蛋清溶菌酶提取技术的研究

在医药上，溶菌酶可与血液中的病毒结合，阻ｌｒ流感、腺病毒等的繁殖：能分解粘多糖， 有利于脓汁、痰液的排出：能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸 菌的繁殖等作＿｝｝ｊ。另外，它与抗生素联合虑用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎 等多种疾病（缪辉南，１９８５）。蛀牙的主要原冈是口腔中存在突变链球曲，能把蔗糖合成为葡 萄糖和粘多糖物质。口腔中的细菌与这些物质粘合在一起，并相互凝聚沉积住才齿表面，牙垢 细菌在齿垢中厌氧发酵多糖产生多种有机酸，这些有机酸从牙齿表面的珐琅质中置换出钙，形 成虫牙。若在牙膏、漱口水、口腔清洁剂、口香糖中添加一定量的溶菌酶，Ｊｌ！ＩＪ可以杀，￡这些病 菌，达到防【ｒ虫牙的目的。同样，可用溶菌酶来制眼药水、润喉液。
中国农业大学 硕士学位论文 蛋清溶菌酶提取技术的研究 姓名：姜馗 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：郭顺堂
20050501
摘要
溶菌酶是糖苷水解酶，分子量１４０００Ｄａ～１５０００Ｄａ，溶菌酶能水解Ｎ一乙酰葡萄糖胺与Ｎ一乙酰 胞壁酸之间的Ｂ一１．４糖苷键，因此可以溶解革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作瑚。溶苗酶的用 途很多，它可以作为防腐剂应用在食品、饮料中，在医学上可以用作杀菌剂。
住食品、饮料中使用溶菌酶，集药理、保健和防腐＝个功能于一体，且做为一种天然蛋闩 质无任何副作用。溶菌酶的加入补充了人体内的１Ｆ特异性免疫网子，杀步Ｅ肠道内的腐败球菌， 维持肠道内菌群正常化，促进舣歧杆菌增殖，增强抗感染力。加入饮料中，如钙奶、乳酸饮料 中．也可起到防蛀牙、爽口的作用。特别是母乳化奶粉，对婴幼儿的成长十分重要。牛奶中的 溶曲酶含茸极少，而母乳中的溶菌酶含簧十分丰富（李桂英，１９９４）。为弥补奶粉的不足，可以 向其中添加适量溶菌酶，制成母乳化奶粉。溶菌酶的加入，可以加强婴幼儿的抗感染能力。
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豳卜１溶曹酶的分子结构示蠢图 Ｆｉｇｕｒｅ Ｉ－！Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆＬｙｓｏｚｙｍｅ
１．１．２溶菌酶的作用部位
显示溶菌酶溶菌机制的早期研究，主要是用显微镜进行观察的。当细菌细胞用酶处理时， 便出现暂时性膨胀，然后逐渐呈现透明状态。由于包裹细胞的多糖类物质发生变化，细胞通透 性增人，细胞的内含物扩散，可观察到溶菌现象。当时对微生物细胞结构的认识尚不清楚，精
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性（ｐＨ７．Ｏ）或酸性（ｐＨ５．０）条件Ｆ均能抑制它的生长。由于溶菌酶的安全性高，近来对用溶 菌酶进行食品防腐的需求与日俱增。
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ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｎｄ ｅｇｇ ａｌｂｕｍｉｎ．Ｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｔｈｏｄ
关键词；溶菌酶，热处理，离子交换，超滤，纯化
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｉｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ，ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｉｓ ａｂｏｕｔ
１４０００—１５０００Ｄａ．Ｌｙｓｏｚｙｍｅ Ｃａｎ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｂｏｎｄ １３－１，４ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｎ－ａｅｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ
ｆｏｏｄ ａｎｄ ｄｒｉｎｋ ｆｉｅｌｄｓ ａｓ ａｎｔｉｓｅｐｔｉｃ
ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｏｍａｉｎ“ｇｅｒｍｉｃｉｄｅ．
Ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｓｕｃｈ ａｓ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｉｏｎ
１．１．３溶菌酶的应用
自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的鼻涕、唾液、眼泪、尿、 血浆、乳汁、淋巴液及鼻黏膜、肠道、腮腺、白细胞、肺、肝、脾、肾的细胞中，以及植物界 中的卷心菜、萝ｈ、无花果、术瓜、大麦中，但以蛋清中含量晟丰富（李宗孝，２００１），约。々
３．６％。
溶菌酶的用途很多。它可以作为防腐剂（李德海，２００２），溶菌酶本身是－－｛ｅｅ天然蛋白质， 无毒性，是一种安全性高的食品添加剂。同时溶菌酶仅能作用于目的微生物的细胞壁，而不能 作用丁其它物质。使用前，应对有关食品的腐败现象作充分的分析研究。若大部分是由革兰式 阡ｆ性菌引起的，溶菌酶能够十分有效地分解这些菌株。食品腐败时早期出现的微生物通常是该 食晶特有的微生物，如枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、扩展短杆菌、保加利瓶乳杆菌，无论在中
薹地 研究生签名：
时间： 孑村年６月／胡
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ａｎｄ Ｎ．ａｃｅｔｙｌ ｍｕｒａｍｉｅ ｍｉｄ，ＳＯ ｔｈａｔ ｉｔ ｃａｎ ｄｉｓｓｏｌｖｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｉｌ ｏｆ ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ
ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｚｅ．Ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｍａｎｙ ａｒｅａｓ，ｆｏｒ
中固农业人学瑚｝：学位论文
第一章绪论
制的溶菌酶在分解过程中是作用细胞质膜还是作用细胞壁多糖，未得到明确答案。其后经历了 相当长的探索阶段，到１９５１年，索尔顿（Ｓａｌｔｏｎ）等人用极近似自然形态的微生物，如巨人芽 孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、溶壁微球菌、藤黄八雹球菌（Ｓａｒｃｉｎａ ｌｕｔｅａ）等，成功地制备了 细胞壁，并观察了细胞壁在溶菌酶作用下完全溶解的情况，从而证明溶菌酶是细菌细胞壁的溶 解酶。后来，魏伯尔（Ｗｅｉｂｕｌｌ）采用不同的方法再次验证了这个结论。例如，他把对数增殖期 的巨大芽孢杆菌的细胞悬浮在Ｍｇ’商渗溶液中，再崩溶菌酶进行处理，发现菌体细胞形成裸褥 的圆形细胞。
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中国农业大学碗．１。学位论文
第一章绪论
第一章绪论
１．１研究目的和意义
１．１．１溶菌酶
溶菌酶Ｅ．Ｃ ３ ２．１．７是糖苷水解酶，别名球蛋向Ｇ．胞壁质酶。Ｎ乙酰胞鼙质聚糖水解酶。 是一种碱性蛋白质，分子量１４０００－１５０００，等电点１１左右。可以溶解革兰氏附｜生曲的细胞鼙而 具有溶菌作用，这是溶茁酶应用的基础，也是它得名的原因（Ｇｈｕｙｓｅｎ，１９６８）。溶菌酶发挥溶菌 作用的最适ｐＨ值在６．５左右（李宗孝，２００１），其最佳反应温度和进行溶苗作Ｈｊ的温度是一致 的，都要求在低于５００Ｃ范围内。商品溶菌酶是向色冷冻干粉或结晶，溶于水．不溶于丙酮、乙 醚，无臭、味甜。
目前已研究过的能溶解微生物细胞壁的溶菌酶可以分为细菌细胞壁溶菌酶、酵母和霉菌细 胞蹙溶菌酶二种。鸡蛋卵清溶菌酶属丁细菌细胞琏溶酶酶。卵清溶菌酶是内一Ｎ一乙酰壁酰胺酶 （Ｂ．Ｈ．ｃＨＩＡＮＧ，１９９３），其主要作用位点是细菌细胞壁１３－１．４糖苷键，溶菌酶的分子结构如图 １－１所示。
细菌细胞肇的主要成分为肽聚糖（Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）。肽聚糖是由Ｎ一乙酰氮基葡萄糖 （Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ简称ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ一乙酰胞壁酸（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｃ ａｃｉｄ简称Ｍｕｒ Ｎａｃ）和 一种小肽（Ｌ一丙氨酸、Ｄ一谷氨酸、二氨基庚．二酸、赖氨酸或其它氨基酸构成的四肽）构成的。
ｉｓ ｕｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ．ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｆｆｅＣｔ ａｎｄ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｉｎｅｆｉｅｃｔｉｖｅ，ｗｈａｔ’Ｓ ｍｏｒｅ，ｃｈａｎｇｉｎｇ ｐＨ ａｎｄ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｇｒｅａｔｌｙ，Ａｎｄ ｔｈｅ
１９５９～１９６３年．索尔顿、占伊森（Ｇｈｕｙｓｅｎ）、让洛兹（Ｊｅａｎｌｏｚ）等人终丁清楚了溶菌酶 是一种能够切断Ｎ一乙酰葡萄糖胺与Ｎ一乙酰胞壁酸之间的１３－１．４糖苷键的酶（船津， １９８２）。溶菌酶对Ｎ一乙酰葡糖胺底聚物的分解机制如图卜２所示。
圈卜２溶菌酶对Ｎ一乙酰葡糖胺底聚物的分解机制 Ｆｉｇｕｒｅｌ－２ Ｔｈｅ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｙ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ
本研究比较了热处理法、离子交换法和超滤法从蛋清中提纯溶菌酶的效果，深入研究了适合 批量生产溶菌酶的方法。实验结果表明，热处理法得到的溶茁酶的纯度和收率远低丁Ｉ离子交换法， 且调ｐＨ值和热处理对溶簋酶的活性会有很大破坏，并造成了处理后的蛋消无法进行重复利用， 人人降低了实际生产价值。采用离子交换法，用０．２８ｍ０１／Ｌ氯化钠溶液可以将树脂吸附上的溶菌 酶充分洗脱，最佳吸附条件为：常温，树脂和蛋清的体积比为ｉ：６．１８，蛋清ｐＨ值为６，稀释２ 倍，搅拌吸附８０分钟，这时吸附到的溶菌酶的活性和收率是最好的，溶菌酶纯度可达到卣分之 百，最终得到的溶菌酶收率为８６．６％，活性为２００００Ｕ／ｍｇ。超滤法用３００００道尔顿的膜来纯化溶 菌酶，采用连续式方式将蛋清截留液稀释３倍效果较好，最后得到的溶菌酶纯度为１００％，收率为 ７３．１％，活性为１８５００Ｕ／ｍｇ。
ＫｅｙＷｏｒｄ：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｉｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
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独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。
ｔｒｅａｔｅｄ ｅｇｇ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅａｎｓ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｒｅｃｙｃｌｅｄ ａｎｙ ｍｏｒｅ，ｔｈｕｓ ｔｈｉｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ
ｖａｌｕｅ ｌａｒｇｅｌｙ．Ｂｙ ｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｔｈｏｄ，０．２８ｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃａｎ ｅｌｕｔｅ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ
ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｆｒｏｍ ｒｅｓｉｎ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；１：６．１ ８ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ
ｒｅｓｉｎ ａｎｄ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ；ｐＨ６ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ；２ ｔｉｍｅｓ ｄｉｌｕｔｉｏｎ；８０ ｍｉｎｕｔｅｓ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｉｍｅ．Ｕｎｄｅｒ ｓｕｃｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ａｃｈｉｅｖｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆＬｙｓｏｚｙｍｅ，ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ２００００Ｕ／ｍｇ ａｎｄ ８６．６％．ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｌｆｙ ｏｆ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｉｓ １００％．Ｗｈｉｌｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｗｉｔｈ ３００００Ｄｅ ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｃｏｕｌｄ ｇａｉｎ １００％ｐｕｒｉｔｙ，１８５００Ｕ／ｍｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ７３．１％ｙｉｅｌｄ．
Ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｂａｓｉｃ ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｌｅ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｎｄ ｅｇｇ ａｌｂｕｍｉｎ，３００００ Ｄａ ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ