
肝病、肾病等疾病。
在免疫治疗领域，BM-MSCs可以用于治疗自身
免疫性疾病、移植排斥等疾病。
总之，BM-MSCs是一类非常有前途的干细胞，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和研究的深入，相信BM-MSCs将会在更多的领
域得到应用。
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
实验准备：1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。
2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器操作步骤1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。
以后每两天换液1次，并观察细胞形态。
待细胞长至80%-85%时传代（1传2）2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速。
采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
骨髓间充质干细胞的分离与培养：本刊中文部
７ 建 立 大 鼠骨 髓 间 充质 千 细胞 稳 定 分 离培 养
体 系 与鉴 定
２ 密度 梯 度 离 心与 贴 壁 筛选 法 体 外 分离 培 养 胎 儿骨 髓 间充质 干细 胞
杨丽（ 暨南 大学药 学院 中药 学教研 室 ，广 东省 广
州市 ５１ ６３ ） ０ ２
王 美华（ 解放 军军事 医学科学院附属 医院消化
ｄ ｉ ０３ ６ ／ｉ ｎ ６ ３８ ２ ．０ ０ ６ ３ ｏ ｌ ９ ９ ｓ ． ７ —２ ５ １ ． ． ９ ： ｊ ｓ １ ２ ０ ０
中图分类 号： ３ ４２ 文献标识码： Ｒ９ Ｂ 文章编 号： ６ ３８ ２ （０ ００ —１ ３ ・４ １ ７ —２ ５２ １ ）６０ ４ ０ １
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骨髓 间充质 干细 胞 的分 离与培 养 ：本刊 中文部
１ 改 良小 鼠 骨髓 问 充 质干 细 胞 培养 方 法 及 长 效 荧光标 记 的可行 性
异 性 磷 脂 酶 Ｄ 的活 性 与 ｍＲ Ａ 变 化 一 致 ， Ｎ
其表达水平与急性 白血病类型及急性髓系白
血 病 患 者 有 无 肝 脾 和， 淋 巴结 肿 大 有 关 。 或
摘要
背景 ：据作者查新检索 ，国内外有关 急性 白 血病骨髓单个核细胞糖基化磷脂酰肌醇特异 性磷脂酶 Ｄ活性及 ｍＲ Ａ 表达与 白血病类 Ｎ 型 、患 者 肝 脾 淋 巴结 肿 大 关 系 的 报 道 罕 见 。
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。
用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。
用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定目的分离培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs），体外观察其生长特性。
方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物。
结果纯化的hBMSCs 贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增殖能力，流式细胞仪分析P3代hBMSCs 稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73，CD90和CD105等。
结论本实验分离培养的hBMSCs具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记。
Abstract：Objective To isolate and culture human bone marrow derived mesenchymal stem cells（hBMSCs），and to observe biological characteristics of hBMSCs. Methods Bone marrow mononuclear cells were separated by the method of density gradient centrifugation and MSCs were obtained by adhere culture.The cell morphology and their growth characteristics in vitro were observed under an inverted phase contrast microscope and the cell cycles were tested by flowing cytometry. Mesenchymal like stem cells were identified by surface marker with flow cytometry.Results hBMSCs were adhered like a fibroblast morphology and with pool like growth alinement.Flow cytometry showed that the third passage cells were positive for CD73，CD90and CD105 expression.Conclusion The MSCs from bone marrow in this study show great capability of proliferation.Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells；Separation；Culture and identification间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞。
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养
骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养准备工作（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。
（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG 培养液（美国GIBCO）（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。
实验前准备（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。
配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。
（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。
（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
穿隔离衣，戴手套。
用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。
点燃酒精灯，安装吸管帽。
实验步骤（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。
依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。
细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。
（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法
骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养鉴定方法主要包括以下步骤：**一、分离方法**1. **差速贴壁法**：利用BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁性能差异及酶消化敏感性差异进行分离。
这种方法快速、简单、经济，但细胞纯度可能相对较低。
2. **密度梯度离心法**：基于骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选。
通过流式细胞术检测，细胞表面抗原表达CD105，CD73和CD90必须≥95%，同时表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α，或CD19和HLA － DＲ必须≤2%。
**二、培养方法**培养BMSCs的难点在于保持细胞活性。
不同种属来源的BMSCs在体外培养扩增方法基本相似，但细微的营养条件、培养环境等差异都将会对细胞性能产生影响。
**三、鉴定方法**1. **细胞形态学观察**：利用组织块贴壁法、酶消化法或其结合来分离MSC，并通过传代培养进行形态学观察。
几乎所有的MSC都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力。
MSC多数呈纤维细胞样生长，少量呈梭形或不规则三角形。
2. **表面标志物鉴定**：采用流式细胞仪对MSC的细胞表型进行鉴定。
MSC的表面抗原具有非专一性，可以同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。
MSC的细胞表面标志物鉴定标准为：CD105、CD73和CD90的阳性率≥90%；而CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR 呈阴性，阳性率≤5%。
综上所述，骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定是一个复杂的过程，涉及多个步骤和专业的技术操作。
在进行这些操作时，需要严格遵守实验规程，确保实验的准确性和安全性。
同时，对实验结果的解读也需要具备一定的专业知识和技能。
骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定
骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定骨髓间充质干细胞是一类非常重要的细胞种类，它们具有广泛的应用前景，主要用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。
然而，要在这些应用中实现骨髓间充质干细胞的有效利用，就必须先进行骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定，以保证获取的细胞具有较大的纯度和生物活性。
骨髓间充质干细胞的分离纯化骨髓间充质干细胞的分离纯化方法主要包括直接培养法、贴壁法、悬浮式培养法等。
其中，直接培养法是一种直接将骨髓细胞培养在培养皿中的方法，通过贴壁式培养，使不同种类的细胞在培养皿上生长，最终使骨髓间充质干细胞附着在培养皿底部，其他细胞则浮于培养液中，从而达到分离骨髓间充质干细胞的目的。
贴壁法则是利用骨髓间充质干细胞具有较好的贴壁性质，将其分离于不贴壁的其他细胞种类中，一般会在6~8小时内附着于培养皿的底部，形成典型的纤维形状。
悬浮式培养法则是将骨髓间充质干细胞分散在培养液中悬浮生长，并加入一些特定因子，使其在悬浮状态下生长和增殖，最终达到分离目的。
骨髓间充质干细胞的鉴定骨髓间充质干细胞的鉴定是指对所分离的骨髓间充质干细胞进行鉴定和确认。
其主要包括形态学、生物学、遗传学和免疫学等多个方面的检测方法。
形态学方面的检测方法主要是通过显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态、生长状态和细胞密度等指标进行判断。
生物学方面的检测方法主要包括蛋白质组学、基因组学、代谢学等多个层面的检测指标，以确定其代谢状态、生长状态、分化能力和功能表达等信息。
骨髓间充质干细胞在临床应用中的应用前景骨髓间充质干细胞广泛应用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。
其中，在组织工程领域，骨髓间充质干细胞可用于修复或重建骨组织、肌肉组织、软骨组织等，并可通过工程化的方法向特定的细胞类型分化，以进一步提高治疗效果。
在再生医学领域，骨髓间充质干细胞可以通过再生医学的手段，促进身体的再生或再生，重建病变组织或器官等。
在免疫治疗领域，骨髓间充质干细胞可以作为免疫干预剂，通过调节机体免疫状态，对肿瘤、自身免疫性疾病等疾病产生治疗效果。
人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定
ＤＡＩＷ ｅ — ａ ｎ ｄ ，ＦＡＮＧ ｏ ｌ ，ＬＩＸｉ ｅ ，ＬＩ Ｈｏ ｇ，ＤＯＮＧ ｉｎ Ｔａ －ｉ ｎ — ｉ ｌ Ｎ ｎ Ｊａ Ａ，ＣＨＥＮ ｈ ｎ －ｏ ｇ Ｚ ｅ ｇｒ ｎ
（ ｐ ｒ ｎ ｒ ｏ ａ ｄ ｃ ，Ｚ ｏ ｇ ｈ ｎＨｏｐ ｔ ｌ ｅ ａ ｔ ｎ ｆ Ｓ ｒ ｅ ｙ， Ｄｅ ａ ｔ ｔ ｆ Ｏ ｔ ｐ ｅ ｉ ｍｅ ｏ ｈ ｓ ｈ ｎ ｓａ ｓ ｉ － ｐ ｒ ａ Ｄ ｍｅ ｔ ｕ ｇ ｒ ｏ
戴 达 涛 李熙 林 红 健 陈 嵘 文 方 林 雷 董 峥
（ 复旦 大学 附属 中山医院骨科 一复旦大学上海 医学院外科学系 上海 ２０３ ） ０ ０ ２
【 摘要】 目的 定 。方法
探索一个高效分 离和扩 增人 骨髓 间充 质干细 胞的方 法 ， 通过形 态 学和 多向分 化能 力进 行鉴 并
ｇｌｃ ｒ ｐ ｓ ｈａ ｅ Ｌ－ ｓ ｏ ｂ ｃ ｃｄ ２ ｐ ｓ ｈ ｔ ｙ ｅｏ ｈｏ ｐ ｔ ， ａ ｃ ｒ ｉａ ｉ－ 一 ｈｏ ｐ ａ ｅ，ｄ ｘ ｍ ｅ ｈ ｓ ｎ ｎ ｅ ａ ｔ ａ ｏ ｅ ａ ｄ ＦＫ５ ６；ｔ ｈ ｎ ｒ ｃ ｔ ｓ ｂ ０ Ｏ ｃ ｏ ｄ ｏ ｙ ｅ ｙ ＴＧＦ－ ｂ ｔ ｅａ ３，ｒ ｃ ｍ ｂ ｌｎ，ｓ ｄ ｕ ｙ ｕ ａ ｅａ ｄ ｓ ｌｎｏ ｓ ａ ｉ ｅｏ ｕｉ ｏ ｉｍ ｐ ｒ ｖ ｔ ｎ ｅ ｅ ｉｕ ｃｄ；ｔ ｄｐ ｃ ｔ ｓｂｙ Ｉ Ｏ ａ ｉｏ ｙ ｅ ＢＭ Ｘ ｎ ｎｄ ｍ ｅ ｈ ｃｎ；ｔ ａ ｄｉ ｏ ｔ ａ ｉ Ｏ
BMSCs成脂成骨分化实验总结
骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及成脂、成骨诱导分化一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS 平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。
2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。
3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。
4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。
5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。
原代培养6-7d 后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。
图1：BMSCs原代培养6-7d二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM 地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。
3d换液1次，分化12d。
待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。
成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。
图2：BMSCs成脂诱导5d三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM 地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。
实验项目一猪骨髓间充质干细胞的分离和培养
猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验准备：器材:手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳,5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75µg/ml青霉素，50µg/ml硫酸链霉素）1000iu/ml青链霉素的PBS(生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中)无血清低糖DMEM。
2%台盼蓝染液材料采集：一,胎猪骨髓采集：【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室.2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织;用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌肉和骨膜,得到完整的股骨.立即用含有1。
0ml DMEM+3000iu/ml肝素的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再加入等量培养液（DMEM+10％FBS)稀释，然后以1：4比例缓慢加入到Percoll分离液（1。
073g/ml）的表面，1000r/min 30min，小心吸取乳白色的有核细胞层。
目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和贴壁筛选法。
密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。
Percoll密度梯度离心法根据细胞密度不同将细胞分为数层,因此得到的MSCs纯度较高，但是操作繁琐,而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活性较强.【13】来自：胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离取2—3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3—4遍;用吸有4ml а-MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射器刺入处理好的股骨的一端,冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次,使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞,100目滤沙过滤；1000rpm/min,离心5min,用а—MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核细胞的密度为1-2x107/ml。
小鼠骨髓间充质干细胞原代培养PPT课件
细胞生长曲线的绘制与分析
生长曲线绘制
通过定时记录细胞数量或密度，绘制出细胞的生长曲线，反映细 胞的生长规律和生长速率。
生长速率分析
分析生长曲线的变化趋势，计算细胞的生长速率，为优化培养条件 和提高细胞产量提供依据。
生长周期
通过生长曲线的绘制和分析，了解细胞的生长周期和倍增时间，有 助于控制细胞的传代和扩增。
细胞分裂增殖情况
观察细胞分裂增殖的情况，有 助于了解细胞的增殖能力和生 长潜力，为后续实验提供依据
。
细胞形态的观察与描述
细胞形态
在显微镜下观察细胞的形态，包括细胞大小、形 状、染色深浅以及核质比例等特征。
描述方法
采用专业术语和描述方式，准确描述细胞的形态 特征，为细胞鉴定和分类提供依据。
形态变化
在培养过程中，观察细胞形态的变化，有助于了 解细胞的生长和分化情况。
细胞计数与接种
对分离出的细胞进行计数， 并按照适当的密度接种到 培养容器中。
培养容器
选择适当的细胞培养容器， 如细胞培养瓶、平板等。
培养条件与维持
温度与湿度
将培养容器放置在恒温、恒湿的 培养箱中，保持温度和湿度适宜。
பைடு நூலகம்
气体环境
控制培养箱内的气体环境，如CO2 浓度，以维持培养基的pH值。
换液与传代
定期更换培养基，并适时进行细胞 的传代，以维持细胞的生长状态。
基础培养基
选择适合细胞生长的基础培养基，如 DMEM、RPMI等。
培养基的灭菌与储存
确保培养基经过严格灭菌，并在无菌 条件下储存。
添加成分
根据细胞类型和培养需求，添加适量 的生长因子、抗生素等。
细胞接种与培养
细胞分离
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骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
取融合至90%左右生长状态良好第3代骨髓 间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心、细胞 计数，调整待测样本细胞数为1×109 L-1，分 装至各PE管中，依次加入单克隆抗体CD44、 CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每 管设立同型阴性对照组(对照组中不加任何抗体)。 常温避光孵育40 min，PBS冲洗细胞，细胞重 悬，经流式细胞仪检测分析。
实验方法
1、骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养 2、骨髓间充质干细胞的形态学观察 3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制 4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化
骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸 泡于体积分数为75%乙醇消毒30 min，于超净台无菌 操作下取其双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干 骺端，用10 mL注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗 骨髓腔，收集经细胞筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min。弃上清，以 1×109 L-1的细胞浓 度接种于25 cm2塑料培养瓶，置于37℃、体积分数为 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后全量换液， 2，5 d分别半量换液，7 d全量换液。待培养瓶中细胞 分裂增殖80%-90%汇合单层时用1.5 mL TrypsinEDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入5 mL的含血 清培养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心 5 min。弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的 LG-DMEM培养基，将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行 传代。
骨髓间充质干细胞的形态学观察
取原代和第8代细胞，每日用倒置相差显微镜 观察其生长形态及特征并照相记录。取生长良好 的细胞于含10%二甲基亚砜的血清中冻存，2周 后复苏，锥虫蓝拒染实验检测死亡及存活细胞， 继续于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培 养。
骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
取第1，3代细胞，胰酶消化后计数，以 5×104个/孔接种于96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃，饱和湿度，体积分数为 5%CO2培养箱孵育2 h后，用酶联免疫检测仪 于450 nm波长下检测吸光度值。然后在检测第 1，2，3，4，5，6，7天同一时间作相同检测。 根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。
结果
刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中，细胞呈圆形，大小不一。接种 24 h后开始贴壁，通过更换培养液，去除悬浮未贴壁细胞，48 h后贴壁细胞逐渐伸展为 梭形、多角形、不规则圆形，排列不规则(图1A)。7 d后，贴壁细胞显著增多，以小圆形 和梭形细胞为多，部分细胞排列趋于平行，部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充质 干细胞生长较原代细胞快，以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代，细胞增殖活力未 见明显变化，主要以大而铺展的多形细胞为主(图1D)。
全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨 髓间充质干细胞
省科学技术计划项目
主要内容
1.前言 2. 实验方法 3. 结果 4. 结论
前言
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体 移植、体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分 化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合 组织和细胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨 髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，如 何为组织和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干 细胞成为国内外学者研究的重点。 依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴 壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养 、增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软 骨、成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组 织工程奠定实验基础。
结论
上述实验结果证实，体外分离培养的SD大鼠 骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞而非其 他造血谱系干细胞，并建立了一套简单、有效、 获得纯度较高的骨髓间充质干细胞分离培养、增 殖、鉴定的方法。传代至第3代时，可获得纯度 高、数量足、生物活性高的骨髓间充质干细胞， 为本研究课题进一步实验研究奠定了实践基础以 及提供了数量充足的种子细胞。
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以 5×107 L-1接种于24孔板，待细胞贴壁生长融 合至70%-80%时，向各诱导孔中分别加入成 骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维 生素C-2磷酸钠)，成软骨细胞诱导剂(含地塞米 松、转化生长因子β、维生素C)，成脂细胞诱导 剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)。各诱导孔 定期换液，以未经处理的骨髓间充质干细胞培干细胞表dm 标记物的表达，结果显示：细胞均一 表达CD44、CD29、CD90，阳性率分别为99.69%、83.99%、95.05%，而 CD45、CD34、CD11b/c则呈阴性表达，分别为0.28%，0.62%，4.25%(图 2)。
经成骨诱导剂培养11 d后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长， 细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成 明显，经茜素红染色呈红色结节(图3B)；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基 质有大量紫褐色沉淀，呈强阳性表达(图3C)；经vonkossa矿化染色可见 细胞聚集处有黑色固块，岛状分布，呈强阳性表达(图3D)。骨髓间充质干 细胞经成软骨细胞诱导剂培养21 d后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表 面变的光滑，经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈蓝色(图3E)。骨髓间充质干细胞 经成脂诱导剂培养19 d后，诱导而成的脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并 相互融合，细胞由长梭形变为圆形、多边形，经油红O染色显示许多细胞的 胞浆内有大量脂质沉淀(图3F)。