基因工程期末考试

一、名词解释
1、基因:是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

1、基因工程（狭义）：Gene engineering又gene manipulation,是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学，应用基因工程技术完全打破生物界物种的界限，在体外对大分子DNA进行剪切、加工、重组后引入细胞中表达，使其具有新的遗传特性，从而定向改造生物。

2、柯斯质粒：是一类由人工构建的含有λ噬菌体的cos位点序列和质粒复制子的质粒载体。

①具有噬菌体载体特点
②具有质粒载体特点
③高容量特点（30kb）
④常具后性基因
3、克隆载体：能够携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增获得大量目的DNA的一类DNA分子。

4、细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。

5、连接酶：是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来的酶。

6、融合基因：指两个或多个基因的编码区手尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）调控之下，构成嵌合基因。

7、核酸外切酶Exonuclease：是一类从多核苷酸链的一头开始按顺序降解核苷酸的酶。

8、表达载体：能够携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达，获得目的DNA 蛋白质产物的一类DNA分子。

9、植物基因转化受体系统：指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效稳定的再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。

10、冈崎片段：在DNA后随链的合成中先以片段的形式合成岗崎片段，多个岗崎片段再连接成完整的链。

二、问答题
1、PCR的基本原理是什么，用PCR扩增某一基因，必须先得到什么样的信息？
DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。

至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。

2、在细菌细胞中表达真核基因，为什么要用cDNA而不用基因组DNA？为什么要在cDNA 前加上细菌的启动子？
（1）真核生物基因组的编码DNA序列是含有内含子的间断序列，而细菌是原核生物，他们的编码基因组DNA是连续的不含内含子的。

所以如果在细菌中表达真核生物的基因产物，用基因组DNA的话，那么在细菌中表达的时候因为内含子序列在转录成mRNA的时候mRNA就会同样含有内含子序列，于是基因产物表达不出来。

所以我们要用真核生物的mRNA反转录而成的cDNA来进行原核表达基因产物。

真核生物的mRNA在成熟过程中内含子序列已经被剪切掉了，所以cDNA序列是完整的不含间隔序列的编码序列，不含阻碍基因产物的表达。

（2）细菌没有内含子剪接系统，不能识别的真核生物的启动子，要在细菌中进行原核表达，就必须有原核表达系统，所以要在cDNA前加上细菌的启动子。

3、描述Northern杂交和RT-PCR的原理，相对于Northern杂交而言，RT-PCR的优点是什么？
（1）Northern杂交原理：用来检测真核生物RNA量和大小的试验方法，是一种将RNA 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。

将RNA进行变性和电泳分离后，转移到固相支持物上的过程称为Northern blott.
整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物——特异mRNA的生成。

将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将他们原位转移到固定膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探针的标记性质检测出杂交体。

若经杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。

（2）RT-PCR原理：是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

（3）用Northern印记法分析RNA水平需要有足够的RNA含量，对低丰度的mRNA的定量更是够取，而RT-PCR可对微量RNA进行定量。

4、在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的Ⅱ限制性核酸内切酶的识别序列，该位点的序列可能是什么（4分）？
Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是：一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构；没有修饰性甲基化酶功能。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种：切割产生 5 '突出的粘性末端（ sticky ends ）；切割产生 3 '突出的粘性末端；切割产生平头末端（ blunt ends ）。

5’-CGAACATATGGAGT-3’
3’-GCT TGTATACCTCA-3’
5、请设计PCR引物，用于扩增下图所示序列之间的DNA序列。

（5分）
5’-GACCTGTGGAATC---CATACGGGATTG-3’
前引物F：5’-GACCTGTGGAAG-3’
后引物R：5’-CAATCCCGTATG-3’
6、用连接酶将Sau3AI( ↓GATC)切割的DNA与经BamHI(G↓GATCC)切割的DNA连接起来后，能被BamHI切割的几率有多大（用百分比表示）？
25%
7、
Smal和EcoRV；BamHI和BssHII；Bg1II和Sau3A；BamHI和Sau3A；MspI和TapI；
8、
AIuI：44=256；EcRI：46=4096；AcyI：44×2=1024
9、
50µg/ml=50ng/µl，按1：40稀释，为50×40=2000ng/µl
质粒有80ng/µl×1µl=80ng，设DNA片段为Xng，
80ng/4Kb 1
Xng/1Kb 5
X=100ng；100ng/2000ng=0.05µl
（1）①BamHI
5’-G-----3’5’-----GATCC-3’
3’-CCTAG-----5’3’-----G-5’
②PstI
5’-CTGCA------3’5’-----G-3’
3’-G------5’3’-----ACGTC-5’
（2）BamHI的末端能够被DNA聚合酶填补，而PstI的末端却不能，这种差异是由于DNA 聚合酶的作用条件所决定的：dNTP只加到具有3’-OH的引物上，并且要有一条保证正确添加的模板链。

BamHI的末端可以满足这些条件，但PstI的末端却不能，因其具有隐藏的5’末端，这种末端不能作为引物，故不能被填补，因此BamHI的末端会变成平末端，PstI不会。

（3）
①BamHI ②PstI
5’-G---- ---GATCC-3’5’-CTGCA--- --G-3’
3’-CCTAG---- ---G-5’3’-G-- --ACGTC-5’
DNA聚合酶DNA聚合酶5’-GGATC GATCC-3’5’-CTGCA G-3’
3’-CCTAG CTACG-5’3’-G ACGTC-5’
T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶5’-GGATCGATCC-3’5’-CTGCAG-3’
3’-CCTAGCTACG-5’3’-GACGTC-5’
（4）BamHI不能；PstI 能。

11
（1）
（2）2号的2.5Kb 和6号的1Kb 和1.5Kb 没有条带。

（3）2号的2.5Kb 和5Kb 没有条带，1Kb 、1.5Kb 、2Kb 、3Kb 和4.5Kb 有条带。

Hind Ⅲ
tetR Hind Ⅲ tetR EcoR V EcoR V 3 2
1.5 1
三、综合题
研究表明，某细菌含有一种蛋白，具有很强的杀虫活性，先已将该蛋白纯化并从N端到C 端各测定了10个aa序列，请设计实验，克隆编码该蛋白的基因?
拟将该基因转入杨树，请问
（1）如何进行受体系统的选择和建立
（2）遗传转化系统的建立
（3）转化方法选择
（4）转化系统如何优化
（5）如何鉴定转基因植株
（6）如何解决嵌合体
（7）如何推广转基因植株
（1）如何进行受体系统的选择和建立
1)植物基因转化受体系统应具备的条件
①具有高效稳定的再生能力
②具有较高的遗传稳定性
③具有稳定的外植体来源
④对选择性抗生素敏感
⑤对农杆菌侵染有敏感性
2)植物基因转化受体系统建立的程序
①建立高频再生系统
②最佳培养基的建立
③进行抗生素敏感实验
④进行农杆菌敏感实验即菌种的选择
（2）遗传转化系统的建立
想要转基因，则必须建立遗传转化系统，杨树一般都是农杆菌介导进行遗传转化，影响农杆菌介导的因素有很多，
（3）转化方法选择
（4）转化系统如何优化
（5）如何鉴定转基因植株
（6）如何解决嵌合体
（7）如何推广转基因植株。