芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定

实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定

一、实验目的

掌握各种培养基的配制方法；

理解选育营养缺陷突变株的选育原理；

掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；

获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。

二、实验原理

营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。

筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。

1.诱变处理

基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。

亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。

2.淘汰野生型

诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。

菌丝过滤法：该方法只适用于真菌，在基本培养基中野生型孢子可以发育成菌丝体，而突变型的不可以，这样经诱变后的孢子在基本培养基中培养一段时间后过滤，重复几次后就可达到浓缩突变型菌体的作用。

抗生素法：是利用野生型菌株能在基本培养基中生长，而缺陷型不能生长，将诱变处理液在基本培养基中培养让野生型生长一周，而缺陷型无法生长，加入一定量的抗生素，使活化的野生型杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。高温杀菌法：本实验利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，诱变后的细菌形成芽孢后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留。

3.营养缺陷型的检出

营养缺陷性的检出方法包括影印法、夹层法、限量补充法、逐个检出法。

影印法：先将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。在完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。将基本培养

基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。然后将CM和MM在恒温箱中培养。在两平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。

夹层法：先在培养皿上倒一层基本固体培养基，凝固后涂上一层含菌的基本固体培养基，凝固后再倒一薄层基本固体培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层完全固体培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。

限量补充法：方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。

逐个检出法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证[3]。

4.鉴定营养缺陷型菌株

鉴定营养缺陷型一般采用生长谱法。

生长谱法：指在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况。

其原理是：在缺乏某种营养物质的，含有指示剂的培养基上接入某种微生物，再在接菌平板上置入这种营养物质，经一定条件培养后，即可通过指示剂变化情况来判断对不同营养物质的利用情况。该法可以定性，定量地测定微生物对各种营养物质的要求，在微生物育种，营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。

三、实验材料及仪器

3.1菌种：枯草芽孢杆菌。

3.2 培养基

3.2.1 细菌完全培养基

葡萄糖 0.5 g

牛肉膏 0.3 g

酵母膏 0.3 g

蛋白胨 1 g

MgSO4·7H2O 0.2 g

蒸馏水 100 mL

pH 7.2 100 Pa 灭菌20min。

3.2.2 细菌基本培养基

葡萄糖 0.5 g

(NH4)2SO4 0.2 g

柠檬酸钠 0.1 g

MgSO4·7H2O 0.02 g

K2HPO4 0.4 g

KH2PO4 0.6 g

重蒸水 100 mL

pH 7.2 100 Pa 灭菌20 min。

配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂，全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水