实验10 细菌计数

实验10 细菌计数

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一、显微镜直接计数法

【原理】

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌板)，于显微镜下直接计数细菌的一种简便、快速、直观的方法。该法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，目前国内外常用的计菌板有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌板以及Hawksley计菌板等，血球计数板适用于菌体较大的酵母菌或霉菌孢子的计数，后两种计菌板适用于一般细菌的计数。这几种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜。这里介绍血球计数板方法计数酵母菌数量。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是一个大方格分为16个中方格(四角的四个大方格)，每个中方格又分25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格(中央的一个大方格)，而每个中方格又分成16个小方格，即计数区都由400个小方格组成(图1-3-12)。

图1-3-12 血细胞计数板构造

计数区（一个大方格）边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞的数量。

已知：1ml体积＝10mm×10mm×10mm＝1000mm3

所以：1ml体积应含有小方格数为1000mm3／(1／4000mm3)＝4×106个小方格。

因此：每ml菌悬液中含有细胞数

＝4×106×每个小格中细胞平均数×菌液稀释倍数。

＝5×104×5个中格中细菌数×菌液稀释倍数（25个中方格）

＝4×104×4个中格中细菌数×菌液稀释倍数（16个中方格）

【试剂与器材】

1．菌种酵母菌。

2．器材显微镜、血球计数板、盖玻片(22mm×22mm)、吸水纸、无菌毛细滴管、擦镜纸、生理盐水等。

【操作步骤】

1．制备菌悬液视待测菌液浓度，加无菌生理盐水适量稀释(斜面一般稀释到10-2)，以每小格的菌数可数为度。

2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。

4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下观察到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应适当关小孔径光栅并减弱光照的强度。

5．计数时若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格(即100小格)的菌数。如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央1个中方格的菌数(即80个小格)。如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2~3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，按公式计算出每ml菌悬液所含酵母菌细胞数量。

7．测数完毕，取下盖玻片，洗净计数板后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

【计算】

每ml菌悬液中含有细胞数

＝每个小格中细胞平均数×4×106×菌液稀释倍数。

＝5个中格中细菌数×5×104×菌液稀释倍数（25个中方格）

＝4个中格中细菌数×4×104×菌液稀释倍数（16个中方格）

【注意事项】

1．向计数板中加样时，应摇匀菌液，计数室内不可有气泡。

2．不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。

3．显微镜的光线强弱应调节适当，以免光线偏向一侧，而看不清计数板上的横竖线。

4．计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板，不可用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。

5．若计数的是病原性细菌，需经50g/L的石炭酸溶液浸泡后，再进行清洗。

【评价】

显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点是所测得的结果不能区分细菌的死活。但可以结合活菌染色等方法计数活菌。

二、平板培养计数法

【原理】

平板培养计数是根据微生物在高度稀释条件下，其在固体培养基上所形成的单个菌落是由一个细菌繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个细菌。计数时，首先将待测样品进行系列稀释，尽量使样品中的细菌分散开，使成单个存在(否则一个菌落就不只代表一个细菌)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由一个细菌生长繁殖形成单个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的菌数。

【试剂与器材】

1．样品尿液或水样。

2．培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

3．器材无菌生理盐水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。

【操作步骤】

1．样品稀释液的制备准确称取待测样品10ml，放入装有90ml无菌生理盐水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使细菌分散，静置20S～30S，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌生理盐水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释