最新化学发光免疫技术(1)课件ppt
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人民卫生出版社
3.化学发光
• 某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过 程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间 态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态 回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量， 这一现象称为化学发光。
人民卫生出版社
• 一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以 下条件：
化学发光免疫技术(1)
第二十一章 化学发光免疫技术
人民卫生出版社
本章要点
1.化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。 2.化学发光免疫分析的基本原理及其技术类 型。 3.化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技 术。 4.电化学发光免疫分析基本原理。 5.化学发光免疫技术的临床应用。
人民卫生出版社
目录
①该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单 独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫 消失在溶液中而不能发光
②要有有利的反应过程, 使化学反应的能量至少能被 一种物质所接受并生成激发态
③激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放 出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进 入激发态并释放出光子
人民卫生出版社
2.常用的免疫学反应模式
双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法
人民卫生出版社
三、技术要点
抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离
(磁颗粒分离技术)
化学发光反应
人民卫生出版社
第三节 化学发光酶免疫分析
一、 检测原理
• 化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一 化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱 性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本 中相应的抗体(抗原)发生免疫反应后，经洗涤将 结合物与游离的酶标物分离后，加入底物(发光剂 )，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接 收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放 大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算 出测定物的浓度。
人民卫生出版社
化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 人民卫生出版社
二、方法类型
1.分离方法 常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，
与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或 抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过在磁场 中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物 进行分离的技术。
人民卫生出版社
标记免疫技术
放
酶
射
免
免
疫
疫
技
技
术
术
化
荧
金
学
光
免
发
免
疫
光
疫
技
免
技
术
疫
术
技
术
人民卫生出版社
第一节 基本知识
一、发光
发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级 的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态， 释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激 发能不同可将发光分为光照发光、生物发光和化学发 光。
人民卫生出版社
• 常用的化学发光剂或发光底物有 1.直接化学发光剂 2.酶促反应的发光底物 3.电化学发光剂
人民卫生出版社
1.直接化学发光剂
• 在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接 参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的 特有基团，可直接标记抗原或抗体。如常用的吖 啶酯（acridinium，AE） 。
人民卫生出版社
（1）鲁米诺或其衍生物
• 鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化 学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的光。
人民Fra Baidu bibliotek生出版社
• 鲁米诺增强发光反应原理
人民卫生出版社
（2）AMPPD
• 〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基 )苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
人民卫生出版社
1.光照发光（photoluminescence）
• 发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进 入激发态，当回复至基态时发出较长波长的 可见光。
人民卫生出版社
2.生物发光（bioluminescence）
• 发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反 应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利 用ATP产能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复 基态时多余的能量以光子的形式释放出来。
人民卫生出版社
二.化学发光剂
• 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光 子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发 光底物。
人民卫生出版社
• 作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下 几个条件： 发光的量子产率高 物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性
人民卫生出版社
吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长 为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发 态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
人民卫生出版社
2.酶促反应的发光底物
• 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发 光。 目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧 化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。HRP的常用 的发光底物为鲁米诺或其衍生物，ALP的发光底物 为金刚烷（AMPPD）
1 发光基本知识 2 化学发光免疫分析 3 化学发光酶免疫分析 4 电化学发光免疫分析 5 化学发光免疫技术的临床应用
人民卫生出版社
前言
• 化学发光免疫技术是将具有高灵敏度的化学发光 测定技术与高特异性的抗原抗体反应技术相结合， 用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、维生 素和药物等的检测分析技术。该技术具有特异性 高、灵敏度高、分离简便、 快速、试剂无毒、安 全稳定、可自动化分析等特点，在免疫学检验中 应用广泛。
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3．电化学发光剂
• 电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反 应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电 极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。
人民卫生出版社
第二节 化学发光免疫分析
一、 检测原理
• 用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原)， 与待测标本中相应的抗原(抗体)和磁颗粒性的抗 体（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状 态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，这 时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境， 吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由 集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产 生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原 (抗体)的含量
3.化学发光
• 某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过 程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间 态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态 回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量， 这一现象称为化学发光。
人民卫生出版社
• 一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以 下条件：
化学发光免疫技术(1)
第二十一章 化学发光免疫技术
人民卫生出版社
本章要点
1.化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。 2.化学发光免疫分析的基本原理及其技术类 型。 3.化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技 术。 4.电化学发光免疫分析基本原理。 5.化学发光免疫技术的临床应用。
人民卫生出版社
目录
①该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单 独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫 消失在溶液中而不能发光
②要有有利的反应过程, 使化学反应的能量至少能被 一种物质所接受并生成激发态
③激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放 出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进 入激发态并释放出光子
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2.常用的免疫学反应模式
双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法
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三、技术要点
抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离
(磁颗粒分离技术)
化学发光反应
人民卫生出版社
第三节 化学发光酶免疫分析
一、 检测原理
• 化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一 化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱 性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本 中相应的抗体(抗原)发生免疫反应后，经洗涤将 结合物与游离的酶标物分离后，加入底物(发光剂 )，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接 收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放 大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算 出测定物的浓度。
人民卫生出版社
化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 人民卫生出版社
二、方法类型
1.分离方法 常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，
与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或 抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过在磁场 中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物 进行分离的技术。
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标记免疫技术
放
酶
射
免
免
疫
疫
技
技
术
术
化
荧
金
学
光
免
发
免
疫
光
疫
技
免
技
术
疫
术
技
术
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第一节 基本知识
一、发光
发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级 的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态， 释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激 发能不同可将发光分为光照发光、生物发光和化学发 光。
人民卫生出版社
• 常用的化学发光剂或发光底物有 1.直接化学发光剂 2.酶促反应的发光底物 3.电化学发光剂
人民卫生出版社
1.直接化学发光剂
• 在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接 参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的 特有基团，可直接标记抗原或抗体。如常用的吖 啶酯（acridinium，AE） 。
人民卫生出版社
（1）鲁米诺或其衍生物
• 鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化 学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的光。
人民Fra Baidu bibliotek生出版社
• 鲁米诺增强发光反应原理
人民卫生出版社
（2）AMPPD
• 〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基 )苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
人民卫生出版社
1.光照发光（photoluminescence）
• 发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进 入激发态，当回复至基态时发出较长波长的 可见光。
人民卫生出版社
2.生物发光（bioluminescence）
• 发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反 应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利 用ATP产能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复 基态时多余的能量以光子的形式释放出来。
人民卫生出版社
二.化学发光剂
• 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光 子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发 光底物。
人民卫生出版社
• 作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下 几个条件： 发光的量子产率高 物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性
人民卫生出版社
吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长 为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发 态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
人民卫生出版社
2.酶促反应的发光底物
• 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发 光。 目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧 化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。HRP的常用 的发光底物为鲁米诺或其衍生物，ALP的发光底物 为金刚烷（AMPPD）
1 发光基本知识 2 化学发光免疫分析 3 化学发光酶免疫分析 4 电化学发光免疫分析 5 化学发光免疫技术的临床应用
人民卫生出版社
前言
• 化学发光免疫技术是将具有高灵敏度的化学发光 测定技术与高特异性的抗原抗体反应技术相结合， 用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、维生 素和药物等的检测分析技术。该技术具有特异性 高、灵敏度高、分离简便、 快速、试剂无毒、安 全稳定、可自动化分析等特点，在免疫学检验中 应用广泛。
人民卫生出版社
3．电化学发光剂
• 电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反 应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电 极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。
人民卫生出版社
第二节 化学发光免疫分析
一、 检测原理
• 用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原)， 与待测标本中相应的抗原(抗体)和磁颗粒性的抗 体（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状 态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，这 时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境， 吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由 集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产 生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原 (抗体)的含量