PCR技术的原理及应用PPT课件
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PCR技术教程PPT课件
Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
第10页/共71页
特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
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第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
PCR的基本原理和应用 PPT课件
PCR 的 基 本 原 理 和 应 用
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
PCR技术的原理与应用ppt课件
2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
PCR的原理与应用课件
加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
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cDNA序列的克隆
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（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
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EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
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第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
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(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
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Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
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PCR原理及其操作PPT课件
精选PPT课件
34
① 变性温度与时间：
• 一般93℃～94℃，1min足以使模板 变性
– 若低于93℃则需延长时间 – 但温度不能过高，因为高温环境对酶的
活性有影响。
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35
② 退火(复性)温度与时间：
• 退火温度是影响PCR特异性的重要 因素
• 退火温度与时间，取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度，还有靶基因序列 的长度
• 复性时间一般为30～60s，足以使引 物与模板之间完全结合
精选PPT课件
37
③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min
使
①双链DNA变成单链，
②单链DNA与人工合成的引物退火，
③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延
伸为双链D精N选PAPT课。件
3
PCR反应体系
• 4种dNTP混合物 • 引物 • 模板DNA • Taq DNA聚合酶 • Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
此循环反复进行，可使目的DNA得 以迅速扩增。
精选PPT课件
22
理 论 扩 增 率 ： 2n 递 增 （ n 为 循 环 次 数 ） ， 25 ～ 30 循 环 ， 目 标 DNA 可 增 加109倍。
实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的 实际扩增率，平均约为75%。
由 于 引 物 和 底 物 的 消 耗 ， 酶 活 力 的 下降等因素，扩增产物的增加，逐渐 由指数形式变为线性形式，所以实际 上进行30个循环后，扩增倍数一般可 达106～107。
PCR技术原理及其应用ppt课件
（4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多：非特异扩增增加
38
（三）PCR产物的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学 原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的 DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产 物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般 要进行25次以上PCR循环。
PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
2
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
39
PCR产物的积累规律示意图
40
五、PCR引物的设计
（一）一般原则
①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特 异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合 成引物的成本增加。
②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的 嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。
41
③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以 免形成二聚体。
④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变 性。
42
⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产 物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。
次数过多：非特异扩增增加
38
（三）PCR产物的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学 原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的 DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产 物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般 要进行25次以上PCR循环。
PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
2
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
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PCR产物的积累规律示意图
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五、PCR引物的设计
（一）一般原则
①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特 异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合 成引物的成本增加。
②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的 嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。
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③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以 免形成二聚体。
④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变 性。
42
⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产 物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。
PCR-技术及应用PPT课件
dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
PCR技术ppt课件
组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
《PCR技术及应用》PPT课件
•引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
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Excitation
SYBR-Green I
5’
SG SG
3’
Emission
SG
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3’
SG
5’
SG
50
SYBR-Green I
DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
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DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
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PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
PCR技术的原理及其应用ppt课件
③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下， 以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模 板和Mg2+。
多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩 增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体 感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原 微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失 存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其 型别及突变等。
合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒 DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之 处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中 形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来 判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为：
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础 上；
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模 板和Mg2+。
多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩 增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体 感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原 微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失 存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其 型别及突变等。
合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒 DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之 处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中 形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来 判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为：
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础 上；
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
PCR原理ppt课件
1. 长片段DNA的PCR扩增 常规PCR长度为2kb以下。 长片段PCR扩增存在的问题： （1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低 （2）高温会损坏模板DNA和PCR产物 （3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解 （4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
PCR技术PPT课件
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
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DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
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3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
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四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
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10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
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扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
.
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸 年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
.
生物样品
• PCR的特点
第2轮结束
.
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
.
提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
.
实时荧光定量PCR定义
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
PCR技术的原理及应用
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
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子链延长
3’ 解旋酶解链酶
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA片段
断基 疗基 品基 测法究人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 程 检研 产
.
……
段扩 增 特 定
片
DNA
基因组DNA 获取特定DNA片段
.
DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的 测序技术
.
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
（℃）
55
22
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
.
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
.
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
.
实时荧光定量PCR 原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
.
.
实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
55
22
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
.
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
.
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检 测。
.
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中 每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲 线的分析对起始模板进行定量分析。
3’
5’
.
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971 年 ， Khorana 提 出 ： 经 过 DNA 变 性 ， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及 70年代基因工程技术的发明使克隆基 因成为可能，所以，Khorana的设想被 人们遗忘了……
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
.
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
.
94℃
55℃
37℃
.
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 60 性 40
20
(%)
40 50 60 70 80 90
100
温度. (℃)
94℃
55℃
72℃
PCCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物
引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
.
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
• PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
.
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
.
PCR的基本原理 • Taq•
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
.
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
.
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸 年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
.
生物样品
• PCR的特点
第2轮结束
.
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
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提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
.
实时荧光定量PCR定义
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
PCR技术的原理及应用
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA片段
断基 疗基 品基 测法究人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 程 检研 产
.
……
段扩 增 特 定
片
DNA
基因组DNA 获取特定DNA片段
.
DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的 测序技术
.
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
（℃）
55
22
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
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实时荧光定量PCR 原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
.
.
实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
55
22
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
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实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检 测。
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实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中 每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲 线的分析对起始模板进行定量分析。
3’
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971 年 ， Khorana 提 出 ： 经 过 DNA 变 性 ， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及 70年代基因工程技术的发明使克隆基 因成为可能，所以，Khorana的设想被 人们遗忘了……
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
.
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
.
94℃
55℃
37℃
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Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 60 性 40
20
(%)
40 50 60 70 80 90
100
温度. (℃)
94℃
55℃
72℃
PCCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物
引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
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PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
• PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
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PCR的基本原理 • Taq•
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃