芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
筛选营养缺陷型菌株的方法
工业微生物菌种的选育——营养缺陷型菌株的筛选来源：青岛海博关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同。
关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
（一）、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。
1、营养缺陷型的诱发营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。
2、淘汰野生型在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
（1）抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。
处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。
将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程
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营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
产广谱细菌素芽孢菌筛选与鉴定
产广谱细菌素芽孢菌筛选与鉴定一、引言细菌素是一种广谱抗生素，对多种细菌具有较好的抑制活性。
而芽孢菌是一类可以产生细菌素的微生物，因此对芽孢菌的筛选与鉴定具有重要意义。
本文将着重介绍产广谱细菌素的芽孢菌的筛选与鉴定方法。
二、芽孢菌的筛选1. 采集样品：首先需要采集不同环境中的微生物样品，如土壤、水体、植物表面等。
这些样品中含有丰富的微生物资源，有利于筛选到产广谱细菌素的芽孢菌。
2. 芽孢菌的分离与纯化：将采集到的样品进行稀释后涂布在富含养分的琼脂平板上，利用稀释平板法将芽孢菌进行分离和纯化，得到单菌落。
3. 筛选菌株：利用对目标细菌素的敏感性进行筛选，选择对目标细菌素具有抑制活性的芽孢菌进行扩大培养和鉴定。
三、芽孢菌的鉴定1. 形态学鉴定：通过光学显微镜观察芽孢菌的形态特征，包括菌体形状、颜色、孢子形态等。
2. 生理生化鉴定：包括对芽孢菌的生长速率、温度适应性、酶活性等进行测试，利用不同的生理生化试验进行鉴定，如碳水化合物利用、氧化酶活性、氨基酸代谢等。
3. 分子生物学鉴定：利用PCR技术对芽孢菌的16S rRNA序列进行扩增并测序，通过与数据库比对进行物种鉴定。
4. 抗生素活性鉴定：利用菌落扩散法、微量稀释法等对芽孢菌所产抗生素的活性进行测定，了解其对于靶菌的抑制效果。
四、芽孢菌的应用1. 生物农药生产：利用产广谱细菌素的芽孢菌制备生物农药，用于农作物的病虫害防治，发挥其抗菌功效。
2. 饲料添加剂：将产广谱细菌素的芽孢菌应用于畜禽饲料中，增强饲料的抗菌活性，提高畜禽的健康水平。
3. 生物环境修复：将产广谱细菌素的芽孢菌用于土壤修复、水体治理等领域，清除有害微生物，提高环境质量。
五、总结芽孢菌是一类重要的产广谱细菌素的微生物资源，其筛选与鉴定对于新抗生素的发现和利用具有重要意义。
通过对芽孢菌的筛选与鉴定，可以为生物农药生产、饲料添加剂及环境修复等领域提供新的资源和技术支撑。
希望本文介绍的方法和应用能为相关研究工作提供一定的参考和借鉴。
产有机酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及产芽孢条件优化
Ｄ ｌ ｅ ｉａ ｆ ｔ ｂ ｅ ｃ ｏ ｍｅ ｙ ｅ ｌ ｌ ｏ ｗ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ２０ ０ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｐ ｐ．ｓ ｔ ｏ ｒ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈｅ ｌ ａ ｂ．Ｔｈｅ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｉ ｃ
序 列分析 结果 对 菌株 进行 种属 鉴 定 。利 用单 因素试验 和 正 交试 验 结合 的方 法 ， 考 察 不 同的碳 源 、 氮 源、 无机 盐 、 ｐ Ｈ值 、 培养时间、 接 种 量对 菌株 芽孢 形成 的 影响 。结 果表 明 ， 菌株 Ｒ ４ ２ － １ ６ 发酵液 中乙 酸、 乳 酸 的含量 较 高 ， 分 别为 ２ ２ １ 、 １ ７ ４ Ｂ ｘ ｇ ／ ｍ ｌ 。 经鉴 定 菌株 Ｒ ４ ２ — １ ６ 为解 淀粉 芽孢 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ａ ｍ ｙ — ｌ ｏ ｌ ｉ ｑ Ⅱ ｅ ｒ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ） 。本试 验条件 下 ， 菌株 Ｒ ４ ２ — １ ６的 最 佳 培 养 基 组 成 为 ： 玉米粉 １ ％、 酵母 浸粉 ２ ％、 Ｍｎ Ｓ Ｏ ． Ｈ Ｏ ０ ． ０ １ ％、 Ｃ ａ Ｃ １ ・ Ｈ ０ ０ ． ０ １ ％， 培 养基 最佳初 始 条件 为 ： 发 酵时 间４ ８ ｈ 、 接种量４ ｍ ｌ 、 ｐ Ｈ值 ６ 、 装液量 ５ ０ ｍｌ ／ ２ ５ ０ ｍｌ 。在 此优 化 条件 下 ， 发 酵 液 中菌株 Ｒ ４ ２ — １ ６的 活菌数 达 到 ３ ． １ ９ ｘ １ ０ ｃ ｆ ｕ ／ ｍ ｌ ， 芽孢
产L-乳酸芽孢杆菌的筛选分离和鉴定
项目总结题目：产L-乳酸芽孢杆菌的筛选分离和鉴定研究背景：在畜禽养殖过程中使用亚剂量的抗生素可以提高畜禽的生产性能。
但大面积、长期使用抗生素，畜禽产品的药物残留增加面临食品安全问题，而且导致耐药性细菌增加、蔓延，动物和人类在使用这些药物时的安全性和疗效降低。
欧盟已经于2006年1月开始禁止抗生素用作畜禽饲料添加剂。
益生素为“一种可以通过改善肠道微生态平衡而对动物有有利影响的活的微生物饲料添加剂。
它是一种能有效补充畜禽肠道内的有益微生物，改善消化道菌群平衡。
与抗生素相比而言，益生素不存在毒性、残留、耐药性和环境污染等问题，因而益生素的研究和应用日益受到人们的重视。
芽孢杆菌中一些种类能够利用葡萄糖和木糖代谢产生L-乳酸，如已经发现的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans ）。
如果筛选产L-乳酸的芽孢杆菌能够应用为益生菌的话，它将具有芽孢杆菌和乳酸菌两者的优点，应用前景更为广阔。
因此，本研究拟从畜禽粪便筛选产L-乳酸的芽孢杆菌，并在在体外检测芽孢杆菌有利于在胃肠道生态系统生存的固有特性和竞争性排斥病原菌的效应，为将芽孢杆菌应用为畜禽益生菌打下基础。
研究内容：我们小组的成员从08年的6月份开始着手产L-乳酸芽孢杆菌的筛选。
早期，我们考虑从酸菜汁中筛选产酸的芽孢杆菌。
方法一：所选用的培养基为筛选培养基，其配比为：葡萄糖0.6%，酵母膏0.1%，蛋白胨0.1%，MgSO4 0.005%，CaCO3 0.1%，溴甲酚紫溶液3-4滴，琼脂1.5%-2.0%。
PH7.2-7.4。
利用溴甲酚紫遇酸会变黄的原理筛选产酸的芽孢杆菌。
过程：（1） 样品制备：酸菜叶+100ml 无菌水，在85°C 进行水浴25min ，再进行梯度稀释821010---于7支试管中。
（2） 涂布于筛选培养基（紫色）上，观察，挑选能发生变色反应的产酸芽孢杆菌，进行划线（牛肉膏蛋白胨培养基），初步分离纯化。
（3） 再次划线，进一步分离纯化以期分离出单菌落。
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
枯草芽孢杆菌营养缺陷型突变株的筛选
题目：细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定一、实验原理：筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用亚硝酸钠为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
二、实验器材：离心机，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；接种针，三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，枪头三、菌种：大肠杆菌四、所有用到的培养基：（分别列出配方）1. LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min2. 基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。
配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。
全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。
3. 无N基本液体培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min4. 2N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min5. 完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。
6. 补充培养基(简称SM)：为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某—种或几种营养成分的培养基称补充培养基。
7.醋酸缓冲液(pH4.5)（取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml）、0.1 mol/L亚硝酸钠溶液(68.995×0.1=6.8995g/L)、0.07 mol/L酸氢二钠溶液(pH8.6)(141.96×0.07=9.9372g/L)五、实验步骤1th day: 各种所需培养基、试剂的配制及所需器材灭菌2th day：菌体活化与培养：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜，14~16h.3th day：早上添加5mlLB液，充分混匀后，分装到两只三角瓶，继续培养5小时。
实验5-营养缺陷型菌株筛选及鉴定
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
氨基酸缺陷性实验方案
2010级生物技术曹学敏学号：2010445007 2组氨基酸营养缺陷型的筛选及鉴定实验方案一、实验目的掌握对细菌进行诱变处理的方法以及对突变体检出、鉴定和获得营养缺陷型的方法二、实验材料(一) 菌种芽孢杆菌(二)培养基完全培养基（CM）：葡萄糖0.5 g 牛肉膏0.3 g 酵母膏0.3 g 蛋白胨 1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 琼脂2g 蒸馏水100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌20min。
基本培养基：（MM）葡萄糖0.5 g (NH4)2SO4 0.2 g 柠檬酸钠0.1 g MgSO4·7H2O 0.02 g K2HPO4 0.4 g 0.6 g 蒸馏水100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌20 min(三)主要药品：葡萄糖牛肉膏酵母膏蛋白胨MgSO4·7H2O (NH4)2SO4 柠檬酸钠K2HPO4 KH2PO4 亚硝基胍甲酰胺磷酸青霉素20种氨基酸（鸟氨酸苯丙氨酸谷氨酸甘氨酸组氨酸亮氨酸酪氨酸丝氨酸半胱氨酸异亮氨酸色氨酸丙氨酸蛋氨酸精氨酸苏氨酸天冬氨酸胱氨酸赖氨酸脯氨酸缬氨酸）（四）主要试剂：蒸馏水0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液生理盐水：0.9g氯化钠溶于100mL蒸馏水（五）器材及仪器：pH试纸黑纸吸水纸酒精灯接种环试管250ml 锥形瓶、100ml锥形瓶培养皿试管移液管10ml离心管玻璃棒玻璃珠玻璃刮灭菌牙签培养箱摇床离心机分析天平恒温水浴锅三、实验步骤（一）实验准备1.按配方配制培养基（配制200mL基本培养基、100mL完全培养基、100mL完全培养液和50mL基本培养液）和实验中所用药品。
2．取4mL融化完全培养基于试管中，盖上棉塞；分别取20mL完全培养液于两个250mL锥形瓶；然后将剩余的完全培养基与基本培养基放于锥形瓶中高温灭菌消毒，备用。
还需取7支10mL离心管、4支1mL移液管、3支5mL移液管、1支10mL移液管、10个大培养皿、10个玻璃刮250mL锥形瓶3个进行高温灭菌，备用。
838食品微生物学模拟题(三)
模拟题三一、名词解释（每小题４分，共计４０分）１．间体、异染颗粒、伴孢晶体、质粒【答案要点】（１）间体：细胞质膜内褶而形成的囊状构造，其中充满着层状或管状的泡囊。
多见于革兰氏阳性细菌。
（２）异染颗粒：是细菌特有的磷素贮藏养料。
因用蓝色染料染成紫红色而得名。
主要成分是聚偏磷酸盐。
（３）伴孢晶体：少数芽孢杆菌，例如苏云金杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（即δ内毒素），称为伴孢晶体。
（４）质粒：质粒是细菌染色体以外的遗传物质，能独立复制，为共价闭合环状双链ＤＮＡ。
２．芽孢、荚膜【答案要点】芽孢：某些细菌在一定的生长阶段，可在细胞内生成一个圆形、椭圆形或圆柱形高度折光的休眠体，称为芽孢。
荚膜：在某些细菌细胞壁外存在着一层厚度不定的胶状物质，称为荚膜。
３．酵母菌、霉菌、放线菌、细菌【答案要点】酵母菌：一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，形状为圆形、椭圆形或圆柱形。
霉菌：凡在营养基质上形成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网形丝状菌体的真菌，统称为霉菌。
放线菌：是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的单细胞多核的原核生物。
细菌：一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。
４．烈性噬菌体、溶源现象【答案要点】烈性噬菌体：指能够裂解宿主细胞的噬菌体．溶源现象：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到细菌染色体上，并随着细胞分裂而带到子代寄主细胞内，暂不引起细胞裂解，导致溶源性发生的现象就叫做溶源现象。
５．食物中毒、细菌性食物中毒【答案要点】食物中毒：食用了被有毒有害物质污染的食品或者食用了含有毒有害物质的食品后出现的急性、亚急性疾病，属于食源性疾病的范畴。
细菌性食物中毒：由细菌引起的食源性疾病习惯称为细菌性食物中毒，是由于进食被大量细菌或细菌毒素所污染的食物而引起的急性中毒性疾病。
６．内源性污染、外源性污染【答案要点】凡是动植物体在生活过程中，由于本身带有的微生物而造成的食品污染，称之为内源性污染；食品原料在收获、加工、运输、贮藏、销售过程中使食品发生的污染称之为外源性污染。
营养缺陷型菌株的检出方法
营养缺陷型菌株的检出方法
营养缺陷型菌株是指由于缺乏一定的营养物质而在培养基上无法生长的微生物菌株。
营养缺陷型菌株通常需要添加特定的营养物质才能够在培养基上生长，因此对这类菌株的检出是非常重要的。
下面将介绍一些常见的营养缺陷型菌株的检出方法。
1.培养基筛选法
培养基筛选法是最常用的检出营养缺陷型菌株的方法之一。
该方法通过设计特定的培养基，只有符合特定营养要求的菌株才能够生长。
例如，对于缺乏特定氨基酸的菌株，可以设计一种缺乏该氨基酸的培养基，只有含有相应营养物质的菌株才能在该培养基上生长。
2.生化特性检测法
生化特性检测法是通过检测菌株的生化特性来区分不同类型的菌株。
对于营养缺陷型菌株，可以通过检测其在缺乏特定营养物质的条件下的代谢特性来确定其是否为营养缺陷型菌株。
例如，缺乏一种氨基酸的菌株在培养基上生长会产生特定的代谢产物，通过检测这些产物就可以确定该菌株是否为营养缺陷型菌株。
3.分子生物学方法
分子生物学方法在检出营养缺陷型菌株方面也具有重要的应用价值。
通过对菌株的基因组进行测序分析，可以发现其缺乏特定代谢途径的基因或者具有特定缺陷型基因的特征。
通过分析这些基因的表达情况可以确定菌株是否为营养缺陷型菌株。
总的来说，对于营养缺陷型菌株的检出需要综合运用培养基筛选法、生化特性检测法和分子生物学方法的手段。
通过综合应用这些方法可以快速、准确地检出营养缺陷型菌株，为菌株的鉴定和分类提供重要的帮助。
同时，对于一些工业应用、食品安全和环境监测等领域也有重要的意义。
营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合
营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合摘要:本实验主要是筛选鉴定芽胞杆菌营养缺陷型菌株，制备原生质体并检出融合子。
以现有的枯草芽胞杆菌为材料，进行紫外诱变，并逐级筛选出某种氨基最后进行不同缺陷型菌株的原生质融合并检出融合子。
实验酸营养缺陷型菌株。
得到色氨酸营养缺陷型，原生质再生率93.3%，亲本再生率83.9%，融合率为0.74%。
故本实验所采用的一系列方法都比较适宜。
关键词:芽胞杆菌紫外诱变原生质融合枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群，是工业、农业和医药工业等领域广泛应用的一种细菌。
枯草芽胞杆菌在生长过程中产生的抗菌蛋白对动植物病原菌均有很强的抑制作用,且能提高动植物免疫抗病能力。
蛋白酶作为枯草芽胞杆菌产生的另一种有重要价值的产物,在纺织、食品、饲料、洗涤剂及皮革工业中早已发挥着重要的作用。
蛋白酶作为饲用酶制剂的重要成分,有利于提高饵料蛋白质在仔猪消化道的消化率,具有促进生长、改善健康状况等作用。
蛋白质是仔鱼、仔虾生长的主要成分之一,饵料蛋白质的质量分数高达35%-55%,但消化率却较低。
因此,蛋白酶也是鱼、虾饲料中必须添加的消化酶。
1. 实验材料1.1菌株上学期筛选出来的产蛋白酶的枯草芽孢杆菌1.2 培养基完全培养基(CM，液体)、完全培养基(CM，固体)、基本培养基(MM)、补充基本培养基(SM)、再生补充基本培养基(SMR)1.3试剂缓冲液、原生质体稳定液(SMM)、促融合剂(40,聚乙二醇(PEG-4000)的SMM液) 溶菌酶液等1.4主要仪器显微镜、台式离心机及各种微生物实验常用仪器2.实验方法2.1菌悬液制备2.1.1细胞悬浮液的制备取保藏的斜面菌种，接种到液体试管中在转接入三角瓶。
取适量培养液，离心，收集菌体，洗涤沉淀，之后将菌体充分悬浮于10mL生理盐水中 2.1.2活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度采用十倍稀释法测定细胞菌悬液的浓度。
营养缺陷型菌株的筛选方法课件
• 2、菌丝过滤法
• 真菌和放线菌等丝 状菌的野生型孢子 在基本培养基中能 萌发长成菌丝，而 营养缺陷型的孢子 则不能萌发。把诱 变处理后的孢子移 入到基本培养液中 ，振荡培养10h左右 ，使野生型孢子萌 发的菌丝刚刚肉眼 可见，用灭菌的脱
、限量营养法和影印接种法等
• 1、点植对照法：诱变后的孢子或菌体，经富集培 养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落 孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上 孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板 上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长 情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应 位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子 或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上 ，进一步复证。该法可夹靠层性平板强法，但工作量大。
• 1、诱变培养
• 营养缺陷型的诱变方
• 2、淘汰野生型
• 3、检出营养缺陷型
• 4、鉴别缺陷种类，确 定生长谱
法和诱变因子与普通
诱变育种基本相同。
用于诱发营养缺陷型 的诱变剂有亚硝基胍, 紫外线,亚硝酸等,其中
亚硝基胍的诱发突变 率极高,一般可达10% 以上,另外,随着诱变剂
量的提高突变频率也 追加。
什么是营养缺陷ห้องสมุดไป่ตู้菌株？
• 经过人工诱变或自 然突变失去合成某 种营养（氨基酸， 维生素，核酸等） 的能力，只有在基 本培养基中补充所 缺乏的营养因子才 能生长的野生型菌 株。
土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定
土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定一、引言芽孢杆菌（Bacillus）是一类广泛存在于土壤中的细菌，具有较高的耐受性和适应能力。
研究土壤中芽孢杆菌的分离和鉴定，对于了解土壤微生物群落的多样性和功能具有重要意义。
本文旨在介绍土壤中芽孢杆菌的分离方法及初步鉴定步骤，以供参考。
二、芽孢杆菌的分离方法2.1 采样1.选择适当的采样地点，如农田、林地或草地等。
2.使用无菌铁铲或无菌采样袋等工具采集土壤样品，避免污染。
3.采集多个不同位置的土壤样品，以增加样品的代表性。
2.2 分离培养基的选择1.常用的分离芽孢杆菌的培养基有营养琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基等。
2.培养基中可以添加适当的抑菌剂，如青霉素或链霉素，以抑制其他细菌的生长。
2.3 分离培养1.取适量土壤样品加入到分离培养基中，均匀涂布于琼脂平板上。
2.使用无菌鉴别环或无菌棉签，在培养基表面划线，以分离不同的菌落。
3.将琼脂平板倒置放入恒温培养箱中，培养温度一般为30°C。
4.观察培养基上的菌落形态，并进行初步鉴定。
三、芽孢杆菌的初步鉴定步骤3.1 形态特征观察1.观察菌落的形状、颜色和质地等特征。
2.观察菌落的边缘形态，如光滑、凹凸不平或褶皱等。
3.观察菌落的直径和高度等参数。
3.2 石蜡切片染色1.从培养基上挑取一颗纯培养的菌落，用无菌的刮片将其转移到玻璃片上。
2.在玻璃片上加入一滴碘酒，静置片刻。
3.用无菌的刮片将菌落与碘酒混合均匀。
4.加入一滴无菌水，冲洗碘酒。
5.加入一滴甲苯，使细胞透明化。
6.加入一滴碱性溴甲酮，染色。
7.加入一滴甲苯，清洗溴甲酮。
8.加入一滴封片剂，加盖封片。
3.3 微观形态观察1.使用光学显微镜观察石蜡切片。
2.观察细胞形态、大小、排列方式等特征。
3.观察细胞内部结构，如芽孢、胞内颗粒等。
3.4 生理生化特性测试1.进行革兰氏染色，观察细胞壁结构。
2.进行氧需求实验，观察芽孢杆菌的氧耐受性。
3.进行酸碱度测试，观察芽孢杆菌的酸碱耐受性。
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选与鉴定实验
三、实验器材与仪器
• 1、葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、 MgSO4•7H2O、(NH4)2SO4、柠檬酸钠 K2HPO4、KH2PO4、亚硝基胍、甲酰胺磷 酸、青霉素、20种氨基酸（鸟氨酸、苯丙 氨酸、谷氨酸、甘氨酸组氨酸、亮氨酸、 酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、 色氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、精氨酸、苏氨 酸、天冬氨酸、胱氨酸、赖氨酸 脯氨酸、 缬氨酸）
组别 第6组 第7组 第8组 第9组
第1组 丙氨酸 谷氨酸 亮氨酸 丝氨酸
第2组 精氨酸 谷氨酰胺 赖氨酸 苏氨酸
第3组 天冬氨酸 甘氨酸 蛋氨酸 色氨酸
第4组 天冬酰胺 组氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸
第5组 半胱氨酸 异亮氨酸 脯氨酸 缬氨酸
• 5、分别配置如下培养基 • ①完全培养基（CM）：葡萄糖 0.5 g 牛肉膏 0.3 g 酵母 膏 0.3 g 蛋白胨 1 g MgSO4•7H2O 0.2 g 琼脂2g 蒸馏水 100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌20min。 • ②基本培养基（MM）：葡萄糖 0.5 g (NH4)2SO4 0.2 g 柠檬酸钠 0.1 g MgSO4•7H2O 0.02 g K2HPO4 0.4 g 0.6 g 蒸馏水 100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌20 min • ③无氮基本培养基（饥饿培养） 在基本培养基中（MM）不加(NH4)2SO4(液体)。 ④2 倍氮源基本培养基 在基本培养基中加入2 倍(NH4)2SO4(液体)
• 2、pH试纸、黑纸、吸水纸、酒精灯、接种环、 试管、250ml无菌锥形瓶、100ml无菌锥形瓶、培 养皿、无菌试管若干、无菌移液管、10ml离心管、 无菌玻璃涂棒、玻璃珠、玻璃刮、灭菌牙签、培 养箱、摇床、台式离心机、分析天平、恒温水浴 锅等 • 3、蒸馏水、0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液、生理 盐水：0.9g氯化溶于100mL蒸馏水 • 4、菌种 从自然界筛选的普通野生芽孢杆菌
实验三营养缺陷型的筛选
实验三营养缺陷型的筛选一、教学目标及基本要求理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。
二、实验原理营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
三、实验材料1. 菌种枯草杆菌（B.subtilis）。
2. 培养基(1) 细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。
(2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。
配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。
(3) 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。
(4) 二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。
(5) 限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。
3. 溶液(1) 无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。
(2) 水溶性维生素混合液。
(3) 核酸水解液：取2g RNA，加入15ml 1mol/L NaOH；另取2g RNA，加入15ml1mol/L HCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。
4. 其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。
四、实验内容1. 菌体前培养取新活化的的枯草芽孢杆菌斜面菌种1环，接入装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养16~18h。
产广谱细菌素芽孢菌筛选与鉴定
产广谱细菌素芽孢菌筛选与鉴定一、引言随着全球对抗细菌耐药性的加剧，寻找新型抗菌素成为当今生物医药研究的重点之一。
而广谱细菌素被认为是一种有效的抗菌素，可以用于治疗多种细菌感染。
而芽孢菌因其良好的抗逆性和易培养的特点，成为制备广谱细菌素的理想生产菌株。
本文将从芽孢菌的筛选与鉴定两个方面进行探讨，以期为广谱细菌素的生产提供理论与实践的指导。
二、芽孢菌的筛选1. 样品的收集芽孢菌在自然界中广泛存在于土壤、水体、空气等各种环境中，因此样品的收集十分重要。
通常可以选择一些有机肥料、沼液或混合土壤等富含有机质的场地进行采样。
在采样时应选择晨间或傍晚时分，避免阳光直射，减少外来微生物的污染。
2. 芽孢菌的富集和分离将采集到的样品用生理盐水或0.85%NaCl等分装到离心管中，通过适当稀释后进行均质化处理，然后利用平板分离的方式分别在培养基上进行培养。
为了增加分离效果，可以考虑利用高温杀灭其他微生物，再进行分离操作。
分离培养基的选择很重要，通常可以选择富含碳源和氮源的培养基，如含有葵花籽面、玉米粉和蔗糖的淀粉酪蛋白琼脂培养基。
3. 特性鉴定在分离到纯培养菌株后，需要对其进行特性鉴定，确定其为芽孢菌。
一般可以从形态学、生理生化特性以及分子生物学等多个方面进行鉴定。
形态学鉴定包括菌落形态、细胞形态、芽生殖孢子形态等；生理生化特性的鉴定可以包括菌株对不同碳源和氮源的利用情况，以及对一些特定生物学和生化试剂的反应情况；分子生物学鉴定则可以通过PCR扩增16S rRNA基因进行序列分析。
三、芽孢菌的产广谱细菌素筛选芽孢菌产广谱细菌素的能力在很大程度上取决于其生物学特性和遗传特性。
下面将介绍一些常用的筛选方法。
1. 在发酵条件下筛选利用适当的发酵培养条件进行筛选是一种常用的方法。
在优化的发酵培养基中进行批次发酵培养，通过对细菌素产生量的测定，选择产生广谱细菌素能力较强的菌株。
在发酵条件的优化方面，可以通过改变培养基成分、调节培养基初始pH值、控制培养温度、增加氧气供应等方式来优化发酵过程。
2010 益生芽孢杆菌的筛选与鉴定
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实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
菌丝过滤法：该方法只适用于真菌，在基本培养基中野生型孢子可以发育成菌丝体，而突变型的不可以，这样经诱变后的孢子在基本培养基中培养一段时间后过滤，重复几次后就可达到浓缩突变型菌体的作用。
抗生素法：是利用野生型菌株能在基本培养基中生长，而缺陷型不能生长，将诱变处理液在基本培养基中培养让野生型生长一周，而缺陷型无法生长，加入一定量的抗生素，使活化的野生型杀死，保存了缺陷型。
在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。
高温杀菌法：本实验利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，诱变后的细菌形成芽孢后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。
此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留。
3.营养缺陷型的检出营养缺陷性的检出方法包括影印法、夹层法、限量补充法、逐个检出法。
影印法：先将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。
在完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。
将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。
然后将CM和MM在恒温箱中培养。
在两平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。
MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。
此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。
本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。
夹层法：先在培养皿上倒一层基本固体培养基，凝固后涂上一层含菌的基本固体培养基，凝固后再倒一薄层基本固体培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层完全固体培养基，再培养。
这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。
此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。
限量补充法：方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。
逐个检出法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。
如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。
挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证[3]。
4.鉴定营养缺陷型菌株鉴定营养缺陷型一般采用生长谱法。
生长谱法：指在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况。
其原理是：在缺乏某种营养物质的，含有指示剂的培养基上接入某种微生物，再在接菌平板上置入这种营养物质，经一定条件培养后，即可通过指示剂变化情况来判断对不同营养物质的利用情况。
该法可以定性，定量地测定微生物对各种营养物质的要求，在微生物育种，营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。
三、实验材料及仪器3.1菌种：枯草芽孢杆菌。
3.2 培养基3.2.1 细菌完全培养基葡萄糖 0.5 g牛肉膏 0.3 g酵母膏 0.3 g蛋白胨 1 gMgSO4·7H2O 0.2 g蒸馏水 100 mLpH 7.2 100 Pa 灭菌20min。
3.2.2 细菌基本培养基葡萄糖 0.5 g(NH4)2SO4 0.2 g柠檬酸钠 0.1 gMgSO4·7H2O 0.02 gK2HPO4 0.4 gKH2PO4 0.6 g重蒸水 100 mLpH 7.2 100 Pa 灭菌20 min。
配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂，全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。
3.2.3 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4 和琼脂。
3.2.4. 二倍氮源基本培养基在基本培养基中，加入2 倍(NH4)2SO4，不加琼脂。
3.2.5. 补充培养基(限制培养基)向配制好的液体基本培养基中加入0.1-0.5%的完全培养基，加入2%的琼脂。
注：配制基本培养基的药品均用分析纯，使用的器皿应洁净，需用蒸馏水冲洗2~3 次，必要时用重蒸水冲洗。
3.3溶液3.3.1. 部分氨基酸组合液另取20 种氨基酸按表1 组合成9 组氨基酸混合液。
1~5 组每组含4 种氨基酸，6~9 组每组含5 种氨基酸，添加至基本培养基后，使每种氨基酸同时在两组中出现，供营养缺陷型标记确认用。
表 1 氨基酸不同组合表3.3.2. 青霉素溶液10 000 u/mL。
3.3.3. 其他溶液磷酸缓冲液(pH 6.0，0.2 mol/L)、生理盐水、硫代硫酸钠溶液（0.5 mol/L)、亚硝基胍溶液（0.5mg/mL)。
（1）0.5 mol/L 硫代硫酸钠溶液(浸泡沾染过NTG 的破璃器皿)称取124 g 硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)，溶于蒸馏水中，定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，保存备用。
（2） 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 5.8、pH 6.0、pH 7.4)Na2HPO4·2H2O 相对分子质量为178.05，0.2 mol/L 溶液含35.61 g/L，称取35.61 g Na2HPO4·2H2O ，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
NaH2PO4·H2O 相对分子质量为138.01，0.2 mol/L 溶液含27.6 g/L，称取27.6 g NaH2PO4·H2O ，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
3.4 仪器台式离心机、旋涡混合器、恒温培养箱、电炉等。
无菌移液管、无菌试管、无菌离心管、无菌锥形瓶、无菌培养皿、无菌玻璃涂棒、无菌牙签或插有大头针的无菌软木塞、稀释分离、平皿菌落计数所需的无菌生理盐水和无菌器皿等。
四、实验步骤(一) 诱变处理1. 前培养取新活化的棒杆菌T6-13 斜面菌种—环，接入盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养14~16 h，再取1mL 培养液转接于另一盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养4~6h，使细胞处于对数生长期。
2. 菌悬液制备取10 mL 培养液于无菌离心管中，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，打匀管底菌团，加入5mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液，摇匀后倒入盛有45 mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液并带玻璃珠的100 mL 锥形瓶中，振荡10 min，调整细胞浓度为5×108 个/mL，用完全培养基平板菌落计数法测定总菌数。
3. 诱变处理(1) 称取0.5 mg NTG 于无菌离心管中，再加0.05mL 甲酰胺助溶，然后加入0.2 mol/LpH 6.0 磷酸缓冲液1mL，使完全溶解，用黑纸包好在30℃水浴中保温(临用时配制)。
NTG 是一种超诱变剂，需小心操作。
称量药品时，戴好塑料手套和口罩，称量纸用完后立即烧毁；取样需用橡皮头的移液管，绝不能直接用嘴吸，接触沾染有NTG 的称液管、离心管、锥形瓶等玻璃器皿，需浸泡于0. 5 mol/L 硫代硫酸钠溶液中，置通风处过夜，然后再用水充分冲洗；溶液外溢时，用沾浸硫代硫酸钠溶液抹布擦洗；诱变处理后含NTG 的磷酸缓冲液及稀释液，立即倒入浓NaOH 溶液中，若手接触NTG，应立即用水冲洗。
NTG 在可见光下会放出NO，使溶液颜色由土黄色变为黄绿色，故应放在棕色瓶中保存。
(2) 取4 mL 细胞悬浮液(5×108 个/mL 左右)加入上述离心管中，充分混匀，立即置30℃水浴振荡处理30 min(NTG 处理终浓度为100 ug/mL)后，离心收集菌体，将含NTG 的上清液倒入浓NaoH 溶液中弃去，用无菌水洗涤菌体3 次，以大量稀释法终止NTG 的诱变作用。
最后向离心管中加5 mL 无菌生理盐水，摇匀后从中取出0.5 mL NTG 处理后的菌悬液，用4.5 mL 生理盐水稀释至10-3 稀释度。
用倾注分离法在完全培养基平板上进行存活菌计数，每个稀释度做三个平皿，计算杀菌率。
4. 中间培养将1 mL 诱变处理洗涤过的菌液，加入装有20 mL 完全培养基的250 ml 锥形瓶中，30℃振荡培养过夜(时间不宜太长，否则同一种突变株增殖过多)。
(二) 淘汰野生型(青霉素法)1. 饥饿培养取10 mL 中间培养液，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体3 次，加到无氮源的基本培养基中，30℃振荡培养4~6 h。