酶促反应动力学实验(精.选)

酶动力学综合实验

实验（一）——碱性磷酸酶值的测定

【目的要求】

1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响

2.了解米氏方程、值的物理意义及双倒数作图求值的方法。【实验原理】

1、碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。

2、米氏方程：

在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：

(1)

式中：v表示酶促反应速度，

表示酶促反应最大速度，

[S]表示底物浓度，

表示米氏常数。

3、值的测定主要采用图解法，有以下四种：

①双曲线作图法（图1-1，a）

根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。

②作图法双倒数作图法（图1-1，b）

实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为方程式：

(2)

以对作图，即为形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—。

③作图法（略）

把（2）式等号两边乘以，得：

(3)

以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。

④作图法（略）

把（2）式等号两边乘以[S],得：

(4)

以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为。

（a）(b)

本实验主要以双倒数法，即作图法来测定碱性磷酸酶值。具体原理如下：

本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（10.0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：

然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按作图法来测定碱性磷酸酶值。

【仪器与试剂】

仪器：

1.恒温水浴

2.721型分光光度计

试剂：

1．酚试剂：称钨酸钠（W·2O）100g，钼酸钠（·2O）25g置1500磨口回流装置内，加蒸馏水700，85%磷酸50和浓硫酸100。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（4）150g，蒸馏水50及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15，以除去多余的溴。冷却后定容至1000，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，

恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。

2．2.5磷酸苯二钠基质液：称取625磷酸苯二钠（C6H542•2H2O），溶于1,000容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。

3．碱性缓冲液（10.0）：称取无水碳酸钠 6.36g及碳酸氢钠

3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000.

4．碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1,加水3~4，冰箱内可保存五周左右。

【实验步骤】

取6支试管按下表加入试剂：

以6管为调零点，在620波长处比色。

【结果处理】

1 将各管光密度和底物浓度记入下表

2以1为纵坐标，1/[s]为横坐标，按作图，求出碱性磷酸酶的值。

【注意事项】

1）加入碱性磷酸酶的量要准确

2）保温时间要准确

准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液,直至加完，到准确13分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管准确保温13分钟。

【思考题】

1）的意义及其影响因子

2）为什么酶促反应速度以初速度表示

3）为什么可直接代替V作图

4）分析自己的实验数据

实验（二）——温度对酶活性的影响

【实验目的】

了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

【实验原理】

每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。

【仪器与试剂】

仪器：

1．冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架

4．吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管

7．烧杯

试剂：

1．6.8的缓冲液：量取15.45的0.2M磷酸氢二钠和4.55的柠檬酸混合摇匀即可。

2．0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100蒸馏水（需加热）。

3．0．03175碘液

4．1M 溶液 5.1M 溶液 6.稀释100倍的唾液 7.冰水浴

【实验步骤】

1．制管和预温

由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标记为A管和B管，同时欲温底物与酶。A管加入6.8的缓冲液和0.5%淀粉液；B管使用移液枪加入稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温5。

取12支洁净试管，参照下表加入试剂：

*6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替

2．混合A、B管

将1号A管试剂迅速加入温度对应的B管中(为了最大限度保证酶的量)，此时为计时的起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度继续水浴。注意：转移A管试剂前需将其摇匀。

3．时间控制

然后每隔1或2（时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6号的A、B管混合，严格控制好时间。

4．中止反应