小鼠胚胎干细胞
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究在生物学和医学领域中具有重大意义。
这些细胞具备自我更新和多向分化的潜能，为再生医学、疾病模型创建、药物筛选等多个领域提供了宝贵的资源。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立成为研究热点。
本文旨在详细介绍新型小鼠胚胎干细胞系的建立过程及研究进展。
二、研究背景与目的在生物医学领域，胚胎干细胞研究具有重要意义。
其具备分化成各种类型细胞的能力，使其在再生医学、药物筛选以及疾病模型研究中有着广泛应用。
而建立稳定、高效的胚胎干细胞系更是科学研究的重要前提。
目前，虽然已有多种小鼠胚胎干细胞系，但随着科研的深入，对于具有更高分化潜力、更低异源性的新型胚胎干细胞系的需求愈发迫切。
因此，本文研究的主要目的是建立一种新型的小鼠胚胎干细胞系，以满足科研需求。
三、实验方法1. 实验材料：选用特定品系的小鼠作为实验对象，准备相关实验试剂和仪器。
2. 胚胎获取：通过显微操作技术获取小鼠的早期胚胎。
3. 培养与分化：将胚胎置于特定培养基中，进行培养和诱导分化。
4. 筛选与鉴定：通过形态学观察、基因检测等方法筛选出具有多向分化潜力的细胞系。
5. 细胞系建立：对筛选出的细胞进行扩增和冻存，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
四、实验结果1. 成功获取小鼠早期胚胎，并建立了稳定的体外培养体系。
2. 通过诱导分化实验，发现新型胚胎干细胞系具有较高的分化潜力。
3. 通过形态学观察和基因检测，成功筛选出具有多向分化潜力的细胞系。
4. 建立的小鼠新型胚胎干细胞系具有较低的异源性，稳定性好，可长期传代。
五、讨论与结论本文成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，其具有较高的分化潜力和较低的异源性。
这一新型细胞系的建立为再生医学、疾病模型创建、药物筛选等领域提供了新的资源。
同时，该细胞系的建立也为进一步研究胚胎干细胞的分化机制、调控网络等提供了有力工具。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，干细胞研究在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，胚胎干细胞（ESC）作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，已成为研究各种生物过程和疾病模型的热门研究对象。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其在科研领域的应用价值。
二、材料与方法1. 实验材料本实验所需材料包括小鼠胚胎、培养基、生长因子等。
所有材料均需经过严格的质量控制，确保实验结果的可靠性。
2. 方法（1）胚胎获取与处理：从特定品系的小鼠中获取早期胚胎，并进行必要的处理，如去透明带等。
（2）干细胞培养：将处理后的胚胎置于特定培养基中，添加生长因子等必要成分，进行干细胞培养。
（3）干细胞系建立：通过细胞克隆、筛选等方法，建立新型胚胎干细胞系。
（4）细胞鉴定与表型分析：通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，包括基因型、染色体稳定性等方面的分析。
三、实验结果1. 胚胎处理与干细胞培养结果经过适当的处理后，胚胎在特定培养基中成功附着并开始发育。
在适宜的条件下，干细胞得以增殖并形成克隆。
2. 新型胚胎干细胞系的建立通过细胞克隆、筛选等步骤，成功建立了新型胚胎干细胞系。
该细胞系具有自我更新能力和多向分化潜能，为后续研究提供了可靠的细胞来源。
3. 细胞鉴定与表型分析结果通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，结果显示该细胞系基因型稳定，染色体无异常，具有较高的纯度。
此外，该细胞系在体外分化实验中表现出良好的分化潜能。
四、讨论1. 小鼠新型胚胎干细胞系建立的意义建立小鼠新型胚胎干细胞系对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
首先，该细胞系可用于研究小鼠胚胎发育过程及机制，为人类胚胎发育研究提供参考。
其次，该细胞系可分化为多种细胞类型，为疾病模型研究、药物筛选等领域提供可靠的细胞来源。
此外，该细胞系还可用于基因编辑、基因治疗等方面的研究。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的优点与挑战（1）优点：新型胚胎干细胞系具有自我更新能力强、分化潜能高、基因型稳定等特点，为科研工作者提供了可靠的细胞来源。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言近年来，随着干细胞生物学技术的不断发展，干细胞在生命科学领域中的应用愈发广泛。
作为一项具有革命性的生物技术，干细胞在研究生物体的发育、生长以及治疗人类疾病方面展现出巨大潜力。
尤其是小鼠胚胎干细胞，由于具有分化潜能大、繁殖速度快、操作相对简便等优点，已成为科研人员研究的重要工具。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其意义。
二、研究背景与目的小鼠胚胎干细胞系（mESCs）是生物学研究的重要工具，可用于研究发育生物学、疾病模型以及药物筛选等领域。
然而，现有的小鼠胚胎干细胞系存在一些局限性，如分化效率低、遗传稳定性差等问题。
因此，建立新型小鼠胚胎干细胞系，对于推动干细胞研究领域的发展具有重要意义。
三、材料与方法本研究采用小鼠胚胎组织作为起始材料，通过以下步骤建立新型胚胎干细胞系：1. 选取健康小鼠胚胎，进行无菌操作以获取胚胎组织；2. 消化胚胎组织，获得单细胞悬液；3. 将单细胞悬液接种于培养基中，培养一定时间后筛选出阳性克隆；4. 对阳性克隆进行遗传学分析，验证其基因组稳定性；5. 进一步对筛选出的细胞系进行分化潜能和增殖能力的评估。
四、实验过程与结果1. 细胞培养与筛选：通过优化培养条件，成功获得了一批生长良好的小鼠胚胎干细胞系。
在显微镜下观察，这些细胞形态均一，呈现出典型的干细胞特征。
2. 遗传学分析：通过基因组学和遗传学分析，验证了新型小鼠胚胎干细胞系的基因组稳定性。
结果显示，这些细胞系具有较低的突变率和较高的遗传纯合性。
3. 分化潜能评估：将新型小鼠胚胎干细胞系进行定向诱导分化，成功获得了多种组织细胞类型，如神经细胞、心肌细胞等。
这表明这些细胞系具有较高的分化潜能。
4. 增殖能力评估：通过细胞增殖实验，发现新型小鼠胚胎干细胞系具有较快的增殖速度和较高的存活率。
这为后续实验提供了充足的细胞来源。
五、讨论本研究成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，具有较高的基因组稳定性、分化潜能和增殖能力。
小鼠胚胎干细胞的分化特性研究
小鼠胚胎干细胞的分化特性研究小鼠胚胎干细胞是一种具有潜在分化能力的多功能细胞。
在适当的条件下，这些细胞可以分化为各种不同类型的细胞，包括心脏细胞、肝细胞、神经细胞等。
因此，小鼠胚胎干细胞已成为许多生命科学研究中的重要工具。
在研究小鼠胚胎干细胞的分化特性时，科学家们通常会采用一些特殊的技术。
例如，他们可能会在细胞培养基中添加特定的生长因子或化学物质，这些因子和化学物质能够促进或抑制细胞的分化。
此外，科学家们还常常通过转染技术，将某些关键的基因或转录因子导入到小鼠胚胎干细胞中，从而影响它们的分化。
通过这些技术，科学家们已经对小鼠胚胎干细胞的分化特性有了较为深入的了解。
例如，研究表明，小鼠胚胎干细胞具有向三个不同胚层分化的能力：外胚层、中胚层和内胚层。
这意味着这些细胞可以分化成形态和功能各异的细胞类型，包括皮肤细胞、消化道细胞、肌肉细胞等。
此外，研究还发现，小鼠胚胎干细胞的分化也受到许多因素的影响。
例如，细胞培养基中的生长因子浓度、培养时间以及引入的基因等都可能会影响它们的分化。
因此，在进行小鼠胚胎干细胞的分化研究时，科学家们需要谨慎操作，确保实验结果的准确性和可重复性。
除了研究小鼠胚胎干细胞的分化特性外，科学家们还探索了这些细胞在再生医学中的潜在应用。
例如，小鼠胚胎干细胞可以用于制造组织和器官，这有望在治疗某些疾病时发挥重要作用。
此外，这些细胞还可以用于药物筛选和毒性测试等领域。
尽管小鼠胚胎干细胞具有广泛的应用前景，但在实际应用中仍面临一些挑战。
其中一个关键问题是如何保证细胞的稳定性和纯度，以便于它们的应用。
此外，还需要进一步完善培养和分化技术，以提高细胞的分化效率和质量。
总之，小鼠胚胎干细胞的分化特性研究为生命科学领域的发展提供了新的机会和挑战。
通过进一步的研究和技术创新，科学家们有望更好地利用这些多功能细胞，推动再生医学领域的发展，并为人类健康做出更大的贡献。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言近年来，小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells, mESCs）在生命科学研究领域得到了广泛的应用。
它们在细胞生物学、发育生物学、疾病模型和药物研发等方面具有重要作用。
因此，建立稳定、高效的小鼠新型胚胎干细胞系是科学研究的关键任务之一。
本文将详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其潜在应用。
二、研究目的和意义本研究的目的是建立一种新型的小鼠胚胎干细胞系，旨在提高干细胞的分化潜能、稳定性以及可操控性。
这种新型胚胎干细胞系将有助于更好地研究细胞发育和分化机制，为疾病模型研究、药物研发和再生医学提供有力工具。
三、研究方法1. 实验材料与试剂：本实验采用小鼠胚胎组织作为起始材料，使用特定培养基和生长因子进行细胞培养。
2. 细胞培养：从早期胚胎中获取内细胞团（ICM），将其置于特定的培养条件下进行培养和扩增。
3. 细胞克隆和筛选：通过特定标记和筛选方法，从培养的细胞中筛选出具有干细胞特性的克隆。
4. 遗传和表型分析：对筛选出的干细胞进行遗传学和表型分析，评估其特性和稳定性。
5. 数据分析与统计：采用适当的统计方法对实验数据进行处理和分析，以验证实验结果的有效性。
四、实验结果1. 细胞培养与扩增：成功从早期胚胎中获取内细胞团，并培养成新型胚胎干细胞系。
经过多次传代，细胞保持稳定增殖。
2. 细胞克隆和筛选：通过特定标记和筛选方法，成功筛选出具有干细胞特性的克隆，并建立新型胚胎干细胞系。
3. 遗传和表型分析：新型胚胎干细胞系在遗传学和表型分析中表现出良好的稳定性和可操控性。
4. 数据分析与统计：通过适当的统计方法对实验数据进行处理和分析，验证了新型胚胎干细胞系的有效性和可靠性。
五、讨论本研究成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，具有较高的分化潜能、稳定性和可操控性。
与传统的胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在细胞生物学、发育生物学、疾病模型和药物研发等方面具有更广泛的应用前景。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究一直是生物学和医学领域的重要课题。
这些细胞具有自我更新和多潜能的特性，为再生医学、疾病模型、药物筛选等多个领域提供了巨大的研究潜力。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立显得尤为重要。
本文旨在详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程、方法和应用前景。
二、材料与方法1. 材料准备（1）实验动物：选择合适的小鼠品系作为供体，确保其遗传背景清晰。
（2）实验试剂：包括培养基、生长因子、抗生素等。
（3）实验设备：显微镜、培养箱、离心机等。
2. 方法（1）胚胎获取：从小鼠中获得早期胚胎。
（2）胚胎培养：将胚胎置于特定培养基中，加入生长因子，进行体外培养。
（3）干细胞诱导：通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
（4）干细胞系建立：经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果1. 胚胎获取与培养通过超数排卵和人工授精等方法，从小鼠中获得早期胚胎。
将胚胎置于含有适当营养成分和生长因子的培养基中，置于适宜温度和湿度的培养箱中培养。
2. 干细胞诱导与分化通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
这一过程需要严格控制培养条件和时间，以确保干细胞的成功诱导和分化。
3. 干细胞系的建立与鉴定经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
通过细胞形态观察、生长曲线绘制、基因表达分析等方法，对干细胞系进行鉴定和评估。
四、讨论与分析1. 小鼠新型胚胎干细胞系的特点与优势新型小鼠胚胎干细胞系具有较高的分化潜能、稳定的遗传背景和良好的扩增能力等特点。
与以往的小鼠胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在研究过程中具有更高的可靠性和实用性。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的应用前景（1）再生医学：小鼠新型胚胎干细胞系可用于研究细胞分化和组织再生，为再生医学提供新的治疗策略。
（2）疾病模型：通过基因编辑技术，可以构建特定疾病的小鼠模型，为疾病研究和药物筛选提供有力工具。
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制在生命科学的广袤领域中，小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）自我更新的信号调控机制一直是备受关注的研究热点。
这不仅对于深入理解胚胎发育的奥秘至关重要，还为再生医学和疾病治疗带来了无限的可能。
要明白小鼠胚胎干细胞的自我更新机制，首先得清楚什么是胚胎干细胞。
简单来说，胚胎干细胞是一种具有全能性的细胞，它们有潜力分化成身体内的各种细胞类型。
而自我更新，则指的是这些细胞在保持未分化状态的同时，能够不断地分裂增殖，产生更多的相同类型的胚胎干细胞。
那么，是什么在背后操控着这一神奇的过程呢？其中，一系列的信号通路起着关键的调控作用。
首先，LIF/STAT3 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中扮演着重要角色。
LIF（Leukemia Inhibitory Factor，白血病抑制因子）与细胞表面的受体结合后，激活了 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，信号转导与转录激活因子 3）。
活化的 STAT3 进入细胞核，调控一系列与自我更新相关的基因的表达。
当 LIF 存在时，STAT3 被激活，促进胚胎干细胞的自我更新；而缺乏 LIF 时，STAT3活性降低，胚胎干细胞容易发生分化。
再者，BMP（Bone Morphogenetic Protein，骨形态发生蛋白）信号通路也对小鼠胚胎干细胞的自我更新有着重要影响。
BMP 与相应的受体结合后，通过一系列的信号转导，激活下游的 Smad 蛋白。
这些被激活的 Smad 蛋白会与其他转录因子相互作用，调节与自我更新和多能性相关的基因表达，从而维持胚胎干细胞的未分化状态。
除了上述两条主要的信号通路，还有其他一些因素也参与其中。
例如，Wnt 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中也发挥了一定的作用。
当 Wnt 信号通路被激活时，它可以抑制胚胎干细胞的分化，促进其自我更新。
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells, mESCs）的研究对于生物医学领域具有深远的意义。
近年来，关于小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立与发展受到了广大研究者的关注。
本论文主要阐述如何通过科学的实验设计与操作，成功建立小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系，并对其生物学特性进行详细分析。
二、材料与方法1. 材料实验所需小鼠孤雌激活卵母细胞、胚胎培养基、培养箱、显微操作设备等。
2. 方法（1）孤雌激活卵母细胞的获取与培养；（2）孤雌胚胎干细胞的诱导分化与筛选；（3）二倍体孤雌胚胎干细胞的建立与鉴定；（4）生物学特性的分析。
三、实验过程1. 孤雌激活卵母细胞的获取与培养通过超排技术获取小鼠的孤雌激活卵母细胞，在胚胎培养基中培养至成熟。
2. 孤雌胚胎干细胞的诱导分化与筛选将成熟的卵母细胞进行体外受精或激活，诱导其分化为胚胎干细胞。
通过特定的筛选方法，筛选出具有干细胞特性的细胞。
3. 二倍体孤雌胚胎干细胞的建立与鉴定将筛选出的干细胞进行基因组检测，确保其具有二倍体染色体组。
通过形态学、生长特性、分化能力等多方面的鉴定，确认其为二倍体孤雌胚胎干细胞。
4. 生物学特性的分析对建立的二倍体孤帕胚胎干细胞进行生长曲线测定、多能性检测、基因表达分析等，以了解其生物学特性。
四、结果与讨论1. 结果成功建立了小鼠新型二倍体孤帕胚胎干细胞系，具有稳定的生长曲线和良好的多能性。
通过基因组检测和生物学特性分析，证实了其具有二倍体染色体组和良好的生物学特性。
2. 讨论（1）在孤帕激活卵母细胞的获取与培养过程中，需要优化培养条件和方法，以提高卵母细胞的成熟率和质量。
同时，通过改进体外受精和激活方法，可进一步提高胚胎干细胞的诱导效率和质量。
（2）在筛选和鉴定过程中，应采用多种方法和技术，如形态学观察、生长曲线测定、基因组检测、多能性检测等，以确保筛选出的细胞具有理想的二倍体孤帕胚胎干细胞特性。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
小鼠胚胎干细胞的鉴定
小鼠胚胎干细胞的鉴定小鼠ES细胞的鉴定主要围绕ES细胞的形态、核型、分化潜能和特异性染色等方面进行。
一、形态学观察小鼠ES细胞的形态特点为圆形或扁圆形，表面平滑，体积较小，核质比大，有一个或多个凸起的核仁结构。
经培养后紧密聚集，细胞之间界限不清，形成岛状，巢状群体生长状态，集落边缘整齐，与滋养层细胞界限分明且色泽深亮，克隆的边缘可以看到比较清晰的单个细胞。
多次传代消化或改变培养基的成分，如降低血清浓度、去除LIF或碱性FGF等某些生长因子时，悬浮培养形成的细胞团开始出现松散，球形的边缘可以清楚地看到圆而大的细胞，细胞团开始自分化。
二、核型分析正常的二倍体核型特征是ES细胞全能性的基础，因此需要对所建立的ES细胞系的核型进行鉴定分析。
【实验材料】1.材料载玻片、镊子、离心管、移液管、吸管、35mm 培养皿（Corning，430165）。
2.试剂Demecolcine（Sigma，D6165）、Giemsa（Sigma，G4507）、NaH2 PO4（Sigma，S6566）、Na2HPO4（Sigma，S5136）、甲醇、冰醋酸。
配制类试剂：①磷酸缓冲液：0.2mol/L NaH2PO4+0.2mol/L Na2 HPO4；②Giemsa染液：8ml磷酸缓冲液+2ml Giemsa贮存液，吹吸混匀；③固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1（现用现配）。
【实验步骤】1.将需要做核型分析的ES传代，通常用一个35mm皿的细胞做核型，在传代后25～40小时向培养皿中加入0.2µg/ml democolcin，继续培养1～2小时。
2.取出培养皿，用标准传代的消化方法将其消化成单细胞悬液，1200r/min离心10分钟，弃上清，注意：上清要吸得彻底些。
3.加入事先预热至37℃的0.56%KCl低渗液4ml，用滴管吹打成单细胞悬液（较剧烈），37℃低渗处理15～20分钟。
4.配10ml固定液，4℃冰箱预冷。
《2024年建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系》范文
《建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言小鼠胚胎干细胞（mESCs）作为研究细胞生物学和再生医学的重要工具，在基础研究和临床应用中具有广泛的应用前景。
近年来，随着研究的深入，LIF（Leukemia Inhibitory Factor）依赖性新型小鼠胚胎干细胞系的建立成为研究热点。
本文旨在探讨如何建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系，为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料实验所需材料包括：小鼠胚胎、培养基、LIF、血清、胰蛋白酶等。
2. 方法（1）小鼠胚胎的获取与处理从受孕后的小鼠中获取胚胎，并进行必要的处理，如清洗、消毒等。
（2）胚胎干细胞的分离与培养将处理后的胚胎置于含有培养基的培养皿中，进行干细胞的分离与培养。
在培养过程中，需注意控制温度、湿度等环境因素。
（3）LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系的建立在培养过程中，加入适量的LIF，观察细胞生长情况。
通过调整LIF浓度、培养时间等因素，建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系。
三、实验结果1. 细胞形态观察通过显微镜观察，发现加入LIF后，小鼠胚胎干细胞的形态发生改变，呈现典型的干细胞形态。
随着LIF浓度的增加，细胞生长速度加快，细胞密度增大。
2. 细胞增殖情况分析通过细胞计数和PCR检测，发现LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系的增殖能力明显增强。
同时，细胞周期缩短，S期和G2期细胞比例增加。
3. 基因表达分析通过基因芯片等技术，对LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系进行基因表达分析。
结果显示，与普通小鼠胚胎干细胞相比，LIF 依赖性新型小鼠胚胎干细胞系在特定基因的表达上存在差异。
这些差异基因可能与干细胞的自我更新、分化等生物学特性有关。
四、讨论LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系的建立对于研究干细胞的生物学特性和应用具有重要意义。
通过调整LIF浓度、培养时间等因素，可以优化干细胞系的建立过程，提高干细胞的增殖能力和自我更新能力。
此外，对差异基因的分析有助于深入了解干细胞的生物学特性，为进一步研究干细胞的分化和应用提供参考。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言干细胞研究作为现代生物学的重要领域，对于人类理解生命过程和疾病治疗具有重要意义。
胚胎干细胞（ESC）作为干细胞的代表，具有自我更新和多向分化的潜力，在再生医学、疾病模型构建和药物研发等方面具有广泛应用。
近年来，随着基因编辑技术的快速发展，新型小鼠胚胎干细胞系的建立已成为干细胞研究领域的热点。
本文旨在介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程、方法和应用前景。
二、小鼠新型胚胎干细胞系建立的背景及意义小鼠胚胎干细胞系是生命科学研究的重要工具。
然而，传统的小鼠胚胎干细胞系在培养、遗传修饰等方面存在局限性，无法满足科研和临床的需求。
因此，建立新型小鼠胚胎干细胞系对于推动生命科学研究、疾病模型构建以及再生医学应用具有重要意义。
三、小鼠新型胚胎干细胞系建立的方法1. 实验材料与仪器：小鼠胚胎、培养基、生长因子、血清、显微操作仪等。
2. 实验方法：（1）获取小鼠胚胎并分离内细胞团（ICM）；（2）将ICM置于特定培养基中培养，添加生长因子和血清；（3）通过显微操作技术筛选出具有多能性的细胞克隆；（4）进行遗传修饰和基因编辑，获得所需基因型的小鼠胚胎干细胞；（5）将筛选出的细胞克隆进行传代培养，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
四、实验结果与分析1. 成功分离出小鼠胚胎内细胞团（ICM），并建立了稳定的培养体系；2. 通过显微操作技术筛选出具有多能性的细胞克隆，成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系；3. 对新型小鼠胚胎干细胞系进行基因编辑和遗传修饰，获得了所需基因型的小鼠胚胎干细胞；4. 通过对新型小鼠胚胎干细胞系的生物学特性进行分析，发现其具有自我更新和多向分化的潜力；5. 与传统小鼠胚胎干细胞系相比，新型小鼠胚胎干细胞系在培养、遗传修饰等方面具有更高的效率和更低的成本。
五、应用前景与展望1. 疾病模型构建：新型小鼠胚胎干细胞系可用于构建各种人类疾病的动物模型，为研究疾病发病机制和药物研发提供有力工具；2. 再生医学：新型小鼠胚胎干细胞系具有自我更新和多向分化的潜力，可用于治疗多种疾病，如帕金森病、糖尿病等；3. 基因编辑与遗传修饰：新型小鼠胚胎干细胞系可作为基因编辑和遗传修饰的优良材料，为研究基因功能和人类遗传性疾病提供重要工具；4. 促进科研发展：随着技术的进步，未来可能还会进一步开发新型小鼠胚胎干细胞系的潜能和应用范围，为生命科学研究领域的发展做出更多贡献。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究在生物学和医学领域中具有重大意义。
这些细胞具有自我更新和分化成多种细胞类型的能力，为研究发育生物学、疾病模型、药物筛选及细胞治疗提供了宝贵的资源。
近年来，小鼠作为研究模型在胚胎干细胞领域的研究尤为突出。
本文旨在详细介绍一种新型小鼠胚胎干细胞系的建立过程，为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料实验所需的小鼠胚胎、培养基、生长因子及其他化学试剂等。
2. 方法（1）小鼠胚胎的获取与处理；（2）胚胎干细胞的分离与培养；（3）新型胚胎干细胞系的建立与鉴定。
三、实验方法与步骤1. 小鼠胚胎的获取与处理从小鼠超数排卵后的母体中获取胚胎，经过清洗、培养等处理后，进行后续实验。
2. 胚胎干细胞的分离与培养采用机械法和酶解法相结合的方式，将胚胎中的干细胞分离出来。
将分离出的干细胞置于特定培养基中，添加生长因子及其他必要成分，进行培养。
3. 新型胚胎干细胞系的建立与鉴定通过调整培养条件、优化培养基配方等方法，建立新型胚胎干细胞系。
利用细胞形态学、免疫荧光、基因表达等技术手段对新型干细胞系进行鉴定，确保其具备胚胎干细胞的特性。
四、结果与讨论1. 结果经过一系列实验，成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系。
该细胞系具有典型的胚胎干细胞形态，具备自我更新和分化成多种细胞类型的能力。
通过免疫荧光和基因表达等技术手段鉴定，证实了该细胞系具备胚胎干细胞的特性。
2. 讨论在建立新型小鼠胚胎干细胞系的过程中，我们遇到了一些挑战和困难。
例如，在分离干细胞的过程中，需要掌握合适的机械力和酶解条件，以避免对干细胞造成损伤。
此外，在培养过程中，需要不断调整培养条件，以优化干细胞系的生长和分化能力。
然而，通过不断尝试和优化，我们最终成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，为相关研究提供了有力支持。
五、结论本文成功建立了新型小鼠胚胎干细胞系，为研究发育生物学、疾病模型、药物筛选及细胞治疗等领域提供了新的资源。
小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol
4.将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60，ES级FBS30，DMSO 10
附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10cm培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。
5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：
1.将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
6.每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。
小鼠esc培养方案
小鼠esc培养方案一、细胞来源与获取小鼠胚胎干细胞（ESC）可来源于受精后3.5\~5.5天的胚胎，这些胚胎可通过显微操作技术从囊胚中剥离。
剥离的胚胎干细胞需要在含有血清和饲养层细胞的培养基中进行培养。
二、培养基选择与配制培养基是小鼠胚胎干细胞（ESC）生长的必要条件，常用的培养基包括Glasgow MEM、Ham F12、ES Cell Medium等。
在配制培养基时，需要添加适量的血清（一般为胎牛血清）和抗生素等成分，以维持细胞的生长和繁殖。
三、饲养层细胞准备饲养层细胞可以为胚胎干细胞提供必要的生长因子和细胞因子，常用的饲养层细胞包括STO、STO-derived fibroblasts等。
在准备饲养层细胞时，需要将细胞接种在消毒后的培养皿或培养瓶中，待细胞生长至适宜密度后，再进行后续操作。
四、细胞接种与培养将剥离的胚胎干细胞接种在饲养层细胞上，通常情况下，接种密度为1\~5万个/cm²。
在培养过程中，需要保持适宜的温度和湿度，并定期更换培养基，以维持细胞的生长状态。
一般情况下，小鼠胚胎干细胞（ESC）会在接种后2\~3天开始贴壁生长。
五、细胞传代与扩增当小鼠胚胎干细胞（ESC）生长至适宜密度时，需要进行传代和扩增。
通常情况下，传代时的细胞密度为1\~2万个/cm²。
在传代过程中，需要将细胞从培养皿或培养瓶中吹散，并接种到新的培养皿或培养瓶中。
扩增过程需要定期更换培养基，并保持适宜的温度和湿度。
六、细胞冻存与复苏为了长期保存小鼠胚胎干细胞（ESC），需要进行细胞冻存。
将处于对数生长期的细胞进行离心和清洗后，加入适量的冷冻保护剂（一般为二甲基亚砜），然后放入液氮中进行保存。
在需要使用时，将冻存的细胞取出，进行复苏。
小鼠胚胎干细胞
固定，Giemsa染色。通过形态和染色鉴定 ES细胞克隆。分化细胞的克隆着色浅淡。 计数克隆总数和ES细胞克隆占克隆总数的 比例。
2.3 提高效率的改良技术
初次接种时，将培养基中的FBS增加至
25%。 选用低糖DMEM，并在培养基中添加核 苷。 分离延迟发育的胚胎，即经卵巢切除和 使用孕酮而不能植入的胚胎 接种前使用免疫溶解法去掉囊胚外面的 滋养层细胞。
1.3 内细胞团的分离和培养
免疫外科学方法 显微外科学方法 组织培养法
免疫外科法
利用囊胚腔对抗体的不通透性，特异地杀死囊胚 外层的滋养层细胞，而仅仅保留内细胞团。 原理是将胚泡去除透明带，与抗小鼠血清共同孵 育一段时间，再添加新鲜豚鼠血清（补体），在 补体的作用下，外层滋养层细胞被溶解破坏，用 眼科手术刀挑去死的滋养层细胞即可。
没有明显的胞间界限，边缘可见少量扁平上皮细胞或成纤维
样细胞（常见于初期代次和无饲养层培养的 ESCs）。
在饲养层细胞上的 小鼠ES细胞克隆
在明胶包被的培养 皿中的小鼠ES细胞 克隆
3.2 病原体检查
待检测细胞至少需要在无抗生素的条件下培 养3代。筛查细胞上清和细胞悬液中所有种 类的小鼠病原体。
分散过程要注意使用温和的手段，将外
生物分散成含有5-10个的小细胞团。
1.4 首个ES细胞样克隆的扩增
经过首次分散后，通常生长缓慢，需要耐
心等待小克隆的出现，一旦确定细胞生长， 就要再次每天观察培养物。 可能三种生长情况：
非ES样/细胞类型的克隆生长；
主要为ES样克隆的生长；
ES样克隆和混合细胞类型克隆的生长。
STO细胞在10cm培养皿中铺满后，用 DMEM/10%NCS+10μg/ml丝裂霉素C孵育 2-3小时。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言随着现代生物学技术的发展，胚胎干细胞系成为了生物医学领域研究的重要工具。
新型胚胎干细胞系的建立不仅可以用于医学基础研究，也可在疾病模型、药物研发等方面发挥巨大作用。
本文将介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立方法及意义。
二、小鼠新型胚胎干细胞系建立的背景及意义随着人们对胚胎发育过程、基因功能及遗传疾病机理等方面的研究不断深入，建立一种具有优良性能、高稳定性、易于遗传操作的新型小鼠胚胎干细胞系变得尤为重要。
通过新型胚胎干细胞系的建立，不仅可以提供优质细胞来源用于科学研究，而且还可以在医学上应用于疾病模型的建立和药物筛选等。
三、小鼠新型胚胎干细胞系建立的实验方法（一）实验材料本实验所需材料包括小鼠胚胎、培养基、生长因子等。
其中，小鼠胚胎需来自特定品系的小鼠，并需在无菌条件下进行操作。
（二）实验步骤1. 胚胎获取：从特定品系的小鼠中获取早期胚胎。
2. 培养：将胚胎置于含有生长因子的培养基中，进行体外培养。
3. 细胞分离：将培养的胚胎组织进行消化处理，分离出干细胞。
4. 干细胞培养：将分离出的干细胞进行体外培养，使其形成克隆并传代。
5. 细胞鉴定：通过细胞形态学观察、遗传学鉴定等方法，确定干细胞的性质和类型。
四、小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及特点通过上述实验方法，我们成功建立了小鼠新型胚胎干细胞系。
该细胞系具有以下特点：1. 细胞生长迅速，易于传代；2. 细胞形态稳定，具有典型的胚胎干细胞特征；3. 遗传背景清晰，易于进行基因编辑等遗传操作；4. 细胞具有多向分化潜能，可用于疾病模型的建立和药物筛选等。
五、小鼠新型胚胎干细胞系的应用前景小鼠新型胚胎干细胞系的建立将为医学基础研究、疾病模型建立和药物研发等领域提供有力支持。
具体应用包括：1. 用于研究胚胎发育过程、基因功能及遗传疾病机理等；2. 用于建立各种疾病模型，如神经系统疾病、心血管疾病等；3. 用于药物筛选和药物疗效评估；4. 为细胞治疗提供优质细胞来源。
《2024年建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系》范文
《建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）作为生物医学领域中极为重要的研究对象，其在疾病研究、药物筛选及再生医学等多个方面都具有重要意义。
本研究的目的是建立一个以LIF （Leukemia Inhibitory Factor）依赖性为基础的新型小鼠胚胎干细胞系。
通过对这一新型干细胞系的深入研究，将有助于理解其生长与分化的机制，并为未来的应用研究提供稳定的细胞模型。
二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括：小鼠胚胎、培养基、LIF因子、相关试剂等。
2. 方法（1）胚胎准备：获取小鼠胚胎，并进行必要的处理。
（2）细胞培养：在特定的培养基中加入LIF因子，对小鼠胚胎进行培养。
（3）克隆筛选：通过显微操作技术，筛选出具有LIF依赖性的胚胎干细胞克隆。
（4）细胞系建立：经过一系列的扩增、纯化与分化诱导实验，建立稳定的LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系。
三、实验过程1. 小鼠胚胎获取与处理本实验采用特定品系的小鼠进行胚胎获取。
首先，对小鼠进行超数排卵处理，然后获取并分离出小鼠胚胎。
接着对胚胎进行必要的处理，为后续的细胞培养做好准备。
2. 细胞培养与LIF依赖性筛选将处理后的小鼠胚胎置于含有LIF因子的培养基中，进行细胞培养。
在培养过程中，通过显微操作技术，筛选出具有LIF依赖性的胚胎干细胞克隆。
3. 细胞系建立与纯化经过一系列的扩增、纯化与分化诱导实验，建立稳定的LIF 依赖性新型小鼠胚胎干细胞系。
在此过程中，采用基因组学和表型分析等手段对细胞进行全面评估和鉴定。
四、结果与讨论经过系统的实验操作，我们成功建立了LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系。
通过对该细胞系的观察和分析，发现其在特定条件下表现出较高的生长和分化潜能。
同时，我们还对该细胞系的基因组、表型等方面进行了全面的分析，为其在生物医学领域的应用提供了可靠的数据支持。
本研究在以下几个方面具有重要意义：首先，建立了一个新的LIF依赖性小鼠胚胎干细胞系，有助于更好地研究胚胎干细胞的生长与分化机制；其次，为疾病研究、药物筛选及再生医学等领域提供了新的细胞模型；最后，通过该研究有助于进一步拓展生物医学领域的研究范围和深度。
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为了避免批次差异对实验的影响，要根据实验计划
一次买足，避免中途更换，同时每个批次的血清要
用克隆形成效率检验。
部分血清在低浓度时效果很好，但高浓度
（如40%）时出现毒性，选择时要选择那些 高、低浓度效果均佳的血清。
由于专业技能和使用试剂批次的差异（特别
是胎牛血清），ES细胞的建系在不同实验室 变化很大。因此需要开发定义明确的培养条 件，如使用化学成分确定的血清替代物。
排卵雌鼠的胚胎数目较大。
这两种条件下，通常从3.5dpc动物子宫收集
胚胎，此时胚胎正好处于囊胚期，不需要进 一步培养即可用于建立ES细胞。
细胞核移植获得胚泡
利用显微操作方法把供体细胞核移植入去核 的受体卵母细胞中，然后经过活化后获得重 构胚胎的过程。
重构胚胎在体外发育到囊胚阶段后，一方面 可以移入受体动物体内以获得克隆动物，另 一方面，可以用于建立核移植胚胎干细胞系 (ntES)。而ntES 细胞可以在体外被诱导形成 特定的体细胞用于治疗。
显微外科法
小鼠受精后3-4天，利用显微操作系统直接从胚泡 中吸出内细胞团细胞进行培养。该方法需要专门 的仪器设备，技术要求较高，难以推广。
组织培养法
模拟体内胚泡的着床过程：在获取时，胚胎被透明 带(zona pellucida,ZP) 包围。体外培养时，ZP的变 薄、破裂将诱导囊胚向灭活的细胞饲养层贴附。 囊胚逐渐脱离ZP，开始向饲养层贴附，注意不要轻 易晃动培养板，至少保证孵育箱门关闭48小时，接 种2-3天后观察并更换培养基。 囊胚贴附后，细胞将很快贴着饲养层表面长出，随 后几天要注意观察，确定首次分散的最佳时机。
序一致。
karyogram of a mouse ES cell with 2n= 40. Color karyotyping demonstrates a trisomy for chromosome 8 and the absence of the Y chromosome
目前建立的大多数小鼠ESCs系都是XY型， XY型小鼠ESCs比XX型的核型容易维持。 XX型ESCs系在传代过程中常发生一条X染 色体缺失，不容易维持其二倍体核型，2条 X染色体存活似乎对细胞增殖不利。 ESCs保持核型完整与多种因素有关，如饲 养层细胞类型、细胞传代程序、培养液构 成及其稳定、细胞性别以及小鼠品系等。
1.7 病原体的排除
从活体动物衍化ES细胞，总是伴随着将动
物病原体传播到组织培养物的风险。因此， 要分别使用各自的培养基、试剂、超净台和
孵育箱，直至建立的细胞系经过筛查而确保
没有病原体。
二、影响小鼠ES细胞建系效 率的因素
2.1遗传背景
最容易衍生的小鼠品系是内交129亚系，但该
亚系存在特征描述不充分、解剖和行为异常的 缺点。
A 将高质量的囊胚接种在MEF上，准备进行ES细胞 的衍化；B 处于孵化后期的胚胎；C 贴附的胚胎； D 生长变大
E 可以见到ES样细胞区域; F 区域变大，适合 分散
首次分散的时间是成功建立ES细胞系最
关键的因素：分散太早，没有足够的细
胞量；太晚，细胞开始分化，形成特异 性的细胞类型而不再是ES样的克隆。
三、小鼠ES细胞系的特征描述
3.1 细胞形态
小鼠 ESCs大小处于7~18μm之间，胞核大，胞核内有多个 核仁，胞浆少，核质比高，与胚胎细胞相似。
体外培养时，ESCs呈集落状生长，形成隆起、致密、折光
性强和边界清晰的细胞集落，集落形态多呈岛状或鸟巢状，
呈圆性、椭圆性、纺锤性或梭形等，集落内细胞排列致密，
传代时要小心、反复吹打，使细胞分散成单细胞悬
液。如果接种的是小细胞团的话，就会引发ES细
胞分化。
1.6 ES细胞系的冻存
ES细胞系的质量的关键是确保其较低代数。早期
代数的细胞以后可以扩增出一个细胞系；在此过
程中，应该连续冻存每一代细胞。
最宝贵的早期代数瓶是很容易丢失的，因此除了
将这些“宝贝”用于开始的特征描述和扩增，不 要浪费在其他用途上。
胞培养的标准操作规程传代。通常把首次接种到
较大面积的细胞记为第一代。
1.5 ES细胞的传代培养
不要等到细胞铺满使培养基极度酸化时再传代；要
避免继续分裂的细胞死于极度拥挤和营养耗竭。
传代可望收获3×105个细胞/cm2，再以2×104个
/cm2的密度接种。规律更换培养基，大约3天左右
传一次代。
固定，Giemsa染色。通过形态和染色鉴定 ES细胞克隆。分化细胞的克隆着色浅淡。 计数克隆总数和ES细胞克隆占克隆总数的 比例。
2.3 提高效率的改良技术
初次接种时，将培养基中的FBS增加至
25%。 选用低糖DMEM，并在培养基中添加核 苷。 分离延迟发育的胚胎，即经卵巢切除和 使用孕酮而不能植入的胚胎 接种前使用免疫溶解法去掉囊胚外面的 滋养层细胞。
分散过程要注意使用温和的手段，将外
生物分散成含有5-10个的小细胞团。
1.4 首个ES细胞样克隆的扩增
经过首次分散后，通常生长缓慢，需要耐
心等待小克隆的出现，一旦确定细胞生长， 就要再次每天观察培养物。 可能三种生长情况：
非ES样/细胞类型的克隆生长；
主要为ES样克隆的生长；
ES样克隆和混合细胞类型克隆的生长。
第四课
小鼠胚胎干细胞 的培养和分化
内容提要
1.
2. 3.
小鼠ES细胞建系过程和关键所在
影响小鼠ES细胞建系效率的因素 小鼠ES细胞的特征描述
1.1 胚泡来源
延迟着床方法获得的延迟胚泡
自然状态下合笼获得的正常胚泡 超排卵法得到超排卵胚泡
通过核移植的途径获得重构胚,
进而获得胚
泡。
延迟植入囊胚步骤
DEVELOPMENTAL DYNAMICS 235:2460 –2469, 2006
1.2 饲养层准备
饲养层能够抑制ES 细胞的分化, 一般认为是 由于饲养层可以分泌白血病抑制因子( LIF) 以及成纤维细胞生长因子(FGF), 前者是释放 到培养基中, 后者结合在饲养层的细胞膜上。 有两种细胞可以充当饲养层细胞：STO细胞 和小鼠原代成纤维MEF细胞。
要求：新鲜配制、理想密度、代数较低。
STO成纤维细胞
STO细胞是来自SIM小鼠的成纤维细胞，广 泛用于多潜能畸胎瘤细胞及胚胎干细胞的培 养。
STO作为连续细胞系具有明显优点：连续传 代，易生长；但应特别注意保持STO细胞生 长的最佳条件，密度不能太高，传代20-30 次后，应重新复苏。
STO饲养层的制备
病原体检查不但有利于将来使用这些ES细 胞生成不含特殊病原体SPF动物，而且还有 利于避免将病原体传染给其他细胞培养物。 最常见的病原体是支原体。
3.3 核型分析
核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色
体数目、大小、形态特征等。
核型分析是指在对染色体进行测量计算的基础上，进
行分组、排队、配对并进行形态分析的过程。核型分
AP staining of mouse ES Cells
端粒与端粒酶
端粒是位于染色体末端的特殊DNA-蛋白质结 构, 由一段TTAGGG重复DNA序列及相关蛋 白质组成。其长度作为评估细胞分裂及细胞 衰老的生物时钟，它在每一次细胞分裂中都 会缩短50~100bp，但可以被端粒酶修复。
STO细胞在10cm培养皿中铺满后，用 DMEM/10%NCS+10μg/ml丝裂霉素C孵育 2-3小时。
PBS洗涤——胰酶消化——洗涤——培养 基重悬——接种明胶包被的培养皿备用 （不超过一周）。
STO feeder cell
MEF饲养层的制备
MEF取自交配日后12.5d的ICR孕鼠，3-6代
有人提出使用交替使用胎牛血清和血清替代
物的解决方案，可以达到75%的成功率（一 般是25%）。
集落形成试验检测培养条件
在6孔板中加入待测培养基（2ml/孔），添 加物为终浓度的两倍；如果检测血清，则 需要设置5%、10%和20%三种浓度。 ES细胞半铺满时，通过胰酶消化，最终用 无血清培养基分散ES细胞成单细胞悬液， 以103个/ml的密度重悬于生长培养基。 每孔加入2ml细胞悬液，使添加物在4ml终 体积中为1×，正常培养6-8天。
雌、雄合笼过夜，次晨检查雌鼠阴道栓，有 栓雌鼠分开饲养（记为0天）。
Hale Waihona Puke 第二天通过腹腔注射10μg它莫西芬和1mg Depo-Provera，来降低雌激素水平而保持孕 激素水平。
在第6-8天处死动物，冲洗宫腔获得延迟植入 囊胚，其个体较大，外观略粗糙，常有清晰 可见的ICM。
使用延迟植入囊胚并不影响胚胎的贴壁, 主 要是在ICM 的增殖方面明显地优于正常的胚 泡, 因此也对后来的ES 细胞集落的出现和生 长带来有利的影响。
析用于确定细胞系的性别以及检测可能存在的染色体
畸形。一个成系的ESCs系应该具有70%以上核型完整
的细胞。
核型分析方法
标准G带法：将中期染色体制片经过胰酶或热、碱 、尿素、去垢剂处理后再用 Giemsa染料染色后呈
现的染色体区带。一般至少需要分析20-30个中期
铺片。
ESCs核型分析方法与体细胞没有区别，总体上程
如果6天以后还未可见的细胞生长或只有非
ES样的克隆，即可放弃培养
A 混有多种细胞类型的克隆；B 已经分化了的非ES样细胞 C 典型ES样克隆； D 仅含ES细胞的小克隆
对于既有ES样克隆又有混合细胞类型的克隆的情 况，在轻柔分散后挑取单个的小克隆，转移到备 有新鲜培养基的新孔中培养。