乙酰胆碱酯酶活性测定
实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0K t 吸光度A实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。
由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。
对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。
长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。
一、 实验目的1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。
二、 实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。
以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。
根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。
当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：%10000⨯-=K K K Y tK 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜率值其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。
酶动力学实验报告
酶动力学实验报告酶动力学实验是一项旨在研究酶的活性与反应速率之间关系的实验。
本次实验旨在通过测定不同底物浓度对酶反应速率的影响，进一步了解酶的催化作用和动力学特性。
实验采用乙酰胆碱酯酶（AChE）为模型酶，选择丙酮胆碱作为底物。
1. 实验目的本实验旨在探究酶动力学的基本原理，并通过测定不同底物浓度对酶反应速率的影响，建立酶底物反应速率的动力学方程。
2. 实验原理乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种具有催化分解乙酰胆碱能力的酶。
实验中，我们将通过测定乙酰胆碱被AChE分解产生的胆碱的量，来间接测定酶反应速率。
3. 实验步骤3.1 制备实验溶液依次向一组试管中加入0.5 ml pH 7.4磷酸盐缓冲液、0.1 ml AChE溶液、0.1 ml不同浓度的丙酮胆碱底物溶液，并用蒸馏水稀释至1 ml。
3.2 酶反应体系的建立将制备好的试管放入恒温水浴中，并将温度维持在37°C恒温条件下。
在反应开始前，将所有试管放在水浴中预热5分钟，确保反应体系温度均匀。
3.3 反应开始在预热后的试管中，迅速注射0.1 ml乙酰胆碱底物溶液，并用计时器计时，开始测量反应时间。
3.4 反应停止在不同反应时间点，取出等体积试管放入冷水中，停止酶反应。
不同试管的停止时间需控制在一定时间范围内。
3.5 测定胆碱产量将反应停止后的试管转移至离心机中，以10000 r/min的速度离心5分钟，离心后取出上清液，用比色皿测定胆碱的含量。
4. 数据处理与分析4.1 曲线拟合根据测得的胆碱产量数据，绘制初始速率随底物浓度变化的曲线。
采用非线性拟合方法，拟合酶底物反应速率的动力学方程。
4.2 动力学方程分析拟合出的动力学方程，推导出酶底物反应速率的相关参数，如最大速率（Vmax）和底物浓度为一半时的速率（V0.5）等。
4.3 酶动力学分析通过分析动力学参数，了解酶的催化活性和抑制效果等信息，进一步研究酶的机制和性能。
5. 结果与讨论根据实验数据，绘制了初始速率与底物浓度的曲线。
血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的检测与临床应用
在神经系统疾病治疗过程中，检测乙酰胆碱酯酶的活性可以评估患者的病情状 态，为调整治疗方案提供依据。
评估治疗效果
评估肾脏治疗效果
通过比较治疗前后血液中乙酰胆碱酯酶的活性变化，可以评估肾脏疾病的治疗效果，有助于指导后续 治疗。
评估神经系统疾病治疗效果
检测乙酰胆碱酯酶的活性可以评估神经系统疾病的治疗效果，为患者预后判断提供参考。
应用
诊断疾病
诊断肾脏疾病
血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的活性 变化可以作为肾脏疾病的辅助诊断指 标，有助于早期发现肾脏损伤。
诊断神经系统疾病
乙酰胆碱酯酶在神经系统中有重要功 能，检测血液中乙酰胆碱酯酶的活性 可以辅助诊断神经系统疾病，如阿尔 茨海默病、帕金森病等。
监测病情
监测肾脏功能
通过定期检测血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的活性，可以动态观察肾脏功能的 变化，有助于及时调整治疗方案。
酶蛋白检测具有较高的灵敏度和特异 性，适用于研究目的的检测。
酶基因检测
酶基因检测是通过检测乙酰胆碱酯酶基因序列，从而了解基因突变、多态性等情况。常用的检测方法包括基因测序、单倍型 分析等。
酶基因检测具有预测疾病风险、指导个体化治疗等优点，但操作复杂、成本较高。
03
血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的临床
血液透析患者中乙酰胆碱 酯酶的检测与临床应用
• 引言 • 血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的检测
方法 • 血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的临床
应用 • 血液透析患者中乙酰胆碱酯酶检测的
临床意义 • 结论
01
引言
研究背景
血液透析是治疗肾功能衰竭的重要手段，但过程中可能导致患者体内乙酰胆碱酯酶 活性降低。
乙酰胆碱酯酶是人体内重要的神经递质代谢酶，其在血液中的活性水平与神经系统 疾病、肝病等多种疾病的发生和发展密切相关。
6,胆碱酯酶活性测定
实习三有机磷经皮染毒对全血胆碱酯酶活性的影响（一）目的和意义1、学习经皮染毒技术，掌握急性经皮毒性试验的方法。
2、观察有机磷经皮肤吸收后对机体的急性毒性作用。
3、掌握全血胆碱酯酶活性的测定方法及原理。
（二）仪器1．解剖剪刀、弯剪、镊子、灌胃针。
2．恒温水箱(37±0.5℃)。
3．离心机。
4．分光光度计，10mm比色皿。
5．血红蛋白吸管（20μl）；刻度吸管（5.0ml，2.0ml，1.0ml）；离心管（10ml）；容量瓶（10ml，100ml）；试管（10ml）、烧杯等。
（三）试剂1．受试物：有机磷（由指导教师自定）；溶剂，根据受试物的理化性质选定。
2．磷酸盐缓冲液(1/15m mol/L，pH7.40)：称取9.07g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解并稀释至1000mL(甲液)；称取23.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，用水溶解并稀释至1000mL(乙液)。
取甲液19.2mL与乙液80.8mL混合即得。
3．生理盐水：氯化钠8.5g/L。
4．硫代乙酰胆碱(ASCh)：称取72.3mg ASCh(生物试剂)溶于生理盐水中，并稀释到10mL；置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
5．5，5′－联硫代－双－2－硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
出现黄色即弃用。
6．抑制剂毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。
7．1m mol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。
此液1mL相当于1μmol谷胱甘肽。
因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。
（四）实验步骤1．实验动物的选择实验动物可选择健康豚鼠或家兔，也可用大鼠。
鱼乙酰胆碱酯酶(AchE)说明书活性
释。
200IU/L
5 号标准品
150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液
100IU/L
4 号标准品
150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
50IU/L
3 号标准品
150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
25IU/L
2 号标准品
150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
活性浓度。
试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液
20ml×1 瓶
7 终止液
6ml×1标准品（400IU/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板
12 孔×8 条
9 标准品稀释液
1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液
6ml×1 瓶
10 说明书
1份
5 显色剂 A 液
6ml×1 瓶
11 封板膜
用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。 注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
重症肌无力患者血乙酰胆碱酯酶活性测定及其临床意义
ａｖ ｎｅ ｒｈＮ ｕｏ，９ ９ ５ （ ） １ ３—１７ ｄ ａｃ．Ａ ｃ ｅ ｒｌｌ９ ，６ ２ ：６ ６
（ 收稿 ：０４—０ ２０ ７—１ ） ９
腰神经丛及坐骨神经 阻滞致局麻药急性 中毒 ２例
李勇帅 鲁开智 曹 剑
随 着腰 丛及 坐骨 神经 阻滞 在临 床麻 意识逐渐恢 复 ， 不能记 忆刚才所发生 的情 过快。 这就提醒我们 以后作 神经 阻滞 时虽 同时在 醉中的应用越来越 广泛 ， 其麻醉并发症也 况。 后再次作 坐骨神经 阻滞 ， 效果好 ， 顺利 然回抽 无血也应注意局麻药 中毒 ， 就相应增多 ， 院在进行腰丛及坐骨神经 完成 手术 。术后 病 人无不 良记 忆及 并发 麻醉前必须作好急 救药物及物 品的准备 ， 我 阻滞过 程中共出现 ２ 例局麻药急性中毒 。 现介绍如下 。 １ 临床资料
２ 许贤豪 ， ．神经免疫学 ．北 京： 京医科大学 巾囤协和医科大学 著 北 联合 出版社 ， ９２： ｌｌ—ｌ ５ ｌ９ ｌ３ １０
３ Ｈｅ ｚ ｎ ｅＴ．Ｔ ｅａ ｙｏ ａｔ ｅ ｉ ｍｖｓｗｉ ｈ ｌｎ ｓｅ ｅｉｈｂｔｒ— ｈ ｒｐ ｆＭｙ ｓｈ ｎａｇ ｉ ｔ ｃ ｏｉｅｔｍｓ ｎ ｜ｉ Ｓ ｈ ｏ
作 者单位 ： ４０ ８ 湖北省十堰 市郧阳医学 院附属东 风医院 （ ４２０ 张润 希 ） ３００ 杭 州市第一人 民医院 （ ； １０６ 李保 华 ） ４０ ２ 武 汉市华 中科 ； ３０２ 技 大学 附属同济医院 （ 徐金枝 ）
乙酰胆碱酯 酶活性 升高见 于脂肪肝 、肾病综 合 征、 甲状腺机能亢进 、 糖尿病 、 高脂血症 、 支气管哮喘 、 多发性硬化、 高血压 、 妊娠 、 癫痫 ， 女性在月经期或长
维普资讯
实用医学杂志 ２ ０ 年第 ２ 卷第 １ ０５ １ 期
乙酰胆碱酯酶活性测定
乙酰胆碱酯酶酶活的测试作者：陈志坚1 准备工作0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。
2 酶液制备SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。
将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。
然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。
将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。
3 酶活性抑制测试3.1 配药液参照脲酶实验3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH3.3 酶活测试在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。
这是未加药酶活力为E1。
在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
计算出此时酶活，为E2。
抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100%得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。
试验简报 小菜蛾乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶活力测定
[试验简报]小菜蛾乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶活力测定周先志，刘波*（福建省农科院生物技术中心）1前言通过田间三龄小菜蛾幼虫与网室内长期饲养的三龄小菜蛾幼虫的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶的活性作比较，并测定不同温度下饲养的三龄小菜蛾幼虫的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活力，发现抗性产生的原因。
通过测定小菜蛾不同龄期幼虫以及蛹和成虫的羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶的比活力，发现其酶活差异，并找出其酶活最小的发育阶段，即耐药性最差的发育阶段，指导田间用药，并将田间三龄小菜蛾幼虫与网室内长期饲养的三龄小菜蛾幼虫的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶的活性作比较，发现抗性产生的原因。
2 材料与方法羧酸酯酶比活力测定参考Van Asperen(1962)的方法；乙酰胆碱比活力测定参考Ellman(1961)的方法；酶源蛋白质含量测定参考Bradford (1976)记述的考马斯亮蓝G-250染色法测定。
3结果与分析3.1 不同龄期小菜蛾幼虫及蛹和成虫α-NA羧酸酯酶活力由表1可知不同龄期的小菜蛾幼虫α-NA羧酸酯酶的总活力和比活力均随龄期的增大而增大，四龄小菜蛾幼虫的总活力和比活力最大，一龄小菜蛾幼虫总α-NA羧酸酯酶活力的最小，蛹的α-NA羧酸酯酶的比活力最小，蛹期的总活力要高于一龄幼虫，但比活力要低于一龄幼虫，这是由于一龄小菜蛾幼虫的蛋白质浓度要低于蛹。
小菜蛾蛹、成虫和一龄幼虫的α-NA羧酸酯酶比活力差异不显著，四龄小菜蛾幼虫的总活力和比活力与一龄小菜蛾幼虫的相比差异较大，分别是一龄的7.32和5.31倍。
表1 不同龄期小菜蛾幼虫以及蛹和成虫α-NA羧酸酯酶活力虫龄 总活力umol.min.头比值 比活力umol.min.mg比值1 2 3 4 蛹成虫2.0421×108.3993×10-31.1393×10-21.4943×10-24.8466×10-32.947×10-31.004.115.587.322.371.446.519×102.1454×10-23.2283×10-23.4630×10-25.231×10-36.6749×10-31.003.294.955.310.801.023.2 不同龄期小菜蛾幼虫以及蛹和成虫乙酰胆碱酯酶活力由表2可知，不同龄期的小菜蛾幼虫的乙酰胆碱的总活力和比活力均随虫龄的增大而增大，蛹的乙酰胆碱总活力高于四龄幼虫，但比活力低于四龄幼虫。
胆碱酯酶(CHE)测定操作规程
胆碱酯酶（CHE）测定操作规程一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中胆碱脂酶（CHE）的活性。
二、临床意义（一）概述胆碱脂酶可以分为乙酰胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前类亦称真性胆碱酯酶，主要存在于胆碱神经末梢突触间隙。
乙酰胆碱酯酶可以在神经末梢、效应器接头或突触间隙等部位终止乙酰胆碱作用。
（二）临床意义1. 病理性升高：肾病综合征，甲状腺功能亢进，糖尿病，脂肪肝，原发性家族性高CHE血症，血清CHE变异，原发性肝癌等。
2. 病理性降低：重症肝炎，慢性肝炎活动型，肝硬化，肝脓肿，各种癌，低蛋白血症(营养不良，贫血，感染，皮肌炎，急性心肌梗死)，遗传性血清CHE异常症，有机磷中毒(轻度中毒降低30%，中度中毒降低50%，重度中毒降低70%)，溃疡性结肠炎，肾功能不全，天疱疮，烧伤等。
（三）检验原理胆碱酯酶催化S-碘化丁酰基硫代胆碱水解，生成丁酸与硫代胆碱，硫代胆碱与黄色的铁氰化钾[Fe(CN)6]3-反应后形成无色的[Fe(CN)6]4-，在405nm吸光度下降的速率与标本中胆碱酯酶活性成正比。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
CHE测定样品为不溶血的血清、血浆（肝素抗凝）。
样品应在低温条件下运输并及时测定。
不能使用EDTA抗凝剂的标本。
五、试剂（一）试剂组成不同批号试剂中各组份不能互换。
（二）试剂准备R1和R2试剂为即用型液体试剂，开瓶装载即可使用，用后应及时冷藏保存。
（三）试剂的保存及稳定性1. 不能冰冻试剂。
2. 未开瓶的R1和R2试剂应在2～8℃密闭避光贮存，稳定期为瓶签标示的有效期。
乙酰胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性的测定
乙酰胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性的测定全血胆碱酯酶活性的测定——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。
2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。
3. 学会末梢血的采集。
实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。
未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。
颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。
在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
试剂和材料蒸馏水分光光度计盐酸溶液(1＋2) 10mL比色管碱性羟胺溶液漏斗磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 恒温水浴箱，控温±0.5℃三氯化铁溶液采血针头氯化乙酰胆碱标准液血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min + 1.0mL 乙酰胆碱应用液30minD 空白管 1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴+1.0mL水37℃水浴30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇2min；2.加入2.0mL 盐酸溶液，充分振摇2min；3.加入2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。
实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B C D吸光度0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得：Xs=0.538+0.003-0.299⨯7=3.149μ0.538molXs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL37℃30min)；A：试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；以B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。
乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书
乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途乙酰胆碱酯酶活性抑制剂筛选比色法检测试剂是一种旨在通过乙酰胆碱酯酶反应系统中，在抑制剂存在与否的情况下，所释放出巯基胆碱，与Ellman试剂反应后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来评价样品酶活抑制能力的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种抑制剂筛选检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又称为红细胞胆碱酯酶（RBC cholinesterase），广泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在脑组织、神经肌肉连接处（neuromuscular junction）、中枢神经系统的胆碱能突触（cholinergic synapses）和红细胞膜上高度表达，催化主要的神经传导介质乙酰胆碱的水解反应，产生乙酸和胆碱，终止突触传导。
其功能在于调节乙酰胆碱作用。
神经毒气，例如有机磷沙林（Sarin），抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经肌肉瘫痪，最终发生窒息（asphyxiation）。
血清乙酰胆碱酯酶浓度显著降低与有机磷杀虫剂中毒有关，因此血液检测是环境污染的重要指标。
基于人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide），在抑制剂存在与否的情况下，通过乙酰胆碱酯酶的作用，水解产生乙酸和硫代胆碱（thiocholine），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析乙酰胆碱酯酶抑制剂的效应。
乙酰胆碱酯酶反应系统为：Acetylcholinesteraseacetylthiocholine iodide →acetate + thiocholineinhibitorDTNB + thiocholine →TNB + choline-S-S-TNB产品内容缓冲液（Reagent A）20毫升反应液（Reagent B）2毫升底物液（Reagent C）2毫升阴性液（Reagent D）1毫升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照；有效保证6月用户自备乙酰胆碱酯酶：用于抑制剂筛选1.5毫升离心管：用于样品操作的容器比色皿或96孔板：用于比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、测定准备1．准备好待测样品，置于冰槽里备用2．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零3．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照4．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度二、抑制剂筛选1．在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品2．按下表加入试剂，进行样品预处理3．分别移取130微升缓冲液（Reagent A）到新的96孔板的所有孔里4．分别加入25微升反应液（Reagent B）5．分别加入25微升底物液（Reagent C）6．轻轻摇动96孔板7．在37℃温度下孵育3分钟8．加入20微升上述预处理的待测样品9．即刻放进37℃酶标仪检测：测读15分钟10．（选择步骤）完全酶活计算：[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.20（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔硫代胆碱/分钟11．抑制活性计算：1)[（完全活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（完全活性读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率2)IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50％3）直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为已知抑制剂浓度注意事项1．本产品为20次操作2．操作时，须戴手套3．样品须澄清，至关重要4．加样后3秒内比色测定5．测定值由低到高变化；测定可持续15分钟6．用户根据实际需求，可以调整纯酶的浓度7．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度8．可以使用乙酰胆碱酯酶抑制剂（1,5-bis(4-allyldimethylammoniumphenyl)pentan-3-one dibromide；BW284c51；IC50=30纳摩尔）作为抑制剂对照9．乙酰胆碱酯酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够生成1微摩尔硫代胆碱所需的酶量作为一个活性单位10．本公司提供系列乙酰胆碱酯酶检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。
乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)活性测定试剂盒使用说明
乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）活性测定试剂盒使用说明分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC2020规格：50管/48样产品内容：提取液：液体×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入2.6mL试剂一，充分震荡溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入2.6mL试剂一，充分震荡溶解。
产品说明：AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。
AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。
AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412nm吸光度增加速率，计算AchE活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，8000g4℃离心10min，取上清液待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
二、测定操作：1.分光光度计预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。
2.试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3.空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL蒸馏水、800μL试剂一、50μL试剂二和50μL试剂三，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性测定方法主要有以下几种常用的方法：
1. 利用酶促反应产生的色素变化测定：
(1) 比色法：将胆碱酯酶底物乙酰胆碱与碱性溴化镉等试剂反应，生成黄色产物，利用比色计或分光光度计测定产物的吸光度，间接测定胆碱酯酶活性。
(2) 荧光法：将胆碱酯酶底物与荧光染料反应，使底物和产物之间发生荧光变化，利用荧光光谱仪测定荧光强度，间接测定胆碱酯酶活性。
2. 利用电化学方法测定：常用的是反应器中使用碳电极或银电极，利用底物和产物之间的电位差变化测定胆碱酯酶活性。
3. 利用放射性同位素标记测定：将底物或产物标记上放射性同位素，通过测定放射性同位素的放射性强度，间接测定胆碱酯酶活性。
4. 利用质谱法测定：将底物和产物分离并通过质谱仪测定其质荷比，间接测定胆碱酯酶活性。
需要注意的是，不同的测定方法适用于不同的实验目的和样本类型，具体的选择应根据实验需求和设备条件来确定。
乙酰胆碱酯酶酶活测定胆碱酯酶的测定
乙酰胆碱酯酶酶活测定
胆碱酯酶的测定
胆碱酯酶（CHE）的测定
一、原理：血清及组织中CHE使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，未被水解的剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁离子在酸性溶液中形成棕色复合物，根据颜色深浅推算出酶的活力。
二、试剂：
1、试剂一：溶液60ml×1瓶，室温保存。
2、试剂二：乙酰胆碱粉剂×1支，-20℃保存，稀释液5ml×1瓶，4℃保存。
80μmol/ml 乙酰胆碱底物贮备液的配制：将一支乙酰胆碱碱粉剂倒入5ml稀释液中即成，4℃。
8μmol/ml乙酰胆碱应用液的配制：贮备液：试剂=1：9稀释。
3、试剂三：甲粉剂×1支；乙液30ml×1瓶；丙液30ml×1瓶；室温保存。
试剂三应用液的配制：每次测试前将甲粉倒入乙液中，充分摇匀，根据需要量将甲乙混合液
与丙液等量混合，充分混匀，配成试剂三应用液，现用现配。
4、试剂四：溶液30ml×1瓶，室温保存。
5、试剂五：溶液20ml×1瓶，室温保存。
6、试剂六：粉剂×1瓶，稀释液30ml×1瓶，测试前将稀释液倒入粉剂中，充分混匀，避光
4℃冷藏。
测各管吸光度值。
四、计算：
1、定义：血清中CHE的计算：每毫升血清在37℃和底物作用20分钟，分解1μmol乙酰胆
碱为1个活力单位。
2、计算公式：
血清中CHE活力。
实验二 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0K t 吸光度A实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。
由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。
对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。
长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。
一、 实验目的1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。
二、 实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。
以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。
根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。
当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：%10000⨯-=K K K Y tK 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜率值其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。
乙酰胆碱酯酶 国标方法
乙酰胆碱酯酶国标方法【原创实用版3篇】目录（篇1）I.乙酰胆碱酯酶国标方法的概念和作用II.乙酰胆碱酯酶国标方法的主要步骤和注意事项III.乙酰胆碱酯酶国标方法的应用和优势IV.乙酰胆碱酯酶国标方法的改进和发展正文（篇1）一、乙酰胆碱酯酶国标方法的概念和作用乙酰胆碱酯酶国标方法是一种用于测定乙酰胆碱酯酶活性的标准方法。
该方法被广泛应用于生物制药、临床诊断、环境监测等领域，是评估乙酰胆碱酯酶质量、纯度和活性的重要手段。
二、乙酰胆碱酯酶国标方法的主要步骤和注意事项1.样品处理：准确称取一定量的乙酰胆碱酯酶样品，加入缓冲液和稳定剂，充分溶解。
2.酶活力测定：将溶解后的样品加入反应体系中，测定其反应速度和酶活力。
3.数据处理：根据实验数据计算出样品中的乙酰胆碱酯酶活性。
4.注意事项：实验过程中需严格控制温度、时间、pH等条件，以保证实验结果的准确性。
三、乙酰胆碱酯酶国标方法的应用和优势1.应用广泛：乙酰胆碱酯酶国标方法可用于生物制药、临床诊断、环境监测等领域。
2.操作简便：实验步骤简单，易于操作，结果准确可靠。
3.优势明显：该方法具有较高的灵敏度和选择性，能够快速测定乙酰胆碱酯酶的活性。
四、乙酰胆碱酯酶国标方法的改进和发展1.改进实验条件：通过优化实验条件，提高实验结果的准确性和稳定性。
目录（篇2）第一部分：介绍乙酰胆碱酯酶国标方法是一种用于检测人体内乙酰胆碱酯酶含量的方法。
该方法采用酶联免疫法，通过特异性地检测乙酰胆碱酯酶的活性来评估人体内乙酰胆碱酯酶的含量。
第二部分：原理乙酰胆碱酯酶国标方法基于乙酰胆碱酯酶的生物学特性。
乙酰胆碱酯酶是一种能够水解乙酰胆碱的酶，因此可以通过检测其活性来评估人体内乙酰胆碱酯酶的含量。
第三部分：步骤乙酰胆碱酯酶国标方法包括以下步骤：1.准备试剂和样本；2.加入特异性抗体和酶标抗体；3.洗涤样本；4.显色反应；5.读取结果。
第四部分：优势和不足乙酰胆碱酯酶国标方法具有以下优势：1.准确性高；2.操作简便；3.检测速度快。
检测ld活性的方法是
检测ld活性的方法是
使用某种实验方法或技术来评估某个化合物或物质对乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，简称AChE）的影响。
乙酰胆碱酯酶是一种重要的酶，负责降解神经递质乙酰胆碱，而某些化合物或物质的抑制作用可能会干扰这个过程。
以下是一些常见的检测AChE活性的方法：
1. 酶活性测定：通过测量AChE对特定底物的催化活性，如对乙酰胆碱的水解速率来评估其活性。
该方法可以使用分光光度计或荧光光度计进行测定。
2. 电化学法：通过测量AChE催化反应释放电子的电流变化来评估其活性。
常用的电化学方法包括循环伏安法和恒电位法。
3. 放射性测定：使用放射性示踪技术，例如使用放射性标记的底物进行测定，以评估AChE活性。
4. 光谱法：通过测量AChE与某些试剂或底物结合后的光谱变化，如荧光法、紫外光吸收光谱法等来评估其活性。
5. 分子生物学方法：利用分子生物学技术检测AChE的基因表达水平或蛋白质水平，如实时定量PCR、Western blot等方法。
需要根据具体实验要求和研究对象的特点选择合适的方法来检测AChE活性。
乙酰胆碱酯酶实验方案
大豆肽乙酰胆碱酯酶抑制活性实验乙酰胆碱酯酶（AchE）是老年痴呆疾病阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease,AD）的一个酶抑制剂作用靶点。
乙酰胆碱酯酶浓度过高，催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱过度的缺失，直接造成神经信号传递失败，引起老年痴呆症。
在以往的研究中，已经被证明发酵豆腐乳中具有ACHE的抑制活性，大豆异黄酮（染料木素、山奈酚、大豆素）也具有抑制活性，但是大豆蛋白不具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。
本次实验旨在检测大豆肽中是否具有乙酰胆碱酯酶抑制活性肽，如果具有，则可证明大豆肽具有保护大脑神经记忆的作用，同时也可以进行接下来的实验，利用层析分离大豆肽，找出具有活性的具体肽，鉴定其结构，人工合成此肽，检验活性。
1实验原理根据Ellman的方法，底物碘代硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成在405nm处有光吸收的黄色物质，在酶催反应的稳态阶段其OD值即可代表起始反应速率。
O+AchE→Acetyrate+ThiocholineAcetylthiocholine+H2Thiocholine+5’5’-thiobis-2-nitrobenzoic acid→5-thio-2-nitrobenzoic acid2实验材料与仪器2.1实验材料磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成0.1M的PBS磷酸缓冲液。
乙酰胆碱酯酶(AchE)：冻干粉溶于PBS中，配成4.3U/ml溶液。
DTNB：溶于PBS中，配成756uM的溶液。
碘代硫代乙酰胆碱(ATch)：溶于PBS中，配成0.3mM的溶液。
2.2实验仪器酶标仪、96孔板3实验步骤3.1实验样品阴性对照组、阳性对照组、产品对照组、大豆肽原液、0~1000u、1000~3000u、3000~10000和10000~30000共八组，每组做五组平行实验取平均值。
鲤鱼脑中乙酰胆碱酯酶活性的测定
鲤鱼脑中乙酰胆碱酯酶活性的测定
三、实验材料与方法 1.材料： 鲤鱼、氯化乙酰胆碱标准溶液，FeCl3溶液， 1:2盐酸溶 1、制备乙酰胆碱吸光值标准曲线 分别取乙酰胆碱使用标准液 0.0ml,0.2ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml，于试管中，然后用磷酸 缓冲液（PH＝7.2）添加到2ml，摇匀，各加碱性羟胺 4ml（临用前20min将盐酸羟胺与等 体积的3.5mol/L氢氧 化钠混合即成）振摇3min后再加1：盐酸溶液2ml，振摇 1min后，最后 加2ml三氯化铁，摇匀后待测（空白管中 先加1：2盐酸摇匀，然后再加碱性羟胺）。10min后分 别将溶液移入比色皿中，并在525nm波长下测定各管的 吸光值，以空白对照液调零。以吸光值为纵坐标，以乙 酰胆碱浓度为横坐标给出标准曲线。
2.样品分析 （1）称取0.02g鱼脑组织，放入已冰浴预冷的匀浆器中，然 后加入10ml磷酸缓冲液（PH＝7.2）于匀浆器中，使每毫升 鱼脑匀浆液中含鱼脑组织2mg. （2）取一支试管，加入1ml乙酰胆碱使用标准溶液，再加入 1ml鱼脑组织匀浆液，然后放入370C恒温水浴槽中,温育20min. （3）取出试管并立即分别加入4ml碱性羟胺，充分振摇1min 后再分别加入2ml 1：2盐酸，充分振摇。最后再分别加入 2ml三氯化铁，再次充分振摇，然后用快速滤纸过滤（除去 蛋白质及杂质） （4）将滤液移入比色皿中，在525nm波长下测定吸光值，仍 以试剂空白调零。
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乙酰胆碱酯酶酶活的测试
作者：陈志坚
1 准备工作
0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。
2 酶液制备
SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。
将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。
然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。
将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。
3 酶活性抑制测试
3.1 配药液
参照脲酶实验
3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱
0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH
3.3 酶活测试
在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。
这是未加药酶活力为E1。
在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
计算出此时酶活，为E2。
抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100%
得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。