高级微生物学湖南农业大学4ppt课件
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可用于肉类和乳制品的计数:用于乳制品计数时，其结果与 SPC法和培养直接计数法的结果相似，此法在10min中内可检测 出乳制品中的活性G－和全部G十菌，2min 可计算经热处理的乳 制品中的微生物（数量少至5700cfu/ml）。
23.02.2020
14
1.3.2 DEFT—微菌落计数：
可用于细胞的直接显微检测，且用于活性 细胞的检测。食品匀液经DEFT膜过滤，将膜放 在培养基表面恒温培养至微菌落长出。G-培养 3h，G十培养6h，在8h内可检测到大肠杆菌、假 单胞菌和葡萄球菌，且其数量少至103cfu/g， 长出的微菌落必须用显微镜观察。
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12
1.3 膜过滤法
过滤膜的孔径通常为0.45 µ m ，故水和 溶质能通过而细菌不能通过膜。将一定体 积的样品经膜过滤后收集菌体，再将膜放 在琼脂平板或充满选择性培养基的吸收垫 上进行培养。对长出的菌落进行计数，或 进行DMC计数。在计数时，膜经过适当染 色、冲洗和处理，能用显微镜观察计数。 但一张膜只能过滤少量的样品匀液。
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1.4 琼脂滴计数法
由Sharpe和Ki1ahy 所发明。
食品的匀液样品与试管中巳熔融琼脂（45OC）混合均匀并 稀释。每个样品用3个琼脂管，第一支试管中加入1mL样品， 混匀后，取1支灭菌的毛细吸管（最好1滴0.033mL）,吸取 0.1mL 液体加入一无菌皿的底部，重复5次，并使5滴液体成 行排列。再用同一吸管在第1支试管中吸取1mL加入第2支试管 中混匀，同前操作5滴液体排列在第二行；然后重复操作第三 管，平皿中形成第三排5滴。将含有琼脂滴的培养皿恒温培养 24h，然后在显微镜下观察微菌落。用此法可检测纯培养物、 蔬菜和肉制品中微生物，结果悄高于 SPC 法；但快速，24h 的结果同于SPC 法 48h 的结果，且此法不需空白稀释液，每 个样品仅使用一个培养皿。
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15
1.3.3 防水网格过滤膜过滤技术：
是Sharpe和Michaud所发明，可用于各种 食品中的微生物检测计数。所用膜为特殊的含 有1600个腊质网格的防水膜，每一格中限制微 生物的生长和菌落大小。每个膜可通过MPN自 动计数，此法可检测的最小细胞数为10cfu/g， 在24h 内可得结果，可用于所有cfu的检测。 可用来检测大肠菌群、沙门氏菌、酵母菌、霉 菌数。
数量； （11）其他竟争性或拮抗
微生物的存在。
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7
SPC法大多采用倾注平板(混菌)的方法，也 有的采用涂布平板法。都可称稀释平板计数法。
涂布平板法的优点在于可检测到热敏性菌体， 而在倾注平板法中这些菌在熔融的琼脂培养基中 则不能生长。如果要鉴定某种单菌落时，则以涂 布平板法较好；检测严格好氧菌也以涂布法为好； 涂布法的主要缺点是涂布物问题和菌落重叠混杂 的问题。
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使用时，在两片薄膜中间滴加一滴样 品稀释液，通过挤压将菌液分布在营养区， 恒温培养后，非选择性培养薄膜的生长菌 落呈红色，因为在营养阶段有四唑染料存 在。检测大肠杆菌的干燥培养基是采用 β—葡糖苷酸酶作为基质，使大肠杆菌菌 落周围呈蓝色晕圈与其他菌落相区别开来， 其结果与MPN法相似。
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1.3.4 干燥薄膜计数法
该方法是3M公司创立发展的，并设计了 Perrifilm膜，将两片塑料膜粘在一起，在一边膜 上涂布培养基成分和溶于冷水的凝胶剂，可以使 用非选择性培养基，并进行好氧培养计数 （APCs），若使用选择性培养基则可检测特殊 菌群（如检测大肠杆菌），此法是一种标准微生 物计数法。
第四章
食品中的微生物 及其产物的测定
23.02.2020
1
主要内容 一、食品中微生物的培养与观测 二、理、化、免疫学鉴测法
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2
第一 节
食 品 中微 生 物 的 培 养与 观 测
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3
现代微生物学的知识和技术使 人们能够全面地检测未知的微生物 类群，同时发现这些微生物的功能 性状及基因多样性。
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13
1.3.1 直接荧光膜技术（DEFT）： 是荧光染色与荧光显微技术的结合，是一种快速的食
品微生物检测技术。如用 5µ m尼龙膜过滤食品样液，滤出液 用2ml氚X—100和 0.5ml 胰岛素（用于溶解畜肉体的细胞、防 膜被堵塞）处理，经一段时间培养后，处理的滤出液用0.6µ m 孔的核聚碳酸酯膜过滤，然后滤膜用吖啶橙染色，对染色后 的菌体进行荧光显微技术计数，将显微计数器每一区域的平 均数量相加得到每克细胞数，25～30min 内可得到结果。
6
在计数时应考虑以下因素：
（1）采用的取样方法； （2）微生物在样品中的分
布情况； （3）食品中生物群的特
性； （4）食品原料的特性； （5) 食品的预检过程；
（6）所用培养基的营养情 况；
（7）培养温度和时间； （8）培养基的pH，Aw和
氧化还原电势（Eh） （9）Hale Waihona Puke Baidu释剂的类型； （10）食品样品中的相对
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11
优点在于：所用的琼脂少，所需的培养皿、 稀释液空白、吸管要少，每小时可检测的样品为 标准培养法的3-4倍，每小时可涂布50-60个平板， 且操作中不需调试。 其缺点是，食品样品中的 颗粒可能会使注射器的针头堵塞。此法更适合牛 乳等液体食品。在此法中也可应用激光计数器。 由于设备较贵，使用机会少。可详见《细菌学分 析手册》
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4
检测食品中微生物总数的方法通常有4 种：
活性细胞的标准平板计数法（SPC）； 活性和非活性细胞的显微直接计数法（DMC法） ； 各种细胞的统计学检测法即最近似数测定法
（MPN）； 染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞
的总数。
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一、活性细胞的标准平板计数法（SPC） 1.1 传统计数法：
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平皿菌落(倾注法)计数：
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9
涂布和倾注法
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10
1.2 旋转平板法：
用一种特制的散布器从平板中心移至外 围，将样品涂布在阿基米德旋转平板上，所 附备的特殊注射器不断增加散布样品的体积 数量，使得在一个平板上的浓度范围达到 10000:1。在适当温度下培养，平板中心的菌 落浓度较高，边缘的浓度较低。 通过一种特 殊的格状计数器对旋转平板的菌落计数。
标准平板计数法(standard plate count. SPC) 是检测食品中单位质量或单位体积 样品在培养基上形成的菌落数，称为菌落 形成单位数(colony forming units,)。 是食品工业中检测食品中菌数(含食品中 的菌落总数、霉菌、酵母菌数或致病菌数) 的最常用的方法。
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1.3.2 DEFT—微菌落计数：
可用于细胞的直接显微检测，且用于活性 细胞的检测。食品匀液经DEFT膜过滤，将膜放 在培养基表面恒温培养至微菌落长出。G-培养 3h，G十培养6h，在8h内可检测到大肠杆菌、假 单胞菌和葡萄球菌，且其数量少至103cfu/g， 长出的微菌落必须用显微镜观察。
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1.3 膜过滤法
过滤膜的孔径通常为0.45 µ m ，故水和 溶质能通过而细菌不能通过膜。将一定体 积的样品经膜过滤后收集菌体，再将膜放 在琼脂平板或充满选择性培养基的吸收垫 上进行培养。对长出的菌落进行计数，或 进行DMC计数。在计数时，膜经过适当染 色、冲洗和处理，能用显微镜观察计数。 但一张膜只能过滤少量的样品匀液。
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1.4 琼脂滴计数法
由Sharpe和Ki1ahy 所发明。
食品的匀液样品与试管中巳熔融琼脂（45OC）混合均匀并 稀释。每个样品用3个琼脂管，第一支试管中加入1mL样品， 混匀后，取1支灭菌的毛细吸管（最好1滴0.033mL）,吸取 0.1mL 液体加入一无菌皿的底部，重复5次，并使5滴液体成 行排列。再用同一吸管在第1支试管中吸取1mL加入第2支试管 中混匀，同前操作5滴液体排列在第二行；然后重复操作第三 管，平皿中形成第三排5滴。将含有琼脂滴的培养皿恒温培养 24h，然后在显微镜下观察微菌落。用此法可检测纯培养物、 蔬菜和肉制品中微生物，结果悄高于 SPC 法；但快速，24h 的结果同于SPC 法 48h 的结果，且此法不需空白稀释液，每 个样品仅使用一个培养皿。
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1.3.3 防水网格过滤膜过滤技术：
是Sharpe和Michaud所发明，可用于各种 食品中的微生物检测计数。所用膜为特殊的含 有1600个腊质网格的防水膜，每一格中限制微 生物的生长和菌落大小。每个膜可通过MPN自 动计数，此法可检测的最小细胞数为10cfu/g， 在24h 内可得结果，可用于所有cfu的检测。 可用来检测大肠菌群、沙门氏菌、酵母菌、霉 菌数。
数量； （11）其他竟争性或拮抗
微生物的存在。
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SPC法大多采用倾注平板(混菌)的方法，也 有的采用涂布平板法。都可称稀释平板计数法。
涂布平板法的优点在于可检测到热敏性菌体， 而在倾注平板法中这些菌在熔融的琼脂培养基中 则不能生长。如果要鉴定某种单菌落时，则以涂 布平板法较好；检测严格好氧菌也以涂布法为好； 涂布法的主要缺点是涂布物问题和菌落重叠混杂 的问题。
23.02.2020
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使用时，在两片薄膜中间滴加一滴样 品稀释液，通过挤压将菌液分布在营养区， 恒温培养后，非选择性培养薄膜的生长菌 落呈红色，因为在营养阶段有四唑染料存 在。检测大肠杆菌的干燥培养基是采用 β—葡糖苷酸酶作为基质，使大肠杆菌菌 落周围呈蓝色晕圈与其他菌落相区别开来， 其结果与MPN法相似。
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1.3.4 干燥薄膜计数法
该方法是3M公司创立发展的，并设计了 Perrifilm膜，将两片塑料膜粘在一起，在一边膜 上涂布培养基成分和溶于冷水的凝胶剂，可以使 用非选择性培养基，并进行好氧培养计数 （APCs），若使用选择性培养基则可检测特殊 菌群（如检测大肠杆菌），此法是一种标准微生 物计数法。
第四章
食品中的微生物 及其产物的测定
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1
主要内容 一、食品中微生物的培养与观测 二、理、化、免疫学鉴测法
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第一 节
食 品 中微 生 物 的 培 养与 观 测
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现代微生物学的知识和技术使 人们能够全面地检测未知的微生物 类群，同时发现这些微生物的功能 性状及基因多样性。
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1.3.1 直接荧光膜技术（DEFT）： 是荧光染色与荧光显微技术的结合，是一种快速的食
品微生物检测技术。如用 5µ m尼龙膜过滤食品样液，滤出液 用2ml氚X—100和 0.5ml 胰岛素（用于溶解畜肉体的细胞、防 膜被堵塞）处理，经一段时间培养后，处理的滤出液用0.6µ m 孔的核聚碳酸酯膜过滤，然后滤膜用吖啶橙染色，对染色后 的菌体进行荧光显微技术计数，将显微计数器每一区域的平 均数量相加得到每克细胞数，25～30min 内可得到结果。
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在计数时应考虑以下因素：
（1）采用的取样方法； （2）微生物在样品中的分
布情况； （3）食品中生物群的特
性； （4）食品原料的特性； （5) 食品的预检过程；
（6）所用培养基的营养情 况；
（7）培养温度和时间； （8）培养基的pH，Aw和
氧化还原电势（Eh） （9）Hale Waihona Puke Baidu释剂的类型； （10）食品样品中的相对
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优点在于：所用的琼脂少，所需的培养皿、 稀释液空白、吸管要少，每小时可检测的样品为 标准培养法的3-4倍，每小时可涂布50-60个平板， 且操作中不需调试。 其缺点是，食品样品中的 颗粒可能会使注射器的针头堵塞。此法更适合牛 乳等液体食品。在此法中也可应用激光计数器。 由于设备较贵，使用机会少。可详见《细菌学分 析手册》
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检测食品中微生物总数的方法通常有4 种：
活性细胞的标准平板计数法（SPC）； 活性和非活性细胞的显微直接计数法（DMC法） ； 各种细胞的统计学检测法即最近似数测定法
（MPN）； 染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞
的总数。
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一、活性细胞的标准平板计数法（SPC） 1.1 传统计数法：
23.02.2020
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平皿菌落(倾注法)计数：
23.02.2020
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涂布和倾注法
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10
1.2 旋转平板法：
用一种特制的散布器从平板中心移至外 围，将样品涂布在阿基米德旋转平板上，所 附备的特殊注射器不断增加散布样品的体积 数量，使得在一个平板上的浓度范围达到 10000:1。在适当温度下培养，平板中心的菌 落浓度较高，边缘的浓度较低。 通过一种特 殊的格状计数器对旋转平板的菌落计数。
标准平板计数法(standard plate count. SPC) 是检测食品中单位质量或单位体积 样品在培养基上形成的菌落数，称为菌落 形成单位数(colony forming units,)。 是食品工业中检测食品中菌数(含食品中 的菌落总数、霉菌、酵母菌数或致病菌数) 的最常用的方法。
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