RealtimePCR(从原理到实验方法及数据分析)
RealtimePCR原理及其定量方法
定量PCR技术： 通过对PCR扩增反应中每一 个循环产物荧光信号的实 时检测从而实现对起始模 板定量及定性的分析
2、荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线、阈值、CT值
plateau phase Liner phase
Exponential phase
Normalised reporter Fluorescence （Rn)
另一种思路
由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成 正比，所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量，同时考虑 荧光本底值，则：
Rn= RB+ X0(1+ Ex) Rs
总荧光信号强度=本底信号+分子数量×单位信号强度
Rn：第n个循环时的总信号 RB：本底 RS：单位信号强度 X0：起始DNA数目 Ex：PCR扩增效率
线性关系、扩增效率确认
相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率: -3 到 -3.5 PCR扩增效率（Ex）: 0.9到1.2
扩增效率
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
扩增效率理论值为1，即每增加一个循环PCR产物加倍。
实时荧光定量PCR原理和定量方法 一、荧光定量PCR的原理
在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号累积 实现了实时监测整个PCR进程， 对起始模板进行定量分析的 方法。
三个关键词： 实时，定量，荧光
1、定量与常规PCR的差别
常规PCR技术： 对 PCR 扩 增 反 应 的 终产物进行定量及 定性分析
非理想的PCR反应：
Xn＝X0 ×（1＋Ex）n
n：扩增循环数 X0：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量 Ex：PCR扩增效率
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
实时定量PCR技术(real-time PCR)
样品重复
重复次数请遵循统计学的要求 小样本统计，n>6（n>3） 未知样品和标准品都要重复 所有复管在同样条件下完成PCR
2.2 技术方法及数据
绝对定量与相对定量
绝对定量：绝对标准曲线法
标准品拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释 倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓 度/样本分子量×6×1014
扩增效率 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为： 扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指 数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产 物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2， 就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32， 斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。 如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%， 表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。
TaqMan探针
TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸 收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可 以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长 （低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振 能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放 的荧光被屏蔽。
PCR效率对定量结果的影响
Real time PCR操作步骤：从采样到数据处理
Real time PCR操作步骤：从采样到数据处理1.采样：1.1采样前的准备：DEPC水，灭菌手术刀剪，75% 酒精，2 mL无RNA酶离心管，2个盛有DEPC水的烧杯，一个用于冲洗样品，一个用于放置手术刀剪，以减少外界污染。
1.2采样过程中的注意事项：采样人员需带好口罩和手套，并且尽量少讲话。
当鸡放血致死后，立即解剖，并优先取RNA试验用样品。
取样量约100 mg左右（根据RNA提取方法不同可改变取样量），尽量保证每管取样大小和部位接近一致（可事先取些样品，有个大概的标准即可）。
RNA样品采集于离心管中，立即投入液氮（或者RNA保存液中）冻存，最后统一转入-70 ℃冰箱。
根据实验条件选择RNA样品的保存方式，优先选择液氮保存。
建议:如果直接投入液氮保存，离心管盖子要盖严，以免液氮渗入管中，导致离心管在转入-70 ℃冰箱时管盖崩开使样品损失。
2.总RNA提取提取组织和细胞总RNA推荐使用Trizol法。
2.1 Trizol提取总RNA的操作步骤以下操作需在超净台中进行，超净台使用前需用75% 酒精擦拭台面，紫外灯照射半小时后，打开风机排除臭氧，减少对实验人员的伤害。
此外，要提前制冰备用。
1)每50-100 mg样品加1 ml Trizol，使用高通量研磨仪研磨30 s。
2)研磨后样品放置5 min，4 ℃12 000 g离心10 min，上清液转移到另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。
3)加入200 µL氯仿，用力摇晃15 s，室温放置5 min。
4) 4 ℃ 12 000 g离心15 min，上清液转移至另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。
5)加入500 µL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min，沉淀RNA。
6) 4 ℃ 12 000g离心10 min，弃上清。
7)加入1 ml 75% 乙醇（DEPC水配制），用移液器反复吸打乙醇，洗涤RNA沉淀。
Real-timePCR实验原理与技术
实时荧光定量PCR技术原理
01
在实时荧光定量PCR反应中， DNA模板被扩增时，与荧光探 针结合，产生荧光信号。
02
随着DNA的扩增，荧光信号逐 渐增强，通过对荧光信号的实 时监测和分析，可以计算出 DNA的起始浓度。
03
通过标准曲线或内参基因的校 准，可以将起始浓度转化为目 标基因的表达量或基因拷贝数 。
实时监测荧光信号
实时监测荧光信号，确保PCR产物在指数扩增阶段被检测到。
标准化实验流程
建立标准化实验流程，确保实验结果的可靠性和可重复性。
未来展望
新技术应用
01
随着新技术的不断发展，如数字PCR、微流控PCR等，Real-
time PCR技术将得到进一步优化。
高通量检测
02
通过多重PCR和高通量检测平台，实现大规模样本的快速检测。
03
Real-time PCR 实验数 据分析
数据收集与整理
数据收集
在实时PCR实验中，数据收集通常涉 及记录每个循环的荧光信号强度。这 些数据通常以图表形式表示，其中横 轴表示循环数，纵轴表示荧光信号强 度。
数据整理
收集到的原始数据需要经过整理，包 括去噪、去除异常值和标准化等步骤， 以确保数据分析的准确性。
自动化与智能化
03
实现Real-time PCR的自动化和智能化，提高实验效率，减少人
为误差。
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real-timepcr实验原 理与技术
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目录
• Real-time PCR 实验原理 • Real-time PCR 实验技术 • Real-time PCR 实验数据分析 • Real-time PCR 实验应用 • Real-time PCR 实验注意事项与优化建
Realtime PCR实验原理与技术 ppt课件
qRT-PCR技术实验操作（优化）
标准品的选择： 理论上可以以目的基因的PCR扩增产物为标准品， 但是存在降解、污染等因素影响定量结果。
论坛网友给出了几种解决方法： ① 另设计一对引物用于荧光PCR； ② 将扩增序列插入T载体后作为标准品； ③ 设计一对外围引物扩增PCR,将产物连入T载体(①+②)
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术荧光标记方法的 分类
1. 非特异性的DNA结合染料法：荧光染料能非特异结合DNA
双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。
常用染料：Pico Green （灵敏度高,>=25pg/mL） SYBR I
缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。 措施：设计特异性引物，优化PCR反应条件。
定量分析？
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术原理
a) Ct值(Cycle Threshold;每个反应管中荧光强度达到阈 值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关 系。
b) 以不同稀释倍数的已知模板制备标准曲线。 c) 实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知
样本的初始拷贝数。（定量分析）
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术实验操作（优 化）
有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即 将温度提高后再检测反应体系中的荧光。该检测温度 大于引物二聚体的退火温度 Tm，而小于特异性扩增 产物的 Tm值。在此温度下，引物二聚体都变性成单 链，因此只检测到与特异性 PCR 产物结合的 SYBR Green I 所发出的荧光，消除了引物二聚体的干扰，降 低了非特异性荧光，有助于目标基因的准确定量。
Real-time_PCR(从原理到实验方法及数据分析)
•
绝对定量：从荧光到拷贝数
The well contains 400 target copies
Y= mx+b
Ct values
0
Ct‘s
1
2
3
4
5
6
7
Log copy number
相对定量：参照因子 Calibrator
用以比较结果的基准
time t =0 t=12 t=24 t=48
total RNA total RNA
t=0 t=1h
2.0 1 0.1
t=6h t = 24 h
相对定量研究软件
• • • 同时分析多达10块反应板的基因表达数据 – 多至960个数据点的单击分析 – 数据直观 通过ΔΔCT (比较 Ct)法完全自动分析数据 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出
终点检测 终点检测
等位基因分型 等位基因分型 阴性阳性鉴定 阴性阳性鉴定
Workflow
mirVana™ miRNA Isolation Kit
TaqMan® MicroRNA RT kit TaqMan® MicroRNA Assays
TaqMan® Universal Master Mix,No UNG
Five Fully Integrated Systems for Real-Time PCR
•
•
正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测
基因分型检测
FAM VIC Homozygote for FAM-specific allele
VIC FAM Homozygote for VIC-specific allele
FAM VIC
Heterozygote for both alleles
Real-time_PCR_原理(非常经典的PCR文档)
Real-time PCR 原理介绍实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
Real-time PCR数据分析
由于Real-time qPCR 的众多优点，现在已是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR 的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，不少没有做过real-time qPCR 的研究者往往感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR 的发展史说起，包括real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR 发展史Real-time qPCR 就是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。
由于在PCR 扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开辟，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量PCR 仪的发展起了至关重要的作用。
1995 年，美国PE 公司(已经并入Invitrogen 公司)成功研制了Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每一个循环的荧光强度，通过Ct 值进行数据分析。
从而荧光定量PCR 获得广泛应用。
现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM 系列；BIO-RAD 的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@ 系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER 的LineGene 系列。
Realtime PCR检测原理和问题处理
实例1：没有标准曲线
标准品没有填写相应的数值
实例2：没有扩增曲线
原因1：PCR参数设置错误 −数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。
实例2：没有扩增曲线
原因2：硬盘休眠，数据采集中断
实从原例始数3据：找基原因线下滑
−1-9循环，ROX的信号下降
−基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定； FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线；
一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因 要保证信号之间互不干扰
常用的荧光染料
Dye
FAM SGI TET VIC JOE HEX CY3 TAMRA ROX Texas Red CY5
Excitation Maxima (nm)
495 497 521 530 526 540 552 552 585 595 643
Taqman原理
Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为 基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标 记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完 整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切 降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而 荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号 的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。
3、Threshold Cycle (CT值)
4、[DNA]0 (初始模板)
Threshold Cycle (CT值)
Threshold (阈值)
[DNA]0 (初始模板)
基线
反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为 3-15 cycles的信号值
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
广西临床检验中心
对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
广西临床检验中心
数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
广西临床检验中心
标准曲线分析
斜率、截距、相关性
广西临床检验中心
数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
广西临床检验中心
TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
Real Time PCR
相对定量
2 1
内参基因
1 2
目的基因
内参基因
内参基因：qRT-PCR时，每个标本都要做对应的内参 ，而且每次都是管家基因，一般用β -actin，有时也用 GAPDH。
管家基因：又称持家基因(house-keeping geቤተ መጻሕፍቲ ባይዱes)， 生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命
活动所必需的蛋白质。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因 与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而 时刻都在表达的基因。
光信号强度急剧下降，此时的温度即溶解温度（Tm 值），Tm值与PCR扩增产物的序列有关，对于某一 PCR扩增产物，其值是固定的。
单一峰，无非特异性产物，定量准确
出现杂峰，存在非特异性扩增，定量不准确
荧光定量PCR的解析方法
绝对定量
样本中的核酸量（拷贝数，微克）
相对定量
不同样本中目的基因表达量的差异
数据处理（ΔΔ Ct法）
步骤一：内参基因均一化样本差异 Ct（目的基因）-Ct（内参基因）=Δ Ct 步骤二：其他和对照样本比较 Δ Ct（目的基因）-Δ Ct（内参基因）=ΔΔ Ct 步骤三：使用公式计算 倍数变化=2-ΔΔCt
Gene Expression
常 见 问 题
问题一：无Ct值出现 1、反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验 情况增加循环，但高于 45 个循环会增加过多的背景信号； 2、检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72℃延伸时采集荧光； 3、引物或降解：可通过PAGE电泳检测其完整性； 4、模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度 做起。
产物的实时检测成为可能。
扩增曲线：用来描述PCR动态进程的曲线。
Real-TimePCR：从原理到步骤详解、再到终极数据分析
Real-TimePCR：从原理到步骤详解、再到终极数据分析作者：解螺旋·猫大如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语小伙伴们，今天我们来解析一下Real-Time PCR，从原理到步骤详解再到数据分析，一个都不能少！在正式开讲之前呢，猫大必须要安利一个网址：/primerbank/ 。
对，这就是著名的哈佛引物库！目前 PrimerBank 收录了超过 306,800 对 Real-Time PCR 引物，涵盖了大部分人类和小鼠基因。
小伙伴们可以用GenBank Accession，NCBI protein Accession，NCBI Gene ID，Gene Symbol，PrimerBank ID 或者关键词去库里搜索引物。
而且还整合了blast 功能，可以拿目的基因序列去 primerbank 的数据库里进行blast。
据说其中收录的26,855 对小鼠引物经过Real Time PCR 验证后，其中22,187 对引物是可用的，成功率有82.6%但是猫大建议小伙伴们，在库里搜索到引物之后呢，别忘了用 oligo 6 评价一下引物，多练习一下 oligo 6 的使用也是很好的嘛。
好，下面开讲 Real-Time PCR，我们就从 Real-Time PCR 的发展史说起，包括Real-Time PCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解Real-Time PCR 。
由于内容比较多，这五个部分会分成 3 讲。
首先是 Real-Time PCR 的原理，实验设计和实际操作。
Real-Time PCR 发展史Real-Time PCR 的技术的发展是伴随着 Real-Time PCR 仪的研制。
1995 年，美国ABI 公司（已经并入Invitrogen 公司）成功研制了Taqman 技术，并推出了首台荧光定量PCR 检测系统7700，通过检测每个循环的荧光强度对PCR 进程进行实时检测。
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SYBR Green I作用机理
数量关系
1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2. 染料一结合，就产生荧光信号 3. 信号强度与DNA分子总数目成正比
TaqMan探针的FRET
E
TaqMan® Probe R
E
Q
E
R
E
Q
TaqMan作用机理
数量关系
上游引物
3’ 5’
3’ 5’
线性图谱
对数图谱
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
什么是阈值？
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
实实时时PPCCRR分分析析
绝绝对对定定量量
相相对对定定量量
根据标准曲线 提供数量测量
提供精确的起始材料 相对数量差异
绝对定量与相对定量的定义
• 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常 所说的拷贝数。
• 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序 列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一 个时程研究中处于零时的样本。
T=24hr
IL-2 18S ΔCt 24 9 15 24 10 14 23 11 12
28 10 18
ΔΔCt 0 -1 -3
3
2-ΔΔCt 1.0 2.0 8.0
0.1
Relative Quantity of Expression
10
8.0
8
6
4
2.0
2
1
0.1
0
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
t=0 t=1h t=6h t = 24 h
相对定量研究软件
• 同时分析多达10块反应板的基因表达数据 – 多至960个数据点的单击分析 – 数据直观
• 通过ΔΔCT (比较 Ct)法完全自动分析数据 • 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出
终终点点检检测测
等等位位基基因因分分型型
阴阴性性阳阳性性鉴鉴定定
突变的存在形式
目标序列的有无
等位基因分型
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
什么是CT值？
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱
对数图谱
CT值
CT值
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
N = N0 x (1+e)n
N：产物分子数；N0：起始分子数 e： 扩增效率； n: 循环次数
PCR理论方程只在指数期成立
线性期
lg [DNA]
指数期 y = x(1+e)n
TaqMan 探针
R
Q
5’
3’
下游引物
R
Q
5’
3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针
2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号
3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
Real-time PCR 应用
• 绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
• 病原体检测 • 转基因食品检测 • 基因表达研究
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
线性图谱
扩增曲线：四个阶段
平台期
线性增长期 指数增长期 基线期
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
对数图谱
基线 阈值 Ct值
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
[DNA]0
cDNA cDNA
cDNA cDNA
相对定量：内对照 Endogenous Control
用以标准化样品操作
time
t =0
t=12
t=24
t=48
total RNA total RNA total RNA total RNA
cDNA cDNA
cDNA cDNA
T=0 (calibrator) T=1hr T=6hr
Real-time PCR
Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology
Real-time PCR 原理
数学原理 化学原理
Real-time PCR 应用
绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 microRNA
荧光定量PCR数学原理
循环数
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。
设n=CT，则：
RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs lg (RCT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT - RB) – lg Rs
CT
= − log X O log(1 + E X )
+
log(RT − RB ) − log RS log(1 + EX )
即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
CT值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始DNA]
成功的定量PCR
荧光定量PCR化学原理
• 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的 引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用 于检测某个核酸序列的变异。
• 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核 苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。
绝对定量：从荧光到拷贝数
The well contains 400 target copies
Y= mx+b
Ct‘s
Ct values
0
1
2
3
4
5
6
7
Log copy number
相对定量：参照因子 Calibrator
用以比较结果的基准
time
t =0
t=12
t=24
t=48
total RNA total RNA total RNA total RNA
• 相对定量(Relative Quantification，RQ)
• 基因在不同组织中的表达差异 • 药物疗效考核 • 耐药性研究
• 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD)
• 基因突变分析 • SNP研究 • 物种鉴定、菌株鉴定
• 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-)