生物显微技术介绍——冰冻切片
生物 电子显微镜 6.冷冻制样技术概述
劈裂面的特点：一般沿膜的不同深度、不同角度以及不同 层次断裂，大面积暴露出各种膜的表面结构。这时可 以观察到利用超薄切片及扫描方法难以观察到的膜层 结构。
3..膜片的命名： 通用命名法：
E膜—与细胞外间隙或细胞内间隙（包括核周间隙，线粒 体内、外膜之间的腔以及高尔基体、内质网、溶酶 体、吞饮泡的腔）相邻的一片，也叫做外片。
冷冻速度：大于7800℃/秒，形成的冰晶小于20nm。 温度：低于再结晶点（ -160 ℃），形成玻璃态固体； 细胞质的浓度：浓度高则结晶点到再结晶点的温差小，
不易冻伤细胞。
冷冻固定时，必须在瞬间将温度降至-160 ℃，使细胞内外同 时被冻结而形成玻璃态的冰，确保细胞生活时的状态。 3.细胞质的浓度与冷冻保护剂：
预冷 样品室
新鲜 样品
戊二醛 固定
保护剂 处理
冷冻 固定
冷冻干燥 或切片
2.方法：（1）液氮直接冷冻法：
小块样品用一滴保护剂粘在样品头上， 迅速投入液氮中冷冻固定。
（2）中间冷媒法：速率高
液氮预冷金属杯
液
杯内注入丙烷
氮
样品投入丙烷中冷冻
内含 丙烷
金 属 杯
第二节 冷冻干燥技术
一、概念：将新鲜的或经戊二醛固定的样品快速冷冻固定，然后 转移到真空容器中并保持低温条件，使样品中的固态 水直接升华，而达到脱水干燥的目的。
考试时间：5月15日（下周三）8：00~10：00 考试地点： 实验时间：
谢谢大家！
再见！
P膜—与细胞质、核质、或线粒体基质相邻的一片，叫胞质 片或内片。
E膜
细胞外
P膜
细胞内
冰冻切片技术各流程常用方法和试剂
冰冻切片技术各流程常用方法和试剂下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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冰冻切片简介
猪肉脂肪组织染色
三、实验材料、试剂与器材
1.材料：新鲜猪肉 2.试剂：70%酒精、
苏丹黑B染液、 甘油明胶等 3.器材： 冰冻切片机
冰冻切片机
冰冻切片步骤
1.取材 2.切片 3.染色
固定Leabharlann 冰冻切片样品处理1.非固定样品： 取样后用OTC包埋，在预冷的异戊醇中速冻后， 保存在超低温冰箱中:切片前复温，切片后固定
2. 固 定：组织块也可以固定于10%中性福尔马林。
3.切 片： (1) 利用切片机的厚度调节旋钮调节切片厚度，
调整切片角度，安装切片刀。 (2) 将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷
台上冷冻，在即将完成冷透前用热交换装置压平。 (3) 将样品放到样品头上，用样品快进按钮将样品移
近刀口，利用慢进按钮开始修片，修好后即可放 下防卷板切片，使切出的样品进入防卷板与刀片 的狭缝，取出后染色观察。
2.固定样品： 灌注固定+固定液浸泡 利用高渗溶液吸收组织分子： 将组织置于20% ——30%的蔗糖溶液中，置4摄 氏度冰箱足够时间，观察组织块，待其沉底 后，取出切片。
切片时，根据组织不同，合理选择箱体及切片头温度
四、实验的基本程序
1. 取 材：取新鲜的组织。（组织块可不加任何处理， 直接进行冰冻切片）。
一、实验目的
1.了解冰冻切片技术在细胞生物学研究中的应用。 2.掌握冰冻切片技术。
冰冻切片简介
❖ 冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度, 然后进行切片的一种方法。因其制作过程较石蜡切片相对简 便、快捷, 主要应用于手术中快速病理诊断。
❖ 快速冰冻切片主要用于下列几种情况： ①确定病变是否为肿瘤及恶性程度等； ②脂肪及类脂及部分蛋白质等物质染色；
冰冻切片详细说明解读
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
冷冻切片技术课件ppt
现代的冷冻切片技术已经实现了自 动化、数字化和标准化，为医学研 究和诊断提供了强有力的支持。
应用领域
临床病理诊断
冷冻切片技术可用于手术中的快 速病理诊断，帮助医生确定病变 的性质和范围，为手术方案提供
重要依据。
教学
冷冻切片技术可用于制作教学标 本，为医学生和病理医生提供直
观的学习材料。
科学研究
二氧化碳冷冻喷射固定设备。
03
冷冻固定设备的特点
冷冻固定设备具有操作简便、冷冻速度快、温度低等特点，能够有效地
保持组织或细胞的结构和成分不变。
切片机与刀片
切片机
切片机是用于将冷冻固定的组织或细胞样品进行切片的仪器。其工作原理是通过将组织或 细胞样品放置在切片机的工作台上，利用机械或激光等方式将样品切成薄片。
生物科学研究
利用冷冻切片技术进行细胞结构和功能的深入研 究。
药物研发
利用冷冻切片技术评估药物对细胞的作用机制。
发展前景展望
自动化与智能化
01
通过自动化与智能化技术的引入，降低冷冻切片制备的难度和
操作成本。
高分辨成像
02
发展高分辨成像技术，以获得更清晰、更深入的细胞结构和功
能信息。
跨学科，如生物工程、神经科学
将切片贴在载玻片上
将切好的切片贴在预处理的载玻片上，使其平整、无气泡。
干燥与固定
使切片在室温下干燥，并进行必要的固定处理，如用醛类化合物 进行醛化处理，以增强切片的稳定性。
染色与观察
染色
根据研究或诊断需求，选择适当 的染色方法对切片进行染色，如 H&E染色、免疫染色等。
观察
用显微镜观察染色后的切片，根 据需要调整焦距和光源强度，观 察并记录组织结构和细胞成分等 细节信息。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。
以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。
不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。
冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。
2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。
该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。
通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。
该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。
第三节冰冻切片介绍
第三节冰冻切片介绍冰冻切片术是一种常用的组织学技术，可以用于研究人体组织和动物组织的结构和功能。
它可以提供组织的横断面，便于观察不同结构的细胞和组织。
本文将介绍冰冻切片的原理、步骤和应用。
一、冰冻切片的原理冰冻切片是通过将组织固定在低温下进行切割，从而得到组织横切面的方法。
冷冻技术能够减少组织的变性和破坏，可以保留细胞和组织原有的形态和结构。
在常温下，组织中的脂质和蛋白质会被破坏，切片过程中也容易产生伤口和变形。
而低温冷冻可以减少这些问题的发生，使切片更加准确和可靠。
二、冰冻切片的步骤1.组织固定：将新鲜组织（或已加工处理的组织）固定在适当的固定液中，如4%的甲醛。
固定的时间根据组织的性质和要研究的问题而定，一般在几小时到几天之间。
2.组织置于冰箱中冷冻：将固定的组织置于冷冻器中进行冷冻，通常是在-20摄氏度以下。
冷冻的时间根据组织的大小和要研究的问题而定，约为几小时到一天。
3.制备冰冻切片：将冷冻的组织取出，放在切片机的架子上。
使用冰冷的刀片对组织进行切割，得到所需的冰冻切片。
切片的厚度根据组织的性质和要研究的问题而定。
4.切片上薄片：将冰冻切片绕在切片刀上，并用玻璃刀刮去多余的细胞和组织。
然后将切片放在玻璃片上，并以适当浓度的甘油溶液滴在切片上，使切片保持湿润。
5.染色和保存：根据需要将切片进行染色，使用常用的染色方法如血液染色、免疫染色等。
染色完成后，将切片放在一个干燥的玻璃片上，然后用封闭剂将切片封闭，以防止切片的变形和损坏。
最后，将切片保存在适当的环境中，避免阳光暴晒和湿气侵入。
三、冰冻切片的应用冰冻切片技术在医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
1.病理学研究：冰冻切片可以用于观察组织的病理变化，如细胞增生、坏死和变异等。
通过冰冻切片技术，可以更加准确地诊断和鉴定疾病。
2.免疫组化染色：冰冻切片可以进行免疫组织化学染色，用于检测和定位特定蛋白质的表达。
通过这种方法，可以研究细胞和组织中特定分子的分布和功能。
冰冻切片详细说明
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。
⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。
⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。
切片可保存于10%甲醛液中。
⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。
生物显微技术
生物显微技术实验设计（实验器具试剂等按照步骤中写）一．徒手切片的制作实验原理：徒手切片是用手直接握住小刀，把选取的材料切成适于用显微镜观察的薄片。
这种切片方法比较简便，有一把锋利的小刀在短时间内就可以完成。
新鲜材料不经固定液处理也能切片，有利于观察组织的生活状态及原有结构。
实验器具、材料：培养皿、切片刀、夹持物实验步骤：（一）取材选取待观察的植物材料，初步切取大约3cm长的小块，再依切片的具体要求，将组织块修整为边长为0.5cm的材料快。
（二）切片用左手拇指和食指夹住材料，中指顶托组织块的下端，以右手执刀片，刀口自左前方向右后方斜切。
切片时，刀片和材料上都应不时地蘸上水。
切下的薄片立即用毛笔蘸水后粘取移入盛有清水的培养皿内。
（三）选片切片完毕，在培养皿中选择薄而均匀且切面完整的组织切片，用小镊子把它移放在载玻片中央，滴一滴清水，盖上盖玻片，就可用显微镜进行观察。
二．石蜡切片的制作实验原理：用石蜡将处理的材料经浸透、包埋、切片，制成玻片标本的方法称为石蜡切片法。
实验器具、材料：固定液、染色剂、各级酒精、二甲苯、石蜡、梅式蛋白粘片剂、道林纸、单面保安切片、包埋台、烫板、旋转式切片机、刀片、毛笔实验步骤：（一）取材根据研究目的进行取材。
（二）固定材料取好后应立即进行固定（三）冲洗植物组织经固定后，必须用冲洗剂将组织、细胞中的固定液洗去，以利于染色或材料的保存。
（四）脱水脱水剂既要能溶于水，又要能与溶解石蜡的有机溶剂相容。
酒精为最常用的脱水剂。
一般按10％、20％、30％、50％、70％、85％、95％、100％酒精浓度依次脱水。
各级酒精脱水的时间，一般为1~4h。
（五）透明二甲苯为最常用的透明剂。
透明时，也是逐步增高透明剂的浓度，步骤如下：3/4无水酒精和1/4二甲苯混合液→1/2无水酒精和1/2二甲苯混合液→1/4无水酒精和3/4二甲苯混合液→纯二甲苯（2次）。
（六）渗蜡渗蜡时，可采用纸桥法。
在浸有材料的透明剂中，先放入折成弓形的纸条，再将削成极细的石蜡薄片，陆续地投入其中。
生物显微技术-第二章-其他常用制片方法和特殊染色方法
❖ 注意事项
❖ 玻片的清洗：新玻片常有游离碱质，因此应用清洗液 或10%盐酸浸泡24h，然后再彻底清洗。用过的玻片 可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸20min， 再用热水将肥皂和血膜洗去，用自来水反复冲洗,必 要时再置95%乙醇中浸泡1h，然后擦干或烤干备用。
❖ 缺点： ❖ 1、不容易做连续切片。 ❖ 2、切取的组织不能过大，组织过大不容易冻
结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 ❖ 3、不容易制作较薄的切片。 ❖ 4、组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而
影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并 且组织结构也不如石蜡切片清晰。
（四）主要应用
❖ 1、用于有些水解酶的定位的组织化学方法以 及免疫组织化学方法等。
主要部件： ①恒冷箱 ②样 品冷却系统 ③切片机 ④一 次性不锈钢刀片
LEICA CM1900型恒冷箱切片 机具有一个完全封闭式的恒 冷箱，工作时可24小时制冷， 使箱内温度常年保持在20℃的工作状态，并具有自 动除霜的功能。此外，它还 具有一个独立的样品冷却系 统，使生物样品被迅速冷冻， 达到一定硬度后，即可切片。 样品的前进与后退，由恒冷 箱外的电动按钮控制。
（一）冷冻切片的种类
半导体冰冻切片机
低温恒冷箱冰冻切片法
二氧化碳冰冻切片法
甲醇循环制冷冰冻切片法等
这些方法，随着时代的变迁，科技的发展， 许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷 箱冰冻切片法，正在受到青睐。
❖ （二）冷冻切片的制作方法
低温恒冷箱冷冻切片制作法 冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左 右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间 的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面 上的荧屏显示出来。
《冰冻切片法》课件
近年来，冰冻切片技术不断改进，如冷冻保护剂的选择、制冷剂的种类和切片刀 的材质等方面都有所突破，提高了制片质量和效率。同时，冰冻切片法与其他技 术如免疫荧光、原位杂交等结合使用，为科学研究提供了更多手段。
02
冰冻切片法的技术原理
冰冻切片的制作过程
01
02
03
样本准备
将待检测组织固定在冷冻 台上，用冷丙酮或包埋剂 进行冷冻。
细胞结构和超微结构。
冰冻切片法的缺点
技术要求高
冰冻切片技术要求高，需要熟练的操 作技巧和经验，才能获得高质量的切 片。
设备昂贵
冰冻切片机等设备较为昂贵，增加了 制片成本。
容易产生冰晶
在冷冻过程中，组织内部容易形成冰 晶，影响切片的清晰度。
制片质量不稳定
由于制片过程中涉及多个步骤，且每 个步骤都可能影响制片质量，因此制 片质量有时不太稳定。
切片制作
使用冷冻切片机将冷冻的 组织切成5-10微米厚的切 片。
贴片与固定
将切片贴在载玻片上，并 用丙酮固定。
冰冻切片的质量控制
切片厚度
确保切片厚度均匀，一般 在5-10微米之间。
组织完整性
确保组织结构完整，无破 碎或裂痕。
染色效果
染色效果应均匀，无沉淀 或悬浮物。
冰冻切片的染色方法
苏木精-伊红染色法
基因表达研究
03
通过冰冻切片技术，可以对组织中的基因表达进行快速检测和
分析，有助于研究基因功能和疾病机制。
在其他领域的应用
食品安全检测
冰冻切片技术可用于快速检测食品中的有害物质和微生物， 保障食品安全。
环
05
冰冻切片法的优缺点及展望
冰冻切片法的优点
生物显微技术介绍——冰冻切片
生物显微技术课程论文（2010——2011学年，第一学期）冰冻切片摘要：1.1冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度, 然后进行切片的一种方法。
因其制作过程较石蜡切片相对简便、快捷, 都应用于手术中快速病理诊断。
我科于1975 年开展术中冰冻切片检查, 1995 年采用快速恒冷式切片机(德国LE2ICACM1850) , 作冰冻切片1100 余例, 其中包括乳腺、肺、喉、甲状腺、淋巴结、消化道、泌尿道、卵巢、子宫、皮肤等组织。
结果显示, 切片顺利,制作效果满意, 为病理诊断提供了可靠的依据。
既免除了患者多次手术带来的巨大痛苦, 又节约了患者的住院费用, 深受广大临床医生及患者的欢迎及好评。
关键词：冰冻切片方法及注意事项冰冻切片机1 冰冻切片简介1.1冷冻切片的种类冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。
这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。
当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。
1.2冷冻切片的目的1.2.1在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。
1.2.2了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.3了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.4在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。
1.2.5显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。
1.2.6某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。
1.2.7神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。
1.2.8对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用环境要求：冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学研究、组织学以及免疫组织化学等领域中广泛应用。
它的作用是在保持组织的形态和结构的同时，为后续的研究提供高质量的样品。
下面是冰冻切片的步骤要求和作用的详细介绍。
步骤要求：1.样本选择：选择适合冰冻切片的样本，例如组织的大小适中且不易破裂的组织。
2.固定样本：使用适当的固定剂对样本进行固定，以保持组织的形态和结构。
3.处理样本：用缓冲液对样本进行洗涤处理，去除细胞液和外源性污染物。
4.冻结样本：将样本在低温条件下冻结，最常用的方法是使用液氮或酒精浴。
5.切片样本：使用切片机将冻结的样本切成薄片，通常为10-50微米的厚度。
6.挂片或贴片：将切片移至载玻片或切片笼中，并在玻片上做相应的标记。
作用：1.保持组织形态和结构：冰冻切片可以保持组织的天然形态和结构，避免固定和染色等过程对组织产生的变性和变形。
2.提供高质量的样品：因冰冻切片的快速切割过程，可以获得高质量、无伤害的组织样品，适合各种形态和形状的组织切片。
3.便于固定和染色：冰冻切片可以便于进一步固定和染色处理，以进行组织学、免疫组织化学等研究。
4.保存组织信息：冰冻切片可以有效保存组织的蛋白质、核酸和其他生物大分子的信息，保留了研究的全面性和综合性。
5.实时观察组织结构：冰冻切片可以随时进行观察和实时分析，不需要特殊的染色处理，有利于实验结果的快速获取。
总结：冰冻切片是一种常用且重要的实验技术，在生物学研究中发挥着重要的作用。
它的步骤要求和作用都与保持组织形态和结构、提供高质量样品、便于进一步处理和观察等方面密切相关。
通过冰冻切片技术，我们可以更好地理解和研究生物体内部的结构和功能，为生物学研究的进展提供有力支持。
冷冻切片方法及注意事项
冷冻切片方法及注意事项冷冻切片是一种常用的组织学研究方法，它能够帮助研究人员观察和分析生物组织的结构和功能。
下面将详细介绍冷冻切片的方法及注意事项。
1.组织采集：首先需要选择适当的生物组织样本，可通过手术切取、尸检或动物献体等方式获得。
2.组织处理：取出组织样本后，应立即进行处理，以防止样本脱水和坏死。
可将组织放入理化盐水或生理盐水中，避免干燥、坍塌或变形。
3.固定组织：使用适当的固定剂对组织进行固定，以保持组织结构的完整性。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛、乙醛等。
固定时间应根据组织大小和厚度进行调节，较小的组织可以固定2-4小时，而较大的组织可能需要24小时以上。
4.预冷冻：固定后的组织应在冷冻前进行预冷冻处理，以提高冷冻切片的质量。
预冷冻的方法包括放入冷冻剂中（如液氮、干冰等）或将其放入冰盒中进行冷藏，使组织完全冷却。
5.冷冻切片：使用冷冻切片机将预冷冻的组织切成薄片。
为了获得更好的切片结果，刀片的角度和厚度需要进行适当的调整。
同时，切制时需要快速而轻柔地移动切片机，以防止组织被拉伸或损坏。
6.切片收集：将切片收集在玻片上，通常使用细长形的切片夹或切片板来收集切片。
确保切片不受损并保持平整。
7.切片保存：将切片放入适当的保存溶液中，如PBS（磷酸盐缓冲液）或甘油等，以防止切片干燥和变形。
可以根据需要选择冷藏或冷冻保存。
冷冻切片需要注意以下事项：1.样本质量：选择新鲜、完整的组织样本，避免坏死、变性或损伤的组织。
2.固定剂选择：选择适当的固定剂进行组织固定，以保持组织结构的完整性。
3.冷冻速度：组织应尽快冷却，以避免组织脱水或破坏。
冷冻速度过慢可能会导致晶体形成，影响切片质量。
4.切片机状态：保持切片机的良好状态，定期检查刀片的锋利度和调整角度，以确保切片的质量。
5.切片技巧：需要轻柔、均匀地切片，避免组织被拉伸或扭曲。
同时，切片过程中需要快速操作，以减少冰晶对组织的破坏。
6.切片收集：收集切片时要避免切片叠加或悬浮，以免影响切片的观察和分析。
组织冰冻切片步骤
组织冰冻切片步骤冰冻切片是一种常见的实验技术，用于获取生物样品的细胞或组织的薄片，以便进行进一步的研究和分析。
下面将介绍组织冰冻切片的步骤。
1. 材料准备首先，准备好所需的材料，包括冷冻剂（如液氮或干冰）、组织样品、切片刀、切片刀床、切片刀片、切片缓冲液（如磷酸盐缓冲液）和载玻片。
2. 固定组织样品将待切割的组织样品用适当的方法进行固定，比如使用福尔马林或其他适合的固定剂。
固定的目的是保持组织的形态结构和细胞的染色质形态。
3. 冷冻组织样品将固定后的组织样品置于冷冻剂中，使其迅速冷冻。
常见的冷冻剂包括液氮和干冰，其温度低于零下80摄氏度。
冷冻过程应尽量迅速，以避免组织样品的结构和细胞的形态发生变化。
4. 制备切片刀床和刀片在切片刀床上放置适当大小的切片刀片，确保刀片干净锋利。
切片刀片的角度和刀片的锋利度会影响切片的质量，因此需要定期检查和更换刀片。
5. 切割组织样品将冷冻的组织样品取出，迅速放置在切片刀床上，并用切片刀沿着组织的纵向或横向切割，制备薄片。
切割时要保持手的稳定和力度的均匀，以获得均匀且薄的切片。
6. 收集切片使用切片刀片或刷子将切割好的组织切片收集到切片缓冲液中。
切片缓冲液可以保持组织切片的湿润和形态结构。
7. 制备载玻片在载玻片上涂抹一层适当的胶水或明胶溶液，将收集好的组织切片均匀地放置在载玻片上。
确保组织切片的平整和分布均匀。
8. 干燥和固定切片将载玻片放置在室温下或烘箱中，使其干燥。
干燥后，可以使用染色剂或其他化学试剂对切片进行染色或固定，以便后续的显微镜观察和分析。
9. 显微镜观察和分析将制备好的组织切片放置在显微镜下，观察和分析组织的形态结构、细胞的类型和分布等信息。
可以使用不同的显微镜技术，如光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜，以获得更详细和精确的数据。
10. 结果记录和分析根据显微镜观察和分析的结果，记录和分析组织切片的特征和变化。
可以使用统计学方法对数据进行处理和分析，以得出科学结论和研究结果。
实验五 冰冻切片法
四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在
标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
注意事项
速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现， 软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min；
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右· 脂肪组织一般在-35℃以下； 封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。
冰冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二 氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导 体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技 的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切 片法，正在受到青睐。
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器
冷台 冷刀
制冷调节器
切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造；
练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏
实验用具：载、盖玻片药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。 切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水 龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅 通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流 水量：>400ml/min 将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀 片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切 出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。 切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。 封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明 胶液，
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用冰冻切片是一种常见的组织切割技术，它使用低温冷冻样品，然后使用切片机将样品切成非常薄的切片。
冰冻切片技术是生物学研究和医学诊断中不可或缺的重要工具。
它可用于观察许多样品的内部结构，如细胞、组织和器官等，进一步了解它们的功能和形态。
下面将详细介绍冰冻切片的步骤要求及其作用：1.样品固定：在进行冰冻切片前，样品需要进行固定以保持其形态、结构和细胞凝胶状态。
常见的固定方法包括乙醛固定和冷凝固定。
选择适当的固定方法取决于待测样品的特性和研究目的。
2.固定样品冷冻：在进行冰冻切片前，固定的样品需要在低温下冷冻。
冷冻操作的关键是控制冷冻速度和温度，以防止样品在冷冻过程中发生损伤。
常见的冷冻方法包括液氮冷冻和冷冻板冷冻。
液氮冷冻可以实现更快的冷冻速度，而冷冻板冷冻则可以更好地控制冷冻温度和速度。
3.制备切片：冷冻后的样品需要进行切片。
切片机通常用于切割样品。
在切片机工作之前，需要将切片刀冷却到适当的温度，以防止冻结的样品在切割过程中解冻。
然后，将冷冻样品放在切片机上，并调整合适的切片参数，包括切片厚度和速度等。
4.收集切片：完成切割后，收集切片并放置在适当的载玻片或载片上。
注意不要损坏或弄丢切片，同时避免切片之间的交叉污染。
将切片放置在载片上后，可以进行染色、免疫染色或其他实验处理。
5.形态学检查：切片制备完成后，可以使用显微镜对切片进行形态学检查。
通过观察切片，研究者可以进一步了解样品的内部结构，如细胞、组织或器官的形态、形状、大小、有丝分裂状态、细胞排列、器官的血供和微观解剖结构等。
6.免疫组化处理：冰冻切片的一个重要应用是免疫组化染色。
可以使用适当的抗体来标记感兴趣的分子，从而确定其在样品中的存在和定位。
这种技术可以帮助研究者确定一些蛋白质的表达情况、定位和数量，并进一步揭示其在生物学过程中的功能。
7.其他实验处理：除了免疫组化处理外，冰冻切片还可以在其它实验中应用。
例如，可以在切片上进行蛋白质或核酸的杂交实验，研究蛋白质表达的变化或基因表达的调控。
病理制片技术――冷冻切片的制作
病理制片技术――冷冻切片的制作一、概述冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。
与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。
此外由于冷冻切片的标本是未经固定的新鲜组织，因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方法。
冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。
二、冷冻切片的制作方法利用氯乙烷喷洒、二氧化碳喷射、半导体制冷的方法均可制作普通的冷冻切片，用于术中的病理诊断。
恒冷箱冷冻切片机可以制作适用于各种目地的冷冻切片，是目前最为常用的理想冷冻切片制片方式。
1.冷冻切片的技术操作方法(1)将恒冷箱冷冻切片机的速冻头和箱内温度调整到适宜的切温度，一般情况下为一18～一25℃。
(2)在标本冷冻托上涂布一层冷冻包埋剂一OCT，然后将取材后新鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT覆盖标本。
(3)标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上，调整机头位置使其恰好位于切片刀的后方。
(4)使用粗切削方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平面，使用自动推进方式连续切削2～3刀后用毛笔清除机头、标本托及切片刀上的组织碎屑。
(5)调整并确认切片的厚度，一般为4～8 um，染脂肪和神经组织应控制在12~25 u m。
(6)放下防卷板使防卷板的位置恰好与切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。
(7)以自动推进的方式进行切片，良好的切片将在防卷板的下方形成一张完整平整的薄片，如切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片。
(8)打开防卷板，用载玻片平稳地轻压切片使其平整地吸附到载玻片上。
三、冷冻切片的染色切好的冷冻切片立即投入丙酮中进行固定，一般固定1～2 min即可进行染色，用于免疫组化染色的冷冻切片应在切片略干时即刻投入冷甲醇中固定10~15 rmin然后进行相应的组织化学染色程序。
1．冷冻切片的HE染色程序。
冰冻切片及电镜标本的制备
冰冻切片的制备一、冰冻切片技术的概述(一)优点:1.简便,可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片,减少了一些中间环节。
2.快速,用时短。
3.组织变化不大。
4.能很好保存脂肪,类脂等成分。
5.能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类,特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
(二)缺点:1.不容易做连续切片。
2.切取的组织不能过大,组织过大不容易冻结或者组织冻结不均,影响切片及染色效果。
3.不容易制作较薄的切片。
4.组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位,并且组织结构也不如石蜡切片清晰。
(三)主要应用于:1.用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。
2.用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。
3.用于临床手术的快速病理诊断。
二、冰冻切片机的使用及注意事项(1)新鲜的组织制备组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好,才能避免冰晶,常用的骤冷剂有:①CO2气(-78℃)②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷(-80℃)③液氮(-190℃)④液氮冷却的丙烷(-19℃)。
液氮适用于组织化学,较安全。
缺点:组织块易发生龟裂。
(2)固定组织的制备为防止水解酶和其他物质的移位、弥散,常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用,低温,冷甲醛短时间固定(10分钟左右)固定,可显示琥珀酸脱氢酶。
电镜出现后,需要保存细胞的超微结构,以4%缓冲戊二醛(25%戊二醛16ml;0.1M二甲胂酸(pH7.)84ml;蔗糖8g)固定较好。
这些固定液主要用于水解酶,而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
(3)恒冷箱温度一般在冷冻后10分钟,到接近冷室温度时再切,一般组织在-15~-20℃切片最易成功。
每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度,Pearse及Bancroft 的经验如下:组织刀温度组织温度恒冷箱温度肝-18 -10 -5肾-15 -8 -5皮肤-35 -10 -5脑-18 -5 -5固定组织一般高3-5度(4)抗卷板抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离,使切片平滑通过。
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生物显微技术课程论文（2010——2011学年，第一学期）冰冻切片摘要：1.1冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度, 然后进行切片的一种方法。
因其制作过程较石蜡切片相对简便、快捷, 都应用于手术中快速病理诊断。
我科于1975 年开展术中冰冻切片检查, 1995 年采用快速恒冷式切片机(德国LE2ICACM1850) , 作冰冻切片1100 余例, 其中包括乳腺、肺、喉、甲状腺、淋巴结、消化道、泌尿道、卵巢、子宫、皮肤等组织。
结果显示, 切片顺利,制作效果满意, 为病理诊断提供了可靠的依据。
既免除了患者多次手术带来的巨大痛苦, 又节约了患者的住院费用, 深受广大临床医生及患者的欢迎及好评。
关键词：冰冻切片方法及注意事项冰冻切片机1 冰冻切片简介1.1冷冻切片的种类冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。
这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。
当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。
1.2冷冻切片的目的1.2.1在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。
1.2.2了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.3了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.4在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。
1.2.5显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。
1.2.6某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。
1.2.7神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。
1.2.8对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
2冰冻切片的制作方法2.1操作方法及步骤：2.1.1取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
2.1.2取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
2.1.3将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
2.1.4调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
2.1.5调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。
这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
2.1.6应视不同的组织选择不同的冷冻度。
冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。
如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
2.2冰冻切片的快速染色法冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。
以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。
根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。
冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
方法：2.2.1切片固定30秒－1分钟。
2.2.1 水洗。
2.2.3染苏木素3－5分钟。
2.2.4分化。
2.2.5于碱水中返蓝20秒。
2.2.6伊红染色10－20秒。
2.2.7脱水，透明，中性树胶封固。
3.操作过程中常见问题与处理3.1标本固定应充分标本经固定或不固定均可，但经过固定的组织切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰，而未固定的组织冰晶多，细胞挤压变形大，甚至会影响观察结果。
因此，除特别需要外，一般较多采用组织固定后再行切片。
固定方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定。
灌注法适用于动物实验研究。
用于组织固定的固定剂种类很多，包括醛类、非醛类、丙酮及醇类等，其中以中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用2’，- 3组织固定时，一方面固定液要有足够的量，另一方面还要保持一定时间，一般在快速灌注固定取材后，多用相同的固定剂再固定! % " ，以使组织充分固定，这对保持切片的完整性尤为重要。
3.2减少冰晶的形成未经固定的组织切片时冰晶较多，这是公认的事实，即使固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，为防止冰晶的形成，常可采取如下方法：1.速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降温【1】。
2.利用高渗溶液吸收组织分子：将组织置于20% ——30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够时间，观察组织快，待其沉底后，取出切片。
这样即可大大减少冰晶的形成。
3.3保持切片的完整性破碎的组织切片必然丢失实验信息，切片的完整性对研究结果的分析无疑十分重要。
切片破碎不全、有缺损的常见原因有：1组织固定不完全；2温度设置不当。
组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎。
组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同样易粘、易碎；3组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多；4 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整；5操作手法不当，如速度不适宜，切片也可能不完整。
遇到上述情况，应有针对性的采取相应的措施。
如注意组织固定充分、尽量减少冰晶的形成，保持刀片的清洁与锋利，冷冻温度要适宜，不同的组织应设置不同的温度，如较大组织块或含有较多脂肪的组织应设置温度相对较低，冷冻时间稍长些。
而脑、脊髓等温度设置相对高些有作者采用“边冻边切”法【2】制作切片，同样也取得较好的效果。
若组织带有不必要的皮肤或包膜，应尽量去除干净；如必须保留皮肤或包膜，应注意采取相应的切片技术，如最好将皮肤或包膜的平面与刀面垂直。
此外，在切片时，应注意速度均匀。
当然，要做好这些，必须有一定的实践经验。
3.4防止切片卷缩切片卷缩是指切片不进入防卷板与刀台之间或当掀起防卷板时切片卷起。
常见原因有：切片刀钝或粘有组织碎屑、防卷板位置不正确或防卷板较脏、静电或者气流作用、防卷板温度高、室温高等。
可采取以下对策：1保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤，与切片接触面应为磨面，其边缘应于切片刀边缘平行。
2采取相应措施去除静电，操作者应尽可能戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板。
3切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室盖，降低防卷板温度。
4 开放式冰冻切片机，切片时暴露空气中，温度不易控制，在高温季节，切片非常容易卷缩，切片技术难度大，采用冻刀加冻台法效果好些。
3.5贴片中常见问题及处理3.5.1 载玻片粘不上切片。
此情况多见于准备片染的载玻片温度过低，只要使载玻片与切片间有一定温度差，切片即可贴到载玻片上，一般将载玻片置于常温即可。
’, ( 贴片时切片易碎。
排除固定不充分等因素外，漂片处理贴片时应注意动作轻、稳、准。
根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适的毛笔，将笔尖伸入片下水中，往上轻轻将切片挑起，并展开。
3.6反应过程中常见问题分析及处理3.6.1 切片脱落影响切片粘贴牢固程度的常见原因有1载玻片不干净2载玻片粘附剂处理不好。
3贴片后，粘贴尚未牢固即进行反应。
可采取以下措施：保持载玻片干净，新买的载玻片经正规洗涤后，在95%的酒精内浸泡2小时，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干再使用。
载玻片粘附剂种类较多，如铬矾明胶，配制后即可涂片，置37摄氏度温箱烤干。
贴好的玻片，可放入恒温烤箱内适当烘干，增加组织与玻片的粘贴。
3.6.2染色失败如染色过深、过浅、不均，所染切片均呈弱阳性或阴性结果。
这常与染色时间长短有关或者玻片之间有重叠，在染色过程中，除严格按操作步骤进行，还应注意观察染色程度、玻片避免重叠。
另外，缓冲液的配制、切片的漂洗、试剂的纯度等都应该有严格的质量保证。
3.7封片过程中常见问题分析及处理3.7.1封入气泡注意通过挤压盖玻片将气泡排除。
3.7.2滴蛋白甘油过多封片时滴过多的蛋白甘油，就使整个片子显得不干净，影响观察，因此，应注意适量，万一过量，可先用滤纸沾干，片子晾干后，可用绸布蘸二甲苯擦除。
4.冰冻切片的优缺点4.1优点：4.1.1 简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。
4.1.2．快速，用时短。
4.1.3．组织变化不大。
4.1.4．能很好保存脂肪，类脂等成分。
4.1.5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
4.2缺点：4.2.1．不容易做连续切片。
4.2.2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。
4.2.3．不容易制作较薄的切片。
4.2.4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。
5..主要应用于：5.1．用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。
5.2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。
5.3．用于临床手术的快速病理诊断。
6.冰冻切片机 freezing microtome冰冻切片专用的切片机。
一般是用液体二氧化碳使组织块冻结来进行切片，但不能切成太薄的切片（10-20微米）。
低温恒温器是安放切片机的冰冻室，可在短时间内将新鲜的材料直接制备冻结切片。
供电子显微镜用的有冰冻超薄切片机（cryo-ultramicrotome）。
TT22-HQP-101型恒冷箱式冰冻切片机是最新一代电脑控制机型该机是对生物组织进行快速制冷并在恒冷箱内进行切片机的必备设备适用于临床病理诊断和组织分析。
6.1主要性能特点：恒冷箱式冰冻切片机有十几年的历吏为国内第一家制造厂家制冷系统采用国际最先进的硬度缩机组制冷速度快从保温状态到切片工作状态只需十几分钟；操作窗为航空镀膜玻璃高级不锈钢内胆特殊耐低温材料切片机机心采用军工航空技术设备之优势吸收国外冰冻切片机的优点精心设计精心制造使之一直保持在国内同类产品中处于领先水平主要技术参数：冷箱温度：0～-35℃冷台温度：0～-40℃最大切片面积：25mm×25mm切片厚度：2μ～16μ 1μ～20μ切片厚度调节间隔：1μ～2μ电脑控制定时保温定时开机自动除霜电源：AC220V 50Hz功率：800W外形尺寸：（宽×长×高）：640mm×760mm×1150mm质量约120kg6.2冰冻切片机的使用6.2.1新鲜的组织制备组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：①CO2气（－78℃）②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷却的丙烷（－19℃）。