细胞运动及迁移检测方法的比较与选择

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Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法.

Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法我们所使用的是Chemicon公司的ECM554，基质胶已经包被好了，买来就可以用，很方便,而且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大。

这种胶4度下很软,37度则变得比较坚硬，因此用前应先放在培养箱中10分钟作用，使胶完全凝固。

该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色，再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。

我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目.结晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶标仪570nm检测，同样可以反应穿过细胞数因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数，因此建议有条件的话还是买这类已经铺好胶的试剂盒,比较可靠。

说明书该公司网上可以下载，对原理也有比较详细的阐述，可以去查一下.我们做的时候，上室用0.5％BSA的培养液，下室用5%血清的培养液,下室血清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整,如果细胞侵袭能力强,可适当降低血清浓度,否则可适当提高血清浓度。

需要注意的是：1。

上室内的细胞数目要适当，过多,穿过膜的细胞会过多过快，如果用计数法的话将难以计数；最少也要保证在收样的时候，上室内还要有细胞存在。

具体细胞密度需要自己摸索。

2。

细胞计数的准确性对结果影响很大，各组间最好不要分开计数.尽量用同一密度的细胞悬液给予不同处理,保证各组细胞量一致3.对细胞的处理不可影响细胞生存。

否则难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能力改变侵袭小室其实不止是transwell的,其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。

我用过Thincert,个人感觉不错,而且价格便宜,是grelner的,孔径8微米用于24孔板的一个才45块人民币，而且可以零买,不想transwell,总是一箱一箱的卖,实在是太贵了!侵袭实验要结合实验目的,不一定非要包被的。

下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤(摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert™ cell culture inserts》，大家如需要,可用google搜之：1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures2。

Transwell 使用介绍

1. Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（perme able supports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

常用0.4、3.0µm。

细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍

一、细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。

在低等生物中，原始细胞通过变形与伪足活动趋近食物与远离伤害。

在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切有关。

人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息有关。

细胞的运动依靠于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，比如肌动蛋白是细胞运动伪足中最要紧的结构单位。

当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展与基部的收缩，与细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。

细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不一致的粘附因子与细胞外基质（Extracellular Matrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不一致细胞的特定组织转移与偏好。

图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复二、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。

然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的要紧方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕与Boyden Chamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性与细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记关于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包含细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。

生物科学研究中的细胞迁移研究

生物科学研究中的细胞迁移研究细胞迁移是生物科学研究中的一个重要领域。

它涉及细胞的运动、生长、生殖等多个课题，以及很多疾病的形成与发展。

细胞迁移的研究涉及到生物学、化学、物理学等多个学科，因此其研究领域很大，涉及到多个难以解决的科学问题。

1. 细胞迁移的基本概念细胞迁移是细胞运动的一种形式，是细胞膜发生形变后向外膜外发出伪足，并将其拉长，进而使细胞向指向某个方向的方向运动。

细胞迁移是一种非常复杂的过程，其中涉及到细胞骨架的变化、细胞外环境的变化、细胞内部的信号传递等多个方面。

细胞迁移是细胞生长、发育等过程中必须的步骤之一，能够使得细胞到达新的位置，完成新的任务。

2. 细胞迁移的类型细胞迁移的类型很多，其中最重要的是两种类型：穿透性迁移和非穿透性迁移。

穿透性迁移是指细胞的迁移过程中需要穿过一些障碍物，如细胞间隙（细胞与细胞之间的间隔）、基底膜（细胞与基质之间的界面）等等。

非穿透性迁移则是细胞通过渗透或滑动等方式进行迁移，而不需要穿过障碍物。

这两种迁移方式的研究为我们更好地理解细胞生长、发育等过程提供了有益的信息。

3. 细胞迁移的研究领域细胞迁移的研究领域非常广泛，其中包括细胞生长、细胞凋亡、肿瘤形成等多个领域。

研究显示，细胞迁移的机制与如何防止癌症等多种疾病的形成密切相关。

因此，对于细胞迁移的研究具有非常重要的科学价值。

4. 细胞迁移的影响因素细胞迁移的影响因素非常多，其中重要的因素包括细胞因素和环境因素。

细胞因素包括细胞骨架的结构、信号通路的调控等，环境因素则包括温度、pH值、压力等。

在研究细胞迁移的机制的过程中，我们需要同时考虑这些因素对细胞迁移的影响。

5. 海绵微流控芯片在细胞迁移研究中的应用近年来，一种新的技术——海绵微流控芯片技术被广泛应用于细胞迁移的研究。

海绵微流控芯片是利用纳米孔道进行微流控操作的一种技术，它能够实现单个细胞的高精度操纵和分析，被广泛用于生物学、生物化学等多种领域的研究。

细胞因子与细胞黏附因子的测定

细胞因子与细胞黏附因子的测定第一节生物学测定方法常见的生物学测定法包括：基于DNA检测的分子生物学测定法和生物活性测定法。

前者有细胞因子或细胞黏附分子DNA扩增法、RNA印迹法、原位杂交法、核酸酶保护分析等，可定性或定量分析细胞因子和细胞黏附分子的基因或mRNA。

后者则是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测方法，主要用于细胞因子的测定。

生物活性测定法的基本原理，是根据不同细胞因子所具有的某一方面独特的生物学活性，构建发挥这一活性的反应体系，通过观察其活性作用的结果，判断有无相应细胞因子的存在。

有助于细胞因子检测的活性作用大致有以下几类：1.刺激细胞增殖或集落形成的活性；2.维持细胞生长和存活的特性；3.抑制细胞生长或破坏细胞的效应；4.促进细胞趋化或抗病毒作用等。

一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法1.直接计数法2.细胞代谢活性测定方法3.细胞代谢产物测定法常用放射性核素掺入法和MTT比色法二、细胞毒活性测定法对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。

因此，待测细胞因子做一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性成正比。

本法常用于TNF等的测定。

三、抗病毒活性测定法抗病毒活性测定法主要用于IFN等细胞因子的检测。

四、趋化活性测定法其诱导细胞迁移的方式包括趋化性和化学增活性。

趋化性可采用琼脂糖和Boyden盲端微孔小室趋化试验测定。

化学增活性可采用琼脂糖小滴化学动力学试验测定。

五、生物学活性测定方法学评价细胞因子生物学活性测定法主要具有以下特点：1.敏感性较高2.特异性不高3.操作繁琐4.易受干扰第二节免疫测定方法一、ELISA方法双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。

细胞因子测定的标本主要包括两大类，一是血清（血浆）、关节液、胸腔液、脑脊液或腹腔液等体液，可用于细胞因子和可溶性黏附分子的检测；二是细胞体外培养后的培养上清液，只用于细胞因子的检测。

细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8µm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 µ、200 µL、1000 µL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。

如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。

实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。

2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。

3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。

4.把枪头剪去一小段（约3 µm）后在冰上吸取40 µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。

5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。

6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。

7.按照每孔200 µL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 µL，放入37 ℃孵箱培养。

8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。

9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。

10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。

11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。

METTL5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制

第59卷第5期2023年10月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .59,N o .5O c t o b e r 2023[收稿日期]2023-02-03; [修订日期]2023-05-25[基金项目]国家自然科学基金资助项目(82072927)[第一作者]彭修法(1995-),男,硕士研究生㊂[通信作者]张春玲(1966-),女,主任医师,硕士生导师㊂E -m a i l :qd z c l 2011@163.c o m ㊂M E T T L 5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制彭修法1,王蕊红2,王晔2,刘凤娟1,张春玲1(青岛大学附属青岛市中心医院,山东青岛 266042 1 呼吸与危重症医学科; 2 检验科)[摘要] 目的探讨甲基转移酶样蛋白5(M E T T L 5)基因对肺腺癌细胞迁移和侵袭功能的影响及潜在机制㊂方法使用基因表达数据集(G E O )数据库分析肺腺癌及癌旁组织中M E T T L 5的表达差异,采用W e s t e r nb l o t 方法检测正常肺上皮B E A S -2B 与肺腺癌A 549㊁H 1975细胞系中M E T T L 5蛋白的表达水平㊂应用L V 3-M E T T L 5-s h R N A 慢病毒感染肺腺癌A 549和H 1975细胞系以敲低其M E T T L 5基因表达,W e s t e r nb l o t 法验证沉默效果㊂成功敲低M E T T L 5基因后,通过T r a n s w e l l T M 实验检测两种细胞系迁移㊁侵袭能力,用W e s t e r nb l o t 法检测上皮间质转化(E M T )标记物E -C a d h e r i n ㊁V i m e n t i n 蛋白表达㊂结果 G E O 数据库分析结果显示,肺腺癌组织M E T T L 5的表达显著高于癌旁正常组织,且高表达的病人预后更差㊂M E T T L 5在肺腺癌A 549和H 1975细胞中表达显著高于正常肺上皮B E A S -2B 细胞系㊂敲低M E T T L 5后A 549和H 1975细胞的迁移㊁侵袭能力显著降低,且间质标记物V i m e n t i n 表达显著下调,上皮标记物E -C a d h e r i n 表达显著上调㊂结论 M E T T L 5可能通过促进E M T 过程促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭㊂[关键词] 肺腺癌;蛋白甲基转移酶类;上皮-间质转化;细胞运动[中图分类号] R 734.2;R 329.28 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2023)05-0645-06d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2023.59.163[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /37.1517.R.20231128.1537.003;2023-11-30 09:44:17R O L EO F M E T T L 5I N M I G R A T I O N A N DI N V A S I O N O F L U N G A D E N O C A R C I N O M A C E L L SA N D M E C H A N I S M S P E N G X i u f a ,WA N GR u i h o n g ,WA N GY e ,L I UF e n g j u a n ,Z HA N GC h u n l i n g (D e p a r t m e n t o fR e s p i r a t o r y a n dC r i t i c a l C a r eM e d i -c i n e ,T h eA f f i l i a t e dC e n t r a lH o s p i t a l o fQ i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266042,C h i n a )[A B S T R A C T ] O b je c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e of t h em e t h y l t r a n s f e r a s e -l i k e p r o t e i n5(M E T T L 5)g e n e i n th emi g r a t i o n a n d i n v a s i o no f l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l s a n d t h e p o t e n t i a lm e c h a n i s m s . M e t h o d s M E T T L 5e x p r e s s i o n l e v e l s i n l u n g a d e n o c a r -c i n o m a a n d p a r a c a n c e r o u s t i s s u e sw e r e c o m p a r e d t h r o u g ht h eG e n eE x p r e s s i o n O m n i b u s (G E O )d a t a b a s e .M E T T L 5p r o t e i ne x -p r e s s i o n l e v e l s i n n o r m a l l u n g e p i t h e l i a l c e l l s (B E A S -2B )a n d l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l l i n e s (A 549a n dH 1975)w e r e d e t e r m i n e d b y W e s t e r nb l o t .A 549a n dH 1975c e l l l i n e sw e r e i n f e c t e dw i t h t h eL V 3-M E T T L 5-s h R N Al e n t i v i r u s t ok n o c k d o w n t h e e x pr e s s i o no f t h e M E T T L 5g e n e ,w h i c hw a s v e r i f i e db y W e s t e r nb l o t f o r t h e s i l e n c i n g e f f e c t s .A f t e r s u c c e s s f u l l y k n o c k i n g do w n t h e M E T T L 5g e n e ,t r a n s w e l l a s s a y w a s u s e d t od e t e r m i n e t h em i g r a t i o na n d i n v a s i o na b i l i t i e s o f t h e t w o c e l l l i n e s .T h e e x p r e s s i o no f e p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o nm a r k e r s (E -C a d h e r i n a n dV i m e n t i n p r o t e i n s )w a sm e a s u r e d b y W e s t e r nb l o t . 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I-1640)购自G i b c o公司;胎牛血清(F B S)购自E x c e l l公司;磷酸盐缓冲液(P B S)购自索莱宝公司;青链霉素混合液㊁2.5g/L胰蛋白酶溶液购自H y c l o n e公司;一步冻存液购自海星公司; 2ˑ蛋白上样缓冲液(2ˑl o a d i n g b u f f e r)㊁电泳转移缓冲液(即转膜液)㊁聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)缓冲液㊁T B S T缓冲液购自S o l a r b i o公司; 40g/L多聚甲醛固定液㊁结晶紫染液购自碧云天公司;M a t r i g e l基质胶购自美国C o r n i n g公司;A n t i-h u m a n M E T T L5多克隆抗体㊁H R P标记的羊抗兔I g G购自武汉爱博泰克公司;兔抗人E-C a d h e r i n㊁V i m e n t i n㊁G A P D H抗体购自美国C e l lS i g n a l i n g T e c h n o l o g y公司;M E T T L5的干扰慢病毒购自上海吉玛公司㊂1.2实验方法1.2.1生物信息学分析首先在基因表达数据集(G E O)数据库中搜索肺腺癌数据,下载数据集,分析M E T T L5的表达情况㊂利用G E P I A软件根据M E T T L5的表达差异对肺腺癌病人进行生存分析,绘制K a p l a n-M e i e r生存曲线㊂1.2.2细胞培养㊁转染及稳转株筛选 A549及H1975细胞系使用R P M I-1640完全培养液(内含体积分数0.10F B S和体积分数0.01的青链霉素双抗)培养,培养箱条件为37ħ㊁内含体积分数0.05的C O2㊂当细胞汇合度达到90%左右并处于对数生长期时,消化并重悬两种细胞后接种于6孔板中,分别使用C o n t r o l及L V3-M E T T L5-s h R N A干扰慢病毒按照说明书进行转染,分为C o n t r o l组及s h M E T T L5组,72h后通过荧光显微镜观察荧光㊂重新铺板,加入嘌呤霉素使终质量浓度为5m g/L,筛选M E T T L5敲低的稳转株㊂1.2.3W e s t e r nb l o t法检测取经嘌呤霉素筛选后㊁镜下可见荧光的两组细胞,使用蛋白裂解液2ˑl o a d i n g b u f f e r裂解细胞提取蛋白样品,并在95ħ条件下金属浴10m i n使蛋白变性㊂吸取8μL的样品加入上样孔中,140V电泳60m i n,200m A转膜90m i n,用50g/L脱脂牛奶进行封闭㊂1h后以T B S T清洗P V D F膜3次,分别与一抗A n t i-h u m a n M E T T L5多克隆抗体(1ʒ1000)和A n t i-h u m a n G A P D H单克隆抗体(1ʒ2000)室温孵育2h㊂用T B S T清洗3次后将P V D F膜放于H R P标记的A n t i-r a b b i t I g G二抗(1ʒ2000)中孵育1h㊂以T B S T清洗后使用超敏发光液进行显影㊂1.2.4 T r a n s w e l l T M实验检测在检测迁移能力时,将处于对数生长期的C o n t r o l组㊁s h M E T T L5组A549和H1975细胞消化并离心重悬,计数并将细胞密度调至1ˑ108/L,向上室中每孔加入200μL 细胞悬液,并在下室中加入800μL的R P M I-1640 (含体积分数0.20F B S),置于培养箱中培养24h㊂弃上层液体,以P B S清洗2次,用棉签拭去上室内的细胞,将小室置于多聚甲醛固定液中固定20m i n,弃去固定液㊂清洗后将小室置于1g/L结晶紫染液中染色15m i n,再次清洗并晾干,放于显微镜下拍照计数㊂检测侵袭能力时,先将M a t r i g e l基质胶与R P M I-1640培养液以1ʒ20均匀混合后,向上室内每孔加入100μL混合液,置于培养箱中过夜㊂其他条件同迁移能力检测㊂1.3统计学方法采用G r a p hP a dP r i s m8.0.2软件进行统计学分析㊂W e s t e r nb l o t检测所得的平均灰度值比值及T r a n s w e l l T M实验所得的细胞数均以xʃs表示,两组均数比较采用t检验;多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用T u k e y检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1生物信息学分析对提取的G E O数据库数据进行分析,结果显示,肺腺癌组织中M E T T L5的表达显著高于癌旁正常肺组织,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A)㊂使用G E P I A绘制K a p l a n-M e i e r曲线,分析结果显示,M E T T L5表达水平高的病人具有更短的生存期(P<0.05)(图1B)㊂2.2 M E T T L5在肺腺癌细胞系中的表达W e s t e r nb l o t检测结果表明,B E A S-2B㊁A5495期彭修法,等.M E T T L 5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制647及H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平差异具有统计学意义(F =16.53,P <0.05)㊂与B E A S -2B 细胞相比,A 549及H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P <0.05);而A 549细胞和H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平差异无统计学意义(P <0.05)(图2)㊂A :M E T T L 5在肺腺癌组织和癌旁正常组织中的表达;B :M E T T L 5表达与肺腺癌病人生存之间的关系㊂图1 M E T T L 5在肺腺癌组织中表达及其与病人预后关系的生物信息学分析A :3种细胞系中M E T T L 5蛋白表达的W e s t e r nb l o t 检测;B :3种细胞系M E T T L 5蛋白相对表达量比较㊂图2 M E T T L 5在肺腺癌细胞系中的表达2.3 敲低M E T T L 5表达对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响为研究M E T T L 5在肺腺癌细胞中的作用,使用慢病毒敲低A 549及H 1975细胞中M E T T L 5基因(图3A )㊂W e s t e r nb l o t 检测显示,M E T T L 5敲低后s h M E T T L 5组两种细胞M E T T L 5蛋白表达水平较C o n t r o l 组显著下调(t =8.403㊁4.222,P <0.05)(图3B ㊁C )㊂细胞迁移和侵袭实验结果显示,M E T T L 5敲低后s h M E T T L 5组两种细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均较C o n t r o l 组明显减少(t =7.803~14.430,P <0.05),表明M E T T L 5显著促进A 549㊁H 1975细胞的迁移㊁侵袭(图3D~G )㊂2.4 敲低M E T T L 5对肺腺癌细胞V i m e n t i n 和E -C a d h e r i n 表达的影响本文W e s t e r nb l o t 检测结果显示,C o n t r o l 组和s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞V i m e n t i n 蛋白表达差异具有显著性(F =155.40,P <0.05);与C o n t r o l组相比,s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞V i m e n t i n 蛋白表达水平显著降低(P <0.05)㊂C o n t r o l 组和s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞E -C a d h e r i n 蛋白表达差异具有显著性(F =73.75,P <0.05);与C o n -t r o l 组相比较,s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞的E -C a d h e r i n 蛋白表达显著升高(P <0.05)㊂见图4㊂3 讨论近年来随着肺癌筛查手段㊁靶向及免疫治疗的不断进步,肺癌病人的生存不断改善,但肺癌病人死亡数仍高居恶性肿瘤死亡数之首,且转移和复发的肺癌病人预后更差[8-9]㊂到目前为止,手术仍然是根治早期肺癌的唯一方法[10]㊂随着分子生物学及靶向治疗的发展,针对k i r s t e n 大鼠肉瘤病毒原癌基因(K r a s )㊁表皮生长因子受体(E G F R )㊁间变性淋巴瘤激酶(A L K )㊁c -r o s 肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(R O S 1)等靶点突变及程序性死亡受体1(P D -1)/程648青岛大学学报(医学版)59卷A:慢病毒转染后荧光效果图;B:A549和H1975细胞的M E T T L5蛋白表达;C:慢病毒转染后各组细胞M E T T L5蛋白相对表达量;D: T r a n s w e l l T M迁移实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549㊁H1975)的迁移能力(结晶紫染色);E:A549和H1975细胞迁移能力的半定量分析;F: T r a n s w e l l T M侵袭实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549和H1975)的侵袭能力(结晶紫染色);G:A549和H1975细胞侵袭能力的半定量分析㊂图3敲低M E T T L5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响A:各组两种细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n蛋白表达的W e s t e r nb l o t检测;B:各组两种细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n蛋白相对表达量比较㊂图4敲低M E T T L5对各组肺腺癌细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n表达的影响5期彭修法,等.M E T T L5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制649序性死亡受体-配体1(P D-L1)通路的新型靶向药物层出不穷,肺癌的治疗取得了长足进步[11-14]㊂但肺腺癌的靶向治疗仍处于发展阶段,因此寻找肺腺癌治疗的新靶点具有重要意义㊂m6A R N A甲基化作为一种表观遗传修饰方式,是真核生物中最丰富的R N A修饰[15]㊂该修饰早在20世纪70年代就被发现,但其确切功能和调控机制在很大程度上仍然不清楚[6]㊂研究发现, m6A修饰在各种R N A中均丰富而保守,表明它能够广泛调控基因表达[16-17]㊂随着研究的深入,m6A 修饰在肺腺癌进展中的作用及机制也逐渐被揭示㊂Y I N等[18]发现,线粒体R N A核糖核酸内切R N A 组分(R M R P)在N S C L C中高表达,M E T T L3通过提高R M R P R N A的m6A水平增强其稳定性,通过调节转化生长因子β受体1(T G F B R1)/S MA D 蛋白2(S MA D2)/S MA D蛋白3(S MA D3)途径促进N S C L C进展㊂因此,识别m6A相关基因㊁阐明它们在肺腺癌发生发展中的作用及调控机制对于肺腺癌治疗至关重要㊂M E T T L5是m6A甲基转移酶家族中新发现的一个成员,与其他家族成员参与m R N A甲基化修饰不同,M E T T L5可以与t R N A甲基转移酶112 (T R MT112)结合形成异二聚体以获得代谢稳定性,负责18S r R N A1832位腺苷甲基化[19]㊂R O N G 等[20]应用公开数据库及乳癌样本分析M E T T L5表达与乳癌病人生存之间的关系,结果显示乳癌病人M E T T L5高表达与较差的生存之间存在显著相关性㊂M E T T L5基因敲除的乳癌细胞中多聚核糖体形成减少,细胞整体翻译能力减弱,细胞周期发生停滞,细胞凋亡增加,表明M E T T L5可促进乳癌细胞生长㊂HU A N G等[21]研究发现,M E T T L5可通过调节c-M y c水平提高胰腺癌细胞迁移㊁侵袭能力从而促进胰腺癌恶性进展㊂P E N G等[22]的研究表明, M E T T L5通过靶向酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(A C S L4)促进肝细胞肝癌(H C C)细胞从头脂肪生成并导致游离脂肪酸水平增加,使H C C细胞发生代谢重编程而促进H C C进展㊂然而,M E T T L5在肺腺癌中发挥的作用仍不清楚㊂我们在前期生物信息学分析中,通过对T C G A数据库中肺腺癌的差异表达m R N A进行分析,筛选出与肿瘤分期相关枢纽基因M E T T L5,首次发现M E T T L5在肺腺癌组织中高表达并与肺腺癌病人的不良预后显著相关㊂本研究结果显示,M E T T L5在肺腺癌细胞系中的表达水平明显高于正常肺上皮B E A S-2B细胞系,提示M E T T L5在肺腺癌中发挥促癌作用㊂为进一步探究M E T T L5在肺腺癌中的作用,本研究使用s h M E T T L5慢病毒转染肺腺癌A549和H1975细胞系,检测肺腺癌细胞的行为㊂体外细胞实验结果显示,转染s h M E T T L5的肺腺癌细胞迁移㊁侵袭能力显著降低,表明敲低M E T T L5基因能明显抑制肺腺癌的进展㊂E MT过程与癌症进展密切相关,E MT发生时上皮细胞形态改变,细胞间连接消失,细胞失去极性转变为具有转移和侵袭能力的间质细胞,促进肿瘤的转移与复发并使肿瘤细胞表现出明显的治疗抗性[23-24]㊂E MT过程中细胞发生了特征性的分子变化,具体表现为上皮标记物E-C a d h e r i n表达降低,间质标记物V i m e n t i n表达上调[25-26]㊂本文研究结果显示,敲低M E T T L5基因表达能够显著抑制肺腺癌细胞的E MT,表明M E T T L5通过促进肺腺癌细胞E MT进程促进肺腺癌进展㊂在后续研究中我们将探讨M E T T L5促进肺腺癌细胞E MT进程的具体分子机制㊂综上所述,M E T T L5在肺腺癌中高表达,其表达水平与病人预后呈明显负相关;敲低M E T T L5基因表达可显著抑制肺腺癌细胞迁移㊁侵袭,其机制可能是M E T T L5促进肺腺癌细胞E MT进程㊂本研究结果表明,M E T T L5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用㊂因此,M E T T L5有望成为肺腺癌治疗的潜在靶点及评估肺腺癌发生发展的重要标志物㊂[参考文献][1]S U N G H,F E R L A YJ,S I E G E LRL,e t a l.G l o b a l c a n c e r s t a-t i s t i c s2020:G L O B O C A Ne s t i m a t e s o f i n c i d e n c e a n dm o r t a l i t yw o r l d w i d e f o r36c a n c e r s i n185c o u n t r i e s[J].C A:aC a n c e r J o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,2021,71(3):209-249.[2]S I E G E L R L,M I L L E R K D,J E MA L A.C a n c e rs t a t i s t i c s,2016[J].C A:AC a n c e r J o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,2016,66(1):7-30.[3]S U C C O N YL,R A S S LD M,B A R K E R AP,e t a l.A d e n o c a r-c i n o m a s p e c t r u ml e s i o n s o f t h e l u n g:de t e c t i o n,p a t h o l o g y a n dt r e a t m e n ts t r a t e g i e s[J].C a n c e r T r e a t m e n tR e v i e w s,2021, 99:102237.[4]Y IM,Z H E N GXL,N I U M K,e t a l.C o m b i n a t i o n s t r a t e g i e sw i t hP D-1/P D-L1b l o c k a d e:c u r r e n t a d v a n c e s a n d f u t u r e d i r e c-t i o n s[J].M o l e c u l a rC a n c e 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transwell实验(整理版)

第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

Fig1但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面Fig2将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

Fig3应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附和运动能力的影响

ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附和运动能力的影响熊薇;唐怡;王娅兰;徐剑侠【摘要】目的探讨单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1[mono(ADP-ribosyl) transferase-1,ART1]基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附、运动和侵袭能力的影响及其机制.方法以携带ART1-shRNA的慢病毒感染小鼠结肠癌CT26细胞.将细胞分为实验组(感染ART1-shRNA慢病毒的CT26细胞),NC-shRNA对照组[感染阴性对照慢病毒(negative-control-shRNA,NC-shRNA) CT26细胞]及未处理组(未经处理的CT26细胞);RT-PCR检测CT26细胞ART1 mRNA表达变化,Western blot检测ART1、RhoA、integrinβ1蛋白表达的变化;用细胞基质黏附、运动和侵袭实验观察ART1-shRNA对CT26细胞基质黏附、运动和侵袭能力的影响.结果获得稳定沉默ART1基因的CT26细胞株;RT-PCR和Western blot 结果均显示,实验组ART1 mRNA和ART1蛋白表达显著低于对照组(P＜0.01);Western b1ot结果显示实验组RhoA、integrinβ1表达均显著低于对照组(P＜0.01);实验组细胞黏附、运动、侵袭抑制率分别为70.72％,52.20％和60.00％.结论单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1 (ART1)基因沉默可降低CT26细胞的黏附、运动、侵袭能力,该作用可能与ART1沉默后下调RhoA和integrin β1活性有关.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2013(040)003【总页数】7页(P328-334)【关键词】单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1 (ART1);慢病毒;结肠癌;黏附;迁移【作者】熊薇;唐怡;王娅兰;徐剑侠【作者单位】重庆医科大学病理教研室-分子医学与肿瘤研究中心重庆400016;重庆医科大学病理教研室-分子医学与肿瘤研究中心重庆400016;重庆医科大学病理教研室-分子医学与肿瘤研究中心重庆400016;重庆医科大学病理教研室-分子医学与肿瘤研究中心重庆400016【正文语种】中文【中图分类】R735.34;R363.21腺苷二磷酸核糖基化（ADP－ribosylation）反应在生理和病理生理过程中扮演着重要角色，包括影响细胞信号传递、转录调节、DNA修复、基因稳定性维持以及细胞增殖分化、黏附迁移。

甲基转移酶样蛋白14对急性早幼粒白血病细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用

甲基转移酶样蛋白14对急性早幼粒白血病细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用张孟孟，伍燕平，张平平，王蒙，李佳佳蚌埠医学院第一附属医院血液科，安徽蚌埠233003摘要：目的　探讨过表达和敲低甲基转移酶样蛋白14（METTL14）对急性早幼粒白血病细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用。

方法　取人急性早幼粒白血病细胞NB4进行培养，分为过表达对照组、过表达组、干扰对照组、干扰组，过表达对照组及过表达组分别转染空白质粒和METTL14质粒，干扰对照组和干扰组分别转染si -NC 和si -METTL14质粒。

采用CCK -8法检测各组细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Transwell 实验检测细胞侵袭和迁移能力，Dot Blotting 法检测细胞N -6甲基腺苷（m6A ）修饰水平。

结果　与过表达对照组相比，过表达组细胞增殖率升高、细胞凋亡率降低、细胞迁移数、细胞侵袭数升高，NB4细胞m6A 修饰水平提高（P 均<0.05）；与干扰对照组相比，干扰组细胞增殖率降低、细胞凋亡率增加、细胞迁移数、细胞侵袭数降低，NB4细胞m6A 修饰水平降低（P 均<0.05）。

结论　METTL14可促进NB4细胞增殖、迁移、侵袭，其机制可能与提高m6A 修饰水平有关。

关键词：急性早幼粒白血病；甲基转移酶样蛋白14；细胞增殖；细胞凋亡；细胞侵袭；细胞迁移；甲基转移酶；N6-甲基腺苷doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2024.02.006中图分类号：R733.71 文献标志码：A 文章编号：1002-266X （2024）02-0027-04Effects of METTL14 on proliferation ， apoptosis ， invasion and migration of acute promyelocytic leukemia cellsZHANG Mengmeng ， WU Yanping ， ZHANG Pingping ， WANG Meng ， LI JiajiaDepartment of Hematology ， The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College ， Bengbu 233003， ChinaAbstract ： Objective To investigate the effects of overexpression and knockdown of methyltransferase -like protein14 （METTL14） on proliferation ， apoptosis ， invasion and migration of acute promyelocytic leukemia cells. Methods Human acute promyelocytic leukemia cells NB4 were cultured ， and were divided into the overexpression control （Over -NC ） group ， overexpression group ， interference control （si -NC ） group ， and interference group ， respectively. The blank plasmid and METTL14 plasmid were transfected into NB4 cells in the control group and the overexpression group ， respec⁃tively. The si -NC and si -METTL14 were transfected into NB4 cells in the interference control group and the interference group ， respectively. Cell proliferation was detected by CCK -8， apoptosis was detected by flow cytometry ， cell invasion and migration abilities were detected by Transwell chamber ， and N -6 methyladenine （m6A ） modification level was detect⁃ed by Dot blotting assay. Results Compared with the Over -NC group ， the cell proliferation rate increased ， apoptosis rate decreased ， cell migration number and cell invasion number increased ， and m6A modification level of NB4 cells in⁃creased in the overexpression group （all P <0.05）. Compared with the si -NC group ， the proliferation rate decreased ， apop⁃tosis rate increased ， cell migration number and cell invasion number decreased ， and the m6A modification level of NB4 cells decreased in the interference group （all P <0.05）. Conclusion METTL14 can promote the proliferation ， migration and invasion of NB4 cells ， and its mechanism may be related to the increase of m6A modification level.Key words ： acute promyelocytic leukemia ； methyltransferase -like protein 14； cell proliferation ； apoptosis ； cellinvasion ； cell migration ； methyltransferase ； N -6 methyladenine急性早幼粒细胞白血病（APL ）占成人急性髓系白血病（AML ）的5%～10%，是一种罕见但高度可治基金项目：安徽省自然科学基金项目（210805QH324）。

[错过会后悔系列六]细胞迁移与侵袭实验常见问题

[错过会后悔系列六]细胞迁移与侵袭实验常见问题细胞迁移与侵袭实验FAQ⚑细胞迁移与侵袭实验有什么区别？细胞迁移是细胞在化学信号（如：趋化因子）的驱使下沿着浓度梯度从一个区域转移到另一区域的运动。

损伤修复、细胞分化、胚胎发育以及恶性肿瘤转移等诸多生理/病理过程都需要通过细胞迁移来完成。

细胞侵袭与细胞迁移比较类似，但是“侵袭”需要细胞穿过胞外基质层（ECM）或基底膜基质层（BME），在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍，从而在趋化因子浓度梯度驱使下完成从一处到另一处的移动。

细胞侵袭可以发生在正常细胞的炎症反应过程中，也常发生在恶性肿瘤细胞的转移过程中。

因此，研究其中的机制对多种生理/病理过程都有着重要的意义。

⚑迁移、侵袭实验的大致步骤是怎样的？Corning的Transwell小室产品（以及我司旗下Falcon品牌的Insert小室产品）可为迁移、侵袭实验构建绝佳的研究模型。

您可将待研究的细胞接种在Transwell/Insert小室的微孔膜上，在上下室分别加入含有不同浓度的趋化因子的培养基；细胞在迁移、侵袭实验时，受到趋化因子的吸引，会挤压自身以穿过膜上的小孔，并在膜的背侧贴附下来。

实验结束后，您可统计穿过膜的细胞的情况来评价迁移/侵袭实验。

与迁移实验不同的是，侵袭实验中需要在微孔膜上额外包被一些基质蛋白（ECM/BME），如胶原、纤粘蛋白、层粘连蛋白等，CorningMatrigel产品也被非常广泛地应用在侵袭实验中。

⚑如何选择用于迁移/侵袭实验的产品？Corning品牌Transwell小室主要的两种膜材质聚碳酸酯（Polycarbonate, PC）和聚酯（Polyesteror Polyethylene Terephthalate，PET）均可用于迁移、侵袭实验。

Falcon品牌的Insert产品膜材质均为聚酯（PET）。

两种材质的主要区别在光透性方面，即PC膜半透明，不太方便在培养的过程中观察上室细胞的形态；PET膜透明，方便在相差显微镜下观察细胞的状态。

【高考生物】细胞生物学实验教程细胞运动性检测实验详细介绍

（生物科技行业）细胞生物学实验教程细胞运动性检测实验详细介绍细胞运动性概述细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。

在低等生物中，原始细胞通过变形和伪足活动趋近食物和远离伤害。

在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切相关。

人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息相关。

细胞的运动依赖于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，例如肌动蛋白是细胞运动伪足中最主要的结构单位。

当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展和基部的收缩，以及细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。

细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不同的粘附因子与细胞外基质（ExtracellularMatrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不同细胞的特定组织转移与偏好。

图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复一、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。

然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的主要方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕和BoydenChamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性以及细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于BoydenChamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记对于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包括细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。

细胞活性检测方法之比较

个细胞的增值潜力做定量分析。常见的方法有平板克隆形成试验、软琼脂形成试验等。这种方法常见于 ’
抗肿瘤药物敏感性试验，瘤放射生物学试验等。Ｂａ肿ｅ
优点是反应产物为水溶性，需要使用裂解液溶解沉不
淀，不需要吸取上清，贴壁和悬浮生长的细胞均适也对
ＣｏｐｒｓｎｏｅｌｌｒａｔｖｔｅｅｔｏｅｈｄｓｍａｉｏｆｃｌａｃｉｉｙｄｔｃｉｎｍｔｏｕＬｅ，ＡＧＹ —ａＷＡＧＳｕｎＷＡＮｎｊ。ＩＨｏ，ＬＵＸａ — ｉＩｉＹＮｕｈｎ，ＬＮｈａｇ，ＧＭｉ－ｎ，ＬａＩｉｆｉｏｅ
究的常用手段，更是体外筛选抗肿瘤药物和临床肿瘤
药敏试验的重要方法之一。目前常用的方法有很多，如有台盼蓝染色法、克隆（落）成法、放射性同集形Ｈ位素掺入法、Ｔ法等。如何选择合适的细胞活性检ＭＦ
测方法，就要求实验者对各种方法有比较全面的认这
ｃｕｄｒｃｔｉｎｇ，ｔｅｃｏｇｎｉｌｅｄｉｅｔｓａｎｉｈｌｎｏｅｃ，ｃｌｒｍｅｒｎＯｏｏｏｉｔｙａｄＳｎ．Ｓｍｅｃｏｏｍｍｏｅｈｄｓｏｅｌａｔｖｔｅｅｔｎ，ｔｍｓｌｅｉｉｌｓｎｍｔｏｆｃｌｃｉｉｙｄｔｃｉｏｈｅｅｖｓｐｒｎｃｐｅａｄｃａａｔｒｓｉｓｗｅｅｏｌｎｄ．ｎｈｒｃｅｉｔｃｒｕｔｉｅＴｈｅａｖｎａｅｎｉａａａｅｆｔｍｒｌｏｃｍｐｒｄ．ｄａｔｇｓａｄｄｓｄｖｎｔｇｓｏｈｅｗｅｅａｓｏａｅＫｅｗｏｒｙｄｓ：ｃｌｃｉｉｙ；ｄｔｃｉｎｅｌａｔｖｔｅｅｔｏ

il-8生物活性的检测

IL-8生物活性的测定
基本原理：基本原理
IL-8是典型的是典型的CXC家族趋化因子，对嗜中性粒细胞和淋巴细胞有趋化家族趋化因子，是典型的家族趋化因子对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞有趋化作用。的趋化作用没有种属特异性，作用。IL-8的趋化作用没有种属特异性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒细的趋化作用没有种属特异性因此，胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测。胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测
100µl
100µl
100µl
100µl（弃去100µl）
（载体对照稀释同上）
三．准备底层小室，加样：准备底层小室，加样：
1）将趋化小室底层板放水平台上，NP标记位于右下方。）将趋化小室底层板放水平台上，标记位于右下方标记位于右下方。 2）将稀释好后预温的样品加入孔中，使液面微微隆起，）将稀释好后预温的样品加入孔中，使液面微微隆起，每孔27µl，国产板每孔25µl），每个样品个复孔。），每个样品个复孔。每孔，（国产板每孔），每个样品3个复孔为防止样品过度蒸发，整个加样过程应不超过5分钟分钟。为防止样品过度蒸发，整个加样过程应不超过分钟。 3）将适当孔径的滤膜取出，在滤膜的一角剪去1mm的小）将适当孔径的滤膜取出，在滤膜的一角剪去的小标记，角，缺角对着NP标记，分别用镊子夹住滤膜两端，水平标记分别用镊子夹住滤膜两端，下降，中间部位最先接触小室液面，下降，中间部位最先接触小室液面，将膜平放在加完样的底层板上。底层板上。 4）铺上硅胶垫，装上上层板，硅胶垫的缺角及上层板的）铺上硅胶垫，装上上层板， NP标记位于右下方。装上螺丝，拧紧装置。标记位于右下方。标记位于右下方装上螺丝，拧紧装置。
实验程序：

细胞迁移能力相关实验检测方法介绍(Molecular Devices)

细胞迁移能力相关实验检测方法介绍info.China@1细胞的迁移运动不仅是细胞进行很多重要生理活动的基础，同时也是炎症反应和肿瘤发生等病理过程中的重要步骤和关键环节。

细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。

细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。

细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。

胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。

目前人们对恶性肿瘤的研究是多方面的，从癌症的产生到转移，血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。

恶性肿瘤与良性肿瘤的最大区别就在于是否可以对周遭组织进行浸润，结果是形成边界不分明的癌组织，或是进入血管转移到远端（见远端转移）。

根据观察可将癌症浸润分为四步。

首先癌细胞表面的粘附分子会减少，与周围的细胞彼此分离，被“解除束缚”。

同时癌细胞与基底膜的粘附却会增加，这是癌细胞通过增加自身基底面层粘连蛋白（laminin）受体实现的。

然后癌细胞会释放蛋白酶，用以降解细胞外基质成分，如Ⅳ型胶原酶，使基底膜受损，产生缝隙。

最后是癌细胞阿米巴运动样的迁移，钻过基底膜的缝隙，到达底下的间质组织。

癌细胞此后会继续用蛋白酶为自己在间质组织开路，直到血管，然后它会以同样方式进入血管，经血到转移后，又以同样方式出管。

因此，癌症的形成与肿瘤细胞的迁移能力密不可分，这也成为了一个诊断和治疗癌症的一个靶点。

研究细胞迁移的方法有很多，比如划痕法、实时细胞追踪、Transwell和细胞芯片等，本文将一一介绍现今比较主流的与细胞迁移相关的实验方法。

简介：细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养的单层细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各族细胞的迁移与修复能力。

miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢上皮性癌细胞生长和运动的影响

网络出版时间：2220-1-9 1：24网络出版地址：htt p s：//UU4p/dcms/ddUl/34.195.R.2020100126.013.UtmlmiR^S^p靶向HDAC2对卵巢上皮性癌细胞生长和运动的影响杨娟2程国梅9董亚娜2张艳慧、，龙文义、摘要目的研究miRV55Dp通过靶向HDAC2对卵巢上皮性癌细胞生长和运动的影响。

方法荧光素酶报告实验验证miRV55Vp与HDAC2靶向关系；构建HDAC2pcDNA 载体过表达HDAC2,细胞转染mimic,将细胞随机分为4组：Co/Uot组、mimic组、HDAC2组、mimic+HDAC9组进行后续实验。

BRDU染色检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡；RT-PCR检测Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平；Traosweb 检测细胞侵袭;划痕试验检测细胞迁移;Western blot检测血管内皮生长因子(VEGF)、波形蛋白(Vi/extiu)、纤维粘连蛋白(FiP/nectiu、蛋白表达水平。

结果miRV55Dp和HDAC9存在直接靶向作用关系。

与HDAC9组相比较,mimic+HDAC9组BRDU阳性细胞数降低(P<0.05)，细胞凋亡率升高(P<0.45),Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平降低(P< 0.05)，侵袭细胞数降低(P<0.05),划痕愈合率降低(P< 0.05),VEGF、Vimentin、Fib/nec/u蛋白水平降低(P< 0.05)o结论miRV55Vp通过靶向HDAC2诱导卵巢癌细胞H0D910凋亡,抑制细胞增殖、侵袭和迁移，降低运动能力。

关键词卵巢上皮癌;miRV55Dy；HDAC9；侵袭和迁移中图分类号R737.31文献标志码A文章编号1000-1492(2020)12-182-06 doi：10.1405/j.c/ki.issnl000-190.0020.1.41卵巢上皮癌(editheliai ovakau carcinoma,EOC)是最常见的卵巢癌组织学类型，是一种异质性疾病［］。

检测细胞迁移的实验方法之细胞划痕实验、Transwell试验

检测细胞迁移的实验⽅法之细胞划痕实验、Transwell试验检测细胞迁移侵袭能⼒是细胞表型实验中常⽤到的检测⼿段，细胞的迁移是活细胞普遍存在的⼀种运动形式，涉及到胚胎发育、⾎管⽣成、伤⼝愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程。

具备迁移能⼒的正常细胞，受到损伤病变后，迁移能⼒会减弱，⽽肿瘤细胞的迁移能⼒则普遍会⽐较强。

⽣物公司提供的细胞迁移实验服务可以观察细胞的侵袭和粘附能⼒，以探索和寻找抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的化合物。

细胞侵袭主要指的是肿瘤细胞的⼀种恶性⾏为，肿瘤细胞的侵袭能⼒，可对应临床上肿瘤的浸润和转移。

细胞划痕实验的原理很简单，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上⼈为制造⼀个空⽩区域，称为“划痕”。

划痕边缘的细胞会逐渐进⼊空⽩区域使“划痕”愈合。

该实验是实验室分析细胞迁移能⼒的常⽤⽅法，在⼀定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，⾮常适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作⽤引起的细胞迁移。

细胞划痕试验和Transwell实验服务都是⽐较常见的细胞迁移实验服务。

EMT——从上⽪细胞到间质细胞的转变，可赋予细胞侵袭和转移的能⼒，因此，有研究认为EMT是肿瘤侵袭和早期转移的重要过程。

细胞划痕法可借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上划痕致伤，加⼊药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能⼒，是测定肿瘤细胞运动特性⽅法之⼀。

美迪西提供细胞迁移实验服务，其⽣物部在分⼦⽣物学、细胞⽣物学、体外⽣物学和结构⽣物学领域有丰富⼴泛的经验。

从最初的cDNA⽂库构建到药物设计，通过蛋⽩质纯化，结构测定和分析测定，提供⼀套完整的⽣物学服务。

通过细胞划痕实验可以研究癌症组织中的某个因⼦对肿瘤细胞迁移的影响，为探索肿瘤治疗的靶点提供了研究基础。

如在FGF4对结肠癌细胞迁移的作⽤研究⼀⽂中，有研究者应⽤重组质粒pCDNA3.1-FGF4和RNA⼲扰技术分别对低转移结肠癌细胞株T47D和⾼转移结肠癌细胞株MDA-MB-231中的FGF4进⾏过表达和⼲扰并验证,对处理前后的细胞株进⾏划痕实验[1]。

细胞生物学中的细胞迁移和侵袭检测技术

细胞生物学中的细胞迁移和侵袭检测技术细胞迁移和侵袭是细胞生物学中两个重要的生理过程，也与一些疾病的发展和转移相关。

为了更好地理解和研究这些生理过程，科学家们开发了各种细胞迁移和侵袭检测技术。

本文将介绍一些常见的细胞迁移和侵袭检测技术，以及它们在细胞生物学研究领域中的应用。

一、划痕实验法划痕实验法是一种简单有效的细胞迁移检测技术。

在该方法中，细胞被种植在培养皿中，并留下一道划痕。

随着时间的推移，观察细胞是否填补划痕。

如果细胞填补了划痕，则说明细胞进行了迁移。

这种方法的优点是操作简单，无需复杂的设备或试剂。

然而，它也存在一些局限性，例如无法提供关于细胞侵袭性的信息，只能提供关于细胞迁移的信息。

二、Transwell迁移实验法Transwell迁移实验法是一种常见的细胞迁移和侵袭检测技术。

在该方法中，细胞被种植在Transwell孔的上室，并在下室中加入诱导迁移的物质。

细胞通过Transwell孔进行迁移，最终到达下室。

通过计算孔底部细胞数量或染色，可以评估细胞的迁移程度。

Transwell迁移实验法具有较高的准确性和可重复性。

它还可以通过更换Transwell上室或添加支持层来评估细胞的侵袭能力。

然而，该方法需要特定的设备和试剂，操作过程较为繁琐。

三、倒置显微镜法倒置显微镜法是一种常用的细胞迁移和侵袭检测技术。

在该方法中，细胞被种植在培养皿的底部，并通过倒置显微镜观察细胞的迁移和侵袭过程。

倒置显微镜可以提供高清晰度的图像，并可以连续观察细胞的动态变化。

倒置显微镜法适用于观察单个细胞或细胞群的迁移和侵袭过程。

它可以提供详细的细胞形态和细胞行为信息。

然而，该方法需要倒置显微镜等专业设备，并且观察时间可能较长。

四、细胞侵入试验法细胞侵入试验法是一种常见的细胞侵袭检测技术。

在该方法中，细胞被种植在含有基底膜模拟物的Transwell孔上室。

通过加入诱导细胞侵袭的化学物质，细胞可以穿过基底膜模拟物并进入下室。