食物中维生素B12的测定方法
液相色谱法测定软胶囊中的维生素B12
液相色谱法测定软胶囊中的维生素B12摘要：本文建立了软胶囊中水溶性维生素钴胺素的高效液相色谱分析方法，该方法操作简便，耗时短。
取适量软胶囊内容物，加入正己烷涡旋使其充分溶解后，加入适量纯化水振荡提取30分钟，离心后取上清液重复提取一遍，合并提取液于25mL棕色容量瓶中用纯化水定容至25mL，取样液过0.22μm水系膜然后用高效液相色谱-紫外检测器测定。
结果显示，维生素B12的线性相关系数（r2）≧0.999，样品浓度的精密度≦5.0%，加标回收率为90%~100%。
该方法操作简便，分析时间短，回收率高，节省物力财力，稳定，准确，适用于软胶囊样品中钴胺素的检测。
关键词：维生素B12(钴胺素)；软胶囊；高效液相色谱-紫外检测器；Determination of Vitamin B12 in Soft Capsules by Liquid ChromatographyAbstract: This article establishes a high-performance liquid chromatography method for the analysis of water-soluble vitamin cobalamin in soft capsules. The method is simple and time-consuming. Take an appropriate amount of soft capsule content, add n-hexanevortex to make it fully dissolved, add an appropriate amount ofpurified water to shake and extract for 30 minutes, take thesupernatant after centrifugation and extract again, combine theextract solution in a 25mL brown volumetric flask, use purified waterto fix the volume to 25mL, and pass 0.22 for the sample solution μThe water system membrane was then determined using high-performance liquid chromatography ultraviolet detector. The results showed thatthe linear correlation coefficient (r2) of Vitamin B12 was ≥ 0.999,the precision of sample concentration was ≤ 5.0%, and the spiked recovery was 90%~100%. This method is easy to operate, has shortanalysis time, high recovery rate, saves resources and finances, is stable, accurate, and suitable for the detection of cobalamin in soft capsule samples.Key words: Vitamin B12 (cobalamin); Soft capsules; Highperformance liquid chromatography ultraviolet detector.维生素B12，又名钴胺素，是最新型的维生素。
农产品中维生素的测定原理
农产品中维生素的测定原理维生素是人体必需的有机化合物，它在人体内参与多种生化反应，维持正常生理活动。
因此，衡量农产品中维生素含量的准确性对于评估食物的营养价值和制定饮食计划至关重要。
测定维生素的常用方法包括化学方法、微生物发酵法、色谱法和光谱法等。
1.化学方法:化学方法通常基于化学反应原理，通过测定产生的反应物的数量或测定反应物与维生素的摩尔比来确定维生素的含量。
常用化学方法包括氧化-还原法、络合滴定法和显色滴定法。
例如，测定维生素C的浓度可以采用氧化还原反应，生成反应物的数量与维生素C的浓度成正比。
首先，将维生素C溶解于适当的溶剂中，然后用氧化剂如碘溶液滴定样品中的维生素C，直到滴定终点的颜色变化。
将已知浓度的标准溶液也进行同样的滴定，通过比较滴定终点的体积和标准溶液的体积，可以计算出待测样品中维生素C的浓度。
2.微生物发酵法:微生物发酵法利用特定微生物菌种的代谢产物来测定维生素含量。
维生素B族（如维生素B12）的测定通常采用这种方法。
在此方法中，特定菌株依赖特定维生素的辅助生长，测定菌株在不同维生素浓度下的生长情况，然后确定待测样品中维生素的浓度。
3.色谱法:色谱法基于维生素在固定相和流动相之间的相互作用来分离和测定维生素的浓度。
色谱法可以进一步细分为气相色谱法和液相色谱法。
在气相色谱法中，维生素通常首先被蒸发成气体，然后通过柱子中的固定相进行分离。
不同维生素的分子间相互作用和化学性质的不同导致不同维生素在柱子上停留时间的差异，从而实现分离。
液相色谱法则通过利用维生素在固定相（如色谱柱或薄层）和流动相之间的差异来分离不同维生素。
维生素在流动相中的溶解度和相互作用力的差异导致了不同维生素在固定相中的停留时间的差异。
4.光谱法:光谱法是一种通过测量维生素吸收或发射特定波长的光来测定维生素含量的方法。
吸收光谱法和荧光光谱法是常用的光谱法测定维生素的方法。
吸收光谱法通过测量维生素溶液对特定波长光的吸收程度来间接测定维生素的含量。
维生素B12含量测定
B12多少？如果每1ml标示量为1mg，则计 算标示量％
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紫外分光光度法 12
PHARMACEUTICAL COLLEGE
一、实验目的：
• 1、掌握Uvmini-1240型的使用方法。
• 2、掌握维生素B12注射液的紫外分光光度 法鉴别及含量测定。
• 3、掌握吸收系数法定量测定的计算公式。
• 4、熟悉绘制吸收曲线的一般方法。
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紫外分光光度法 5
PHARMACEUTICAL COLLEGE
• 按吸收系数法定量计算： C样品（μg/ml）=A361×48.31
见P92
C=ECL
A样品 B12含量= ———— × 100%
A对照
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取对照品测 A3紫61外做分对光光照度法 11
PHARMACEUTICAL COLLEGE
•
六、思考题
• 如果取注射液水2ml稀释30倍，在361nm处
做光谱图（粗扫描），在278nm，361nm，550nm处 有吸收峰。
• 2、精测：在以上278nm，361nm，550nm波长分别 ±1 范围内测定吸光度（每转换一次波长以水做空白） 记录各最大吸收值。
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紫外分光光度法 8
仪器的使用方法
开机：打开电源，仪器初始化，约3min完成，然后预热 大约0.5h。 方法菜单：
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紫外分光光度法 3
PHARMACEUTICAL COLLEGE
• 维生素B12是含钴的有机药物； • 为深红色结晶，又称为红色维生素B12或
氰钴胺； • 是唯一含有主要矿物质的维生素。 • 分子量：1355.38 • 分子式：C63H88CoN14O14P
维生素b12测定
2 方法与结果2.1 测定波长的选择维生素B12吸收光谱上有三个吸收峰：278 nm、361 nm、550 nm。
维生素B12在361 nm的吸收峰干扰因素少，吸收又最强，中国药典规定以361 nm处吸收峰的比吸光系数E1%1 cm值（207）为计算含量依据［2］。
本实验选择361 nm为测定波长，以标准曲线法为计算含量依据。
2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备［3］：精密称定对照品维生素B12 0.0025 g，置于25 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
将溶解后的溶液放置冰箱中冷藏备用。
2.2.2 供试品溶液的制备：维生素B12片剂为糖衣片，取本品50片，除去糖衣，使其呈现粉红色，研细，精密称定研磨样品，约相当于维生素B12 1.25 mg(每片的标示量为25.0 μg),置50 mL容量瓶中，加水35 mL，充分振摇30 min使其溶解，加水稀释至刻度，密塞，再用力振摇10 min，静置，取上清液，用0.8 μm的微孔滤膜滤过，滤液放置冰箱中冷藏备用。
2.3 线性关系标准曲线的绘制：精取2.2.1项下的储备液，用水分别按1.5、2、4、6、8、10、15、20倍稀释，摇匀。
在361 nm波长处测定吸光度，结果见表1。
表1 100 μg/mL标准品稀释倍数测定结果（略）以吸光度A与质量浓度c绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0193X+0.048,r=0.9937。
结果表明维生素B12对照品溶液在5.00 μg/mL～100.00 μg/mL范围内质量浓度与吸收程度呈良好的线性关系。
见图1。
2.4 精密度试验精取浓度为100 μg/mL的对照品溶液在361 nm连续测定5次，测得维生素B12的平均吸光度为2.087，RSD为0.7%（n=5）。
RSD数值较小，说明该方法精密度好。
2.5 稳定性试验取同一供试品溶液，在冰箱中冷藏2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按2.7项下含量测定法测定，结果见表2，计算得平均吸光度为0.468，RSD为0.99%（n=5）。
超高效液相色谱-串联质谱测定营养强化食品中维生素B12的含量
用 ＨＬ Ｂ（ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｅ — ｌ ｉ ｐ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｅ ｂ ａ ｌ ａ ｎ ｃ ｅ ｎ ｕ ｍｂ ｅ ｒ ）固相 萃取柱 进行 富集与 净化， 维生 素 Ｂ１ ２在
０ ． ５ ￣１ ０ ０ ． ０ ｇ ｇ ／ Ｌ浓度范 围内与 其响应值呈 良 好 的线性关系 ， 检 出限为 １ ． ０ ｇ ｇ ／ ｋ ｇ ， 说明该方法
具有分析速度快 、 灵敏度高 、 重复性好的优点， 适用于对营养强化食品 中维生素Ｂ ２ 含量的测定．
关键 词 ：维生素 Ｂ ２ ； 超高效液相色谱一 串联质谱； 营养强化食 品
Ａ ｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ａ ｓ ｉ ｍｐｌ ｅ ， ｆ ａ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｃ ｃ ｕ ｒ ａ ｔ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｖ ｉ ｔ ａ ｍｉ ｎ Ｂ１ ２ ｉ ｎ ｏｒ ｆ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｆ ｏ ｏ ｄ ｓ ｉ ｓ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐｅ ｄ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｕｌ ｔ ｒ ａ ｈ ｉ ｇ ｈ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｎ ｃ ｅ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ — － ｔ ａ ｎ ｄ ｅ ｍ ｍａ ｓ ｓ ｓ ｐ ｅ ｃ — －
（ １ ． 上海德诺产 品检测有 限公司， 上海 ２ ０ ０ ４ ３ ６ ； ２ ． 上海大学 理学院一 海 ２ ０ ０ ４ ４ ４ ）
（ 本刊 编委 曹卫 国推荐）
摘 要： 采用 固相萃 取（ ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｓ Ｐ Ｅ ） 柱对 样品 中维 生素 Ｂ １ ２ 进行浓 缩与净化 ， 提 出了一种可 灵敏 测定营 养强 化食 品中维 生素 Ｂ １ ２ 含 量 的超 高效 液相色 谱一 串联质 谱（ ｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｈ ｉ ｇ ｈ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｎ ｃ ｅ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ — ｔ ａ ｎ ｄ ｅ ｍ ｍａ ｓ ｓ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｍ ｅ ｔ ｒ ｙ ， Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ ） 方法 ，
微生食物中维生素B12的测定方法
微生食物中维生素B12的测定方法微生物测定法1.原理维生素B12对于Lactobacillus leichmannii （ATCC 7830）的正常生长是必需的，在一定生长条件下，Lactobacillus leichmannii的生长与繁殖速度和溶液中维生素B12的含量成一定的线性关系，利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定食物样品中维生素B12的含量。
本方法最低检出限0.001ng。
2.适用范围本方法参考"Official Methods of Analysis of the Association of official Analytical Chemists"、"Methods of Vitamin Analysis"以及"Methods of the Microbiological Analysis of Selected Nutrients"。
本方法适用于测定食物及饲料中的维生素B12含量。
3.试剂本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。
3.1 甲苯3.2 柠檬酸（C6H8O7·3H2O）3.3 磷酸氢二钠（Na2HPO4）3.4 焦亚硫酸钠（Na2S2O5）3.5 抗坏血酸（生化试剂）3.6 无水葡萄糖3.7 无水乙酸钠3.8 L-胱氨酸（生化试剂）3.9 D,L-色氨酸（生化试剂）3.10 10mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠溶于适量水中，定容至500ml。
3.11 （1+4）乙醇溶液：200ml无水乙醇与800ml水充分混匀。
3.12 酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200 ml 3 mol/L盐酸，121℃高压水解6小时。
将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。
加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。
以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。
食品中的维生素含量测定与分析
食品中的维生素含量测定与分析维生素是人体必需的有机化合物，对人体的正常生长发育和健康维持起着重要作用。
食物是人们获取维生素的主要途径，而了解食品中维生素的含量，则对保持健康和合理膳食具有重要意义。
本文将介绍食品中维生素含量测定与分析的方法。
一、常见维生素及其作用维生素主要分为水溶性维生素和脂溶性维生素两类。
水溶性维生素包括维生素B系列和维生素C，它们在人体内不易储存，需要经常摄入；脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K，这些维生素可以在人体内储存，并随需要时释放出来。
维生素对人体的作用非常广泛，如维生素A能维护视力，维生素C有助于提高免疫力，维生素D有助于钙的吸收等。
二、维生素含量测定的方法1. 高效液相色谱法高效液相色谱法是目前常用的测定维生素含量的方法之一。
该方法原理简单、准确度高，能够分析多种维生素同时存在的情况。
通过高效液相色谱仪的分离柱将食品中的维生素分离开来，再利用检测器对其进行检测。
这种方法适用于各类食品的维生素含量测定。
2. 比色法比色法是一种基于化学反应的测定维生素含量的方法。
这种方法基于维生素与某种物质发生化学反应后的颜色变化进行测定。
比如，测定维生素C的含量可以采用二氯苯酚蓝消退法，利用蓝色二氯苯酚蓝与维生素C反应生成无色产物，通过比色测定反应前后的颜色差来计算维生素C的含量。
三、维生素含量测定与分析的实际应用维生素含量的测定与分析在食品加工和营养学研究中具有重要作用。
在食品加工过程中，了解食品中维生素的含量可以帮助生产商控制产品的质量，避免因维生素过多或过少而引起的问题。
在营养学研究中，测定食物中维生素的含量可以帮助人们制定合理的膳食方案，保证各类维生素的摄入，提供身体所需的养分。
另外，对于素食者或者存在维生素缺乏症状的人群来说，维生素含量的测定与分析更显得重要。
素食者由于不摄入动物食品，容易缺乏某些维生素，比如维生素B12。
而对于存在维生素缺乏症状的人群，通过测定其体内维生素的含量，可以了解其维生素摄入是否达标，并对其进行补充。
食品中的维生素的检测
食品中的维生素的检测维生素是人体所需的一类微量营养素，其在不同的食品中也含量不同。
为了确保人们摄取到足够的维生素，对食品中的维生素含量进行检测是非常重要的。
本文将介绍食品中常见的维生素及其检测方法和常见问题。
常见的维生素维生素C维生素C（抗坏血酸）是一种重要的水溶性维生素，对人体有许多好处，包括抗氧化、增强免疫力、促进胶原蛋白的生成等。
许多食物中都含有丰富的维生素C，如柑橘类水果、草莓、番茄、西兰花、绿叶蔬菜等。
维生素D维生素D是一种脂溶性维生素，对人体的钙吸收和骨骼生长发育具有重要作用。
维生素D主要来自阳光照射和食物摄入。
鱼肝油、蛋黄、奶制品等食品中含有较高的维生素D。
维生素B12维生素B12是人体必需的水溶性维生素之一，对于脑部和神经系统的正常功能具有重要作用。
维生素B12主要来自动物性食品，如肉、鱼、奶制品等。
检测方法维生素的检测方法主要是化学分析法和生物分析法。
目前广泛应用的是高效液相色谱法（HPLC）和光度法。
HPLC法HPLC法是一种高效分离技术，它通过溶液在高压作用下通过色谱柱，实现维生素的分离和检测。
该方法具有灵敏度高、准确度高、可靠性高等优点。
同时，该方法还可以同时检测多种维生素，具有较高的经济效益。
光度法光度法是通过分析样本中维生素对光线吸收的程度来测定维生素含量的方法。
该方法简便易行、成本低，但灵敏度相对较低。
常见问题维生素在什么条件下易失活？维生素在高温、酸性环境、阳光照射等条件下易失活，因此在食品贮存和加工过程中需要注意保持低温、避免酸性环境等。
维生素缺乏会导致哪些疾病？不同的维生素缺乏会导致不同的健康问题。
例如，维生素C缺乏可导致坏血病、牙龈出血等；维生素D缺乏可导致佝偻病等。
食品中有哪些因素会影响维生素的含量？食品加工过程中的烹调、存储等因素都会影响维生素的含量。
例如，高温和长时间加热会导致维生素C的流失；光照会导致维生素的降解等。
食品中的维生素含量对人体健康具有非常重要的影响，因此对食品中维生素的检测显得尤为重要。
维生素B12测定原始记录表
标准溶液名称：维生素B12标准工作液 标准曲线工作液：低浓度0.01ng/mL，高浓度0.020ng/mL
试管号
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
标准曲线工作液浓度ng/mL
0.00
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.10
维生素B12含量
0.00）
维生素B12含量平均值
p（ng/ml）
试验中维生素B12含量X μg/100g
1
2
3
平均值
A1
B1
C1
D1
A2
B2
C2
D2
检验员：复核人：审核人：
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.10
吸光度1
吸光度2
吸光度3
吸光度平均值
标准曲线Y=
样品测定
提取液定容体积V mL；计算公式 p= 曲线查得维生素B12含量/V1；X=p×V×f×100/（m×1000）
序号
试样质量
m（g）
稀释
倍数f
吸取试样
液体积
V1（mL）
吸光度
样品编号
样品名称
检验项目
维生素B12
检验依据
GB5009.285—2022食品中维生素B12含量的测定
检出限
仪器名称
仪器型号
仪器编号
检测起止日期
环境条件
温度 湿度
分析步骤：称取试样_____于250mL灭菌瓶中，用10mL的提取溶液混匀后，加150mL水，摇匀，置于压力灭菌器中121℃水解10min,冷却后用盐酸溶液(1mol/L)调pH至4.5±0.2，转人250mL容量瓶中，定容至刻度。混匀，过滤。移取滤液5mL,加入20mL~30mL水，用氢氧化钠溶液(1mol/L)调pH至6.8±0.2，转入100mL容量瓶中，定容至刻度。根据试样中维生素含量用水对试样提取液进行适当稀释，使稀释后试样提取液中生物素含量在0.01ng/mL~0.02ng/mL范围内。取4支试管，分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL试样提取液，补水至5.0mL,加入5.0mL维生素B12测定用培养液，混匀。每个梯度做3个平行。取试管分别加人标准使用工作液低浓度0.0mL(未接种空白)、0.0mL(接种空白)、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.00mL、和高浓度3.0mL、4.0mL、5.0mL,补水至5.00mL,相当于标准系列管中维生素B12含量为0.00ng、0.00ng、0.01ng、0.02ng、0.03ng、0.04ng、0.05ng、0.06ng、0.08ng、0.10ng。加5.0mL维生素B12测定用培养液，混匀。每个梯度做3个平行，绘制标准曲线时，以每点均值计算。所有的试管盖上试管帽，放入灭菌釜内，121℃(0.10mPa~0.12mPa)灭菌5min。试管快速冷却至室温，在无菌操作条件下，将接种液转入无菌管，向每支测定管接种50μL测试均菌液，其中标准曲线管中未接种空白和样品空白除外。置于36℃士1℃恒温培养箱中培养19h~20h,直至获得最大混浊度。将培养好的测定管用漩涡混匀器混匀。用厚度为1cm比色杯，于550nm处，以未接种空白管调节透光率为100%或吸光度为0，读出接种空白试管的读数，再以接种空白试验管为空白，调节透光率为100%或吸光度为0，然后依次测定标准系列管、试样系列管吸光值。
维生素的分析与检验-----维生素B12含量的测定
《生物产品的分析与检验》维生素的分析与检验-----维生素Ｂ12含量的测定目 录1. 认识维生素2. 维生素B12对人体的意义3. 维生素B12的性质4. 维生素B12测定方法一、认识维生素维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质。
维生素广泛存在于动、植物和微生物体内。
维生素类物质的分类（按其溶解性质分）脂溶性维生素：主要有A、D、E、K等水溶性维生素：主要有B族（B1、B2、B12等）、维生素C、烟酸、叶酸、泛酸等。
维生素测定方法主要有化学分析法、比色法、分光光度法（紫外和荧光）、层析法、色谱法（气相色谱和高效液相色谱）和微生物法等。
二、维生素B12对人体的意义维生素B 12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。
自然界中的维生素B 12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12 维生素B 12是需要一种肠道分泌物（内源因子）帮助才能被吸收的惟一的一种维生素。
当人体肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。
植物性食物中基本上没有维生素B 12。
三、维生素B12的性质维生素B 12(vitamin B12)，又称钴胺素，是含钴的B族维生素之一;在pH小于3或大于8的强酸或碱性溶液中极易分解，遇强光或紫外线易被破坏。
维生素B 12在紫外区波长处有最大吸收。
在361nm波长处的吸收峰干扰因素少，通常以361nm作为测定波长。
三、维生素B12含量测定方法◆测定维生素B12的方法有微生物法、比色法、紫外分光光度法、离子交换层析法、原子吸收分光光度法和高效液相色谱法。
紫外分光光度法是较常见的方法。
◆以维生素B12注射液中B12含量的测定为例介绍紫外分光光度法测定维生素Ｂ12含量的方法。
测定方法一、紫外分光光度法测定维生素Ｂ12含量（一）测定原理在紫外区278nm（纳米）、361nm与550nm波维生素B长处有最大吸收。
在361nm波长处的吸收峰干扰因素少，通常以361nm作为测定波长，测定待测溶液的吸光度，用吸光度计算含量。
直接提取微生物法测定保健食品中VB_(12)
中国食品添加剂
China Food Additives
直接提取微生物法测定保健食品中 VB12
李丰，徐瑞丽，罗娟，袁晓，梁军，张建辉
（广电计量检测（湖南）有限公司，长沙 410205）
摘 要 ：基于微生物检测 VB12 的原理，建立了一种直接提取微生物法测定保健食品中 VB12 含量的方法。 保健食品样品经过乙醇水溶液超声提取，适当稀释后加入 VB12 测定培养基，灭菌后加入菌悬液，在 36℃培养 22h 后在 550nm 处测定吸光值，根据吸光值定量测定 VB12 含量。试验结果表明，该方法测定保健食品中 VB12 含量，标准曲线相关系数 R2 为 0.997，呈良好线性 ；重复性试验相对标准偏差在 1.48% ～ 3.09%，重现性良
按照国标 GB 5413.14—2010 配制 VB12 高浓度 工作液（0.02ng/mL）和低浓度工作液（0.01ng/mL）。 1.3.2 菌悬液的制备
将培养好的种子接种液震荡混匀，以 2000 r/min 离心 3min，弃去上清液，加入 10mL 生理 盐水，混匀，再离心 2min ～ 3min，弃去上清液， 再加入 10mL 生理盐水，混匀。如前离心操作， 弃去上清液。再加 10mL 生理盐水，混匀。吸适 量该菌悬液于 10mL 生理盐水中，混匀制成测试 菌 液。 用 分 光 光 度 计， 以 生 理 盐 水 做 空 白， 于 550nm 波长下测试菌液的透光率，使其透光率在 60% ～ 80% 之间。 1.3.3 保健品中 VB12 的提取
R2=0.9972 0.35
吸光度/（Abs）
将试管放入恒温培养箱内，36℃培养 22h。
0.25
1.3.7 测定
0.20
将培养好的试管充分震荡混合，用紫外分光 光度计于 550nm 处测吸光值。 1.3.8 直接提取重复性试验
食品中维生素B12的检测方法分析
食品中维生素B12的检测方法分析作者：何嘉明来源：《现代食品·上》2019年第03期摘要：功能性食品、婴幼儿配方乳粉等食品中添加的维生素B12，一般采用微生物比浊法或者高效液相色谱法检测，检测难度较大。
本文归纳了国家标准和AOAC的检测方法，探讨GB5413.14-2010检测的注意事项，关注试剂盒与国家标准法的效果对比。
关键词：维生素B12;检测方法;试剂盒;国家标准中图分类号：R155.5维生素B12的性状、功能和摄入推荐量维生素B，2又名钴胺素，是一类含钴的咕啉类化合物的总称，维生素B12分子中的钴能和-CN、-OH、-CH3或5-脱氧腺苷等基团相连，形成羟基钴胺素（Hydroxycobalamin）、氰基钴胺素（Cyanocobalamin）、脱氧腺苷钴胺素（Deoxyadenosylcobalamin）和甲基钴胺素（Methylcobalamin）。
其中甲基钴胺参与体内甲基移换反应和叶酸代谢，是N5-甲基四氢叶酶甲基移换酶的辅酶。
5-脱氧腺苷钴胺是甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅酶，参与体内丙酸的代谢”。
维生素B，2缺乏可引起贫血、高同型半胱氨酸血症、神经精神疾病、生育与出生缺陷等。
在新生儿期，维生素B，2缺乏可严重损害神经系统的发育和功能，婴儿多表现为生长迟缓和神经系统的缺陷。
婴儿一旦发生维生素B1，2缺乏，维生素B1，2的低水平将会至少持续1年2。
维生素B12缺乏的常见原因可有：①摄入不足。
②获得性吸收不良，如胰源性、胃源性、肝源性或肠源性疾病等。
③对维生素B，需求量增加，如妊娠、产后、绦虫病等。
④先天性维生素B，2代谢步骤的障碍。
⑤药源性缺乏。
《中国居民膳食营养素参考摄入量》中推荐的维生素B，摄入量：14岁以上人群为2.4μg·d-1，1～14岁人群需控制在1.0～2.4μg·d-1，并随年龄增长;1岁以下为适宜摄入量，半岁前为0.3μg·d-1，半岁后为0.6μg·d-1。
微生物法测定腐乳中维生素B12含量的研究
食品研究与开发F ood Research And DevelopmentDOI ：10.12161/j.issn.1005-6521.2020.16.030作者简介：张翔宇（1991—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：生物工程。
微生物法测定腐乳中维生素B 12含量的研究张翔宇（浙江工业职业技术学院鉴湖学院，浙江绍兴312000）摘要：该文主要研究菌悬液放置时间与培养菌液对菌落总数的影响，并将含维生素B 12的培养菌液用于测定4种腐乳（红腐乳、白腐乳、青腐乳和玫瑰腐乳）中维生素B 12的含量。
结果表明，最佳的菌悬液放置时间为1h ，不同厂家生产的同一类型的腐乳维生素B 12含量存在显著差异。
4种腐乳中，青腐乳发酵的最为彻底，并具有最高含量的维生素B 12，其含量是红腐乳和白腐乳的10倍多，高达7.01μg/100g 。
其次是玫瑰腐乳，玫瑰成分经过发酵后会产生较多的营养成分，维生素B 12的含量也较多，达3.84μg/100g 。
红腐乳和白腐乳中维生素B 12的含量较低，分别为0.63μg/100g 和0.49μg/100g 。
关键词：微生物法；培养；腐乳；维生素B 12；营养Determination of Vitamin B 12in Sufu by Microbiological MethodZHANG Xiang-yu（Jianhu College ，Zhejiang Industry Polytechnic College ，Shaoxing 312000，Zhejiang ，China ）Abstract ：In this paper ，we mainly studied the effects of the time of bacterial suspension and the culture medium on the total number of colonies ，and the culture medium containing vitamin B 12was used to determinethe content of vitamin B 12in four kinds of sufu （red sufu ，white sufu ，green sufu and rose sufu ）.The resultsshowed that the best suspension time was 1h ，and the content of vitamin B 12in the same type of sufu produced by different factories was significantly different.Among the four kinds of fermented beancurd ，green beancurd was the most thorough and had the highest vitamin B 12content ，which was more than 10times that of red and white beancurd ，up to 7.01μg/100g.The next was the rose bean curd ，which would produce more nutrientsafter fermentation ，so the content of vitamin B 12was more ，as high as 3.84μg/100g.The content of vitamin B 12in red sufu and white sufu was 0.63μg/100g and 0.49μg/100g ，respectively.Key words ：microbial method ；culture ；sufu ；vitamin B 12；nutrition引文格式：张翔宇.微生物法测定腐乳中维生素B 12含量的研究[J].食品研究与开发，2020，41（16）：184-187ZHANG Xiangyu.Determination of Vitamin B 12in Sufu by Microbiological Method [J].Food Research and Development ，2020，41（16）：184-187维生素B 12（vitamin B 12，V B ）也称为钴胺素（cobal -amin ），是唯一一种含有金属元素的B 族维生素。
维生素b12含量测定计算例题
维生素b12含量测定计算例题
维生素 B12 是一种对人体健康非常重要的维生素，其含量的测定在临床实践和营养学研究中具有重要意义。
下面是维生素 B12 含量测定计算的例题:
假设有一段已知重量为 w 克的食物，其中含有维生素 B12 的质量为 q 毫克。
要测定食物中维生素 B12 的含量，需要进行以下步骤:
1. 将食物进行研磨，使维生素 B12 充分分散。
2. 使用灵敏度合适的检测器，测量食物中维生素 B12 的含量。
3. 根据测量结果，计算出食物中含有的维生素 B12 质量，即 q = fid × w，其中 fid 是检测器的灵敏度，单位为毫安/毫克。
根据上述步骤，可以使用以下公式计算食物中维生素 B12 的含量:
维生素 B12 含量 (毫克/克) = q / (0.001 × w)
其中，0.001 是毫安/毫克的单位转换系数。
在实际测定过程中，可能会受到多种因素的影响，例如检测器的灵敏度、食物研磨的精细程度、测量时间等等。
因此，在实际应用中，需要根据具体情况对测定结果进行修正，以确保计算结果的准确性和可靠性。
食品中维生素的测定
色谱分析法
总结词
分离效果好、灵敏度高
详细描述
色谱分析法是一种分离和测定相结合的方法，通过特定的色谱柱将维生素与其他物质分离，再通过检 测器测定维生素的含量。该方法分离效果好，灵敏度高，适用于复杂基质中维生素的测定。
电化学分析法
总结词
灵敏度高、仪器简单
详细描述
电化学分析法是利用电化学反应来测定维生素的含量。该方 法灵敏度高，仪器简单，但需要特定的电化学电极和较高的 技术要求。
2013《食品中维生素C的测定》
ISO 9926
2017《食品中维生素B1、B2、B6、烟酸和泛 酸的测定》
行业规范
《食品安全国家标准婴幼 儿食品》
《食品安全国家标准饮料》
《食品安全国家标准乳制 品》
《食品安全国家标准肉制 品》
检测方法
01
高效液相色谱法（HPLC）
02
分光光度法（Spectrophotometry）
实验设备与试剂准备
实验设备
准备实验所需的仪器设备，如天平、 离心机、分光光度计等。
试剂准备
根据实验需要，准备各种维生素测定 所需的试剂，确保试剂的质量和纯度。
实验操作步骤
01
02
03
04
样品提取
将处理后的样品加入适量的溶 剂中，进行充分搅拌和提取。
分离纯化
将提取液进行离心或过滤，去 除杂质，得到纯化的维生素溶
03
食品中维生素测定的标准与规范
国家标准
GB 5009.86-2016《食品中叶 酸的测定》
GB 5009.154-2016《食品 中维生素B12的测定》
GB 5009.85-2016《食品中维 生素B2的测定》
食物中维生素B12的测定方法
食物中维生素B6 的测定方法微生物法1.原理维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。
测量维生素B6比较经典的方法是"微生物法"它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单（不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤）、准确度高。
它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。
2.适用范围GB/T 17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测3.仪器电热恒温培养箱电热手提式压力蒸汽消毒器液体快速混合器离心机722光栅分光光度计硬质玻璃试管4.试剂（1）0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32ml H2SO4，用水稀释至1000ml。
（2）0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。
（3）10mol/L氢氧化钠：溶200g NaOH于水中，稀释至500ml。
（4）0.1mol/L氢氧化钠：取10ml 10mol/L NaOH，用水稀释至1000ml。
（5）溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。
（6）培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。
（7）100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。
（8）1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。
（9）琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。
（10）1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
5.菌种的制备与保存5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌A TCC No.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。
猪肝中维生素B12的检测和提取研究
猪肝中维生素B12的检测和提取研究摘要目的：维生索B12广泛应用于医药、食品和畜牧业，工业化生产维生綮B12主要通过微生物发酵。
动物源食品富古维生索B12，如内脏、肝、肾、牛乳及蛋黄。
通过对猪肝中维生素B12的检测，了解到猪肝中维生素B12的量，从而可以清楚的通过摄取猪肝的量来维持人体内维生素B12的量。
方法：1．原子吸收法测定维生素B12的量：维生素B12分子中含有钴原子，采用原子吸收分光光度计可以测定维生素B12中的钴含量，再通过质量换算即可得到维生素B12的含量。
2．大孔树脂吸附法（CAD45）提取维生素样品中的B12：张玉明的研究发现，CAD45树脂在pH为7时对羟基钴胺素具有良好的吸附能力，并且使用50％乙醇(pH=2)溶液可以作为良好的洗脱剂，静态洗脱率高达99％以上。
3.使用高效液相色谱法检测其中羟基钴胺素的量：用HPLC，采用乙腈和醋酸钠缓冲液为流动相能快速测定羟基钴胺素的量，从而确定维生素B12 的提取率。
关键词：维生索B12；羟基钴胺素；大孔树脂吸附法；原子吸收法；高效液相色谱法Detection and extraction of the liverin vitamin B12AbstractObjective: Vit B12 is widely used in medicine, food and livestock, industrial production of subsistence embroidered banner B12 mainly through microbial fermentation. Food of animal origin, rich in ancient Vit B12, such as offal, liver, kidney, milk and egg yolk. Understand the amount of vitamin B12 in the liver in the detection of vitamin B12 in the liver in, which can clearly maintain the human body the amount of vitamin B12 uptake of the liver volume.Methods:1.The atomic absorption method for the determination of the amount of vitamin B12:Vitamin B12 molecules containing cobalt atoms by atomic absorption spectrophotometer can determine the content of cobalt in vitamin B12, vitamin B12 can be obtained through quality conversion.2. Macroporous resin adsorption (CAD45) extract vitamin samples B12:The Yuming the studies have found that The CAD45 resin at pH 7:00 hydroxy-cobalamin prime has a good adsorption capacity and use 50% ethanol (pH =2) solution can be used as the eluent, static elution rate of 99% or more .ing high performance liquid chromatography detection of hydroxy-cobalamin amount:By HPLC, using acetonitrile and sodium acetate buffer as the mobile phase to rapid determination of the amount of hydroxy-cobalamin in order to determine the extraction rate of vitamin B12.Keywords: Vit B12 and; hydroxy cobalamin; macroporous resin adsorption; atomic absorption spectrometry; high performance liquid chromatography.目录1 绪论 (1)1.1 人工合成维生素B12： (1)1.2 维生素B12的特点： (1)1.2.1 物理特点 (2)1.2.2 分子结构特点 (2)1.3 维生素B12 生理作用 (2)1.4 维生素B12 病理 (3)1.5 维生素B12吸收代谢 (3)1.6 维生素B12的来源 (5)1.6.1 工业废液中提取维生素B12 (5)1.6.2 污泥中提取维生素B12 (5)1.6.3 微生物纯种发酵 (5)1.6.4 混合培养发酵生产 (6)2.实验材料与仪器 (6)2.1实验材料、试剂 (6)2.2 实验仪器 (6)3 实验方法和步骤 (6)3.1 样品的预处理 (6)3.2 原子吸收法测定维生素B12 (6)3.2.1 钴的标准溶液配置 (6)3.2.2工作曲线的绘制 (6)3.2.3 样品的分析 (6)3.2.4 数据处理 (6)3.2.5 讨论 (6)3.3大孔树脂吸附法（CAD45）提取维生素样品中的B12 (7)3.3.1 引言 (7)3.3.2 树脂的预处理 (7)3.3.3 CAD45树脂的吸附实验 (8)3.4 使用HPLC检测其中羟基钴胺素的量 (8)3.4.1 标准品的制备 (8)3.4.2 色谱操作条件 (8)3.4.3 标准曲线的绘制 (8)3.4.4 羟基钴胺素样品的测定 (8)3.4.5 讨论 (9)参考文献： (10)致谢............................................... 错误!未定义书签。
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食物中维生素B6 的测定方法微生物法1.原理维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。
测量维生素B6比较经典的方法是"微生物法"它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单（不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤）、准确度高。
它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。
2.适用范围GB/T 17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测3.仪器电热恒温培养箱电热手提式压力蒸汽消毒器液体快速混合器离心机722光栅分光光度计硬质玻璃试管4.试剂（1）0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32ml H2SO4，用水稀释至1000ml。
（2）0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。
（3）10mol/L氢氧化钠：溶200g NaOH于水中，稀释至500ml。
（4）0.1mol/L氢氧化钠：取10ml 10mol/L NaOH，用水稀释至1000ml。
（5）溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。
（6）培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。
（7）100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。
（8）1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。
（9）琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。
（10）1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
5.菌种的制备与保存5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌A TCC No.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。
保存两周以上的菌种，不能立即用作制备接种用的种子液，一定要在使用前每天移种一次，连续2~3天，方可使用，否则生长不好。
5.2种子培养液的制备：加0.5ml 50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）151b压力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。
6.操作步骤整个步骤要避光（1）样品制备：取样0.5~10g（VB6含量不超过10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。
放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。
（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液即样液于冰箱内备测定（保存期不超过36小时）。
（2）接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时接种两管，在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。
取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。
3.样品标准曲线的测定：取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液，从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液，浓度为50ng/ml，3组试管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。
（3）试样的测定：在试管中分别加入0.05，0.10，0.20ml样液，再加入5ml吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃，15磅/英寸2）高压10min，冷至室温备用。
（4）接种和培养：每管接种一滴接种液，于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时（5）测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白管调零。
550nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含VB6的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB6标准工作曲线，用测定管得到的吸光度值，在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。
7.计算各样管的吡哆醇含量A为：A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3则样品的吡哆醇含量为：mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1，x2，x3；取液量分别为V1，V2，V3样品重W（g）取液量V（ml），定容至100ml8.注意事项（1）所有步骤需要避光处理（2）培养时每管必须在同一温度，培养时间以18-24hour为宜。
（3）本实验所有用水皆采用蒸馏水。
食品中维生素B6的测定【GB/T 17407—1998】本标准方法系在参考了美国公职分析家协会分析方法手册（AOAC）公定分析方法及国外有关资料的基础上，经过系统研究而制定出来的。
本方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，易于推广应用。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草；青海省卫生防疫站和昆明医学院参加起草。
本标准主要起草人：周瑞华、杨晓莉、王光亚。
本标准由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
1范围本标准规定了用微生物法测定食品中维生素B6的含量。
本标准适用于各类食品中维生素B6的测定。
2原理卡尔斯伯(Saccharomyces Carlsbrgensis)酵母菌需在有维生素B6存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B6的量与其生长呈正比关系。
用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与标准曲线相比较得出样品中维生素B6的含量。
本方法检出限为0.1ng。
3试剂和培养基本实验所用的水均为蒸馏水。
所用的试剂均需分析纯。
3.10.22mol/L硫酸溶液：取12.3mL相对密度为1.84的硫酸加水稀释至1000mL。
3.24mol/L、1mol/L及0.1mol/L氢氧化钠溶液。
3.325%(V/V)乙醇溶液。
3.4维生素B6标准储备液(0.1mg/mL)：精确称取0.1220g经干燥恒重的盐酸吡哆醇标准品，用25%乙醇定容至1000mL。
冰箱中保存。
3.5维生素B6标准中间液(1.0μg/mL)：吸取5.00mL维生素B6标准储备液于500mL 容量瓶中，用25%乙醇定容。
冰箱中保存。
3.6维生素B6标准应用液(50ng/mL)：临用时吸取5.00mL维生素B6标准中间液于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。
3.7琼脂3.8吡哆醇Y培养基(Pyridoxine Y medium Difc 00951－15－2)：称取5.3g吡哆醇Y 培养基，用水稀释至100mL。
用时现配。
3.9琼脂培养基：称取5.3g吡哆醇Y培养基、1.2g琼脂于烧杯中，加入维生素B6标准中间液2mL(3.5)，加水至100mL，于水浴中加热溶解，趁热尽快分装入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。
制成的斜面培养基，于4℃冰箱内保存。
3.10生理盐水：称取0.9g氯化钠溶解于100mL水中。
每次使用前，分别倒入2～4支15mL试管中，每支约10mL，塞上棉塞于121℃高压灭菌5min，备用。
3.110.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。
4仪器和设备4.1实验室常用设备。
4.2电热恒温培养箱。
4.3压力蒸气消毒锅。
4.4液体快速混合器。
4.5离心机。
4.6分光光度计。
4.7耐热硬质玻璃试管：12mm(i.d)×160mm。
5菌种与培养液的制备及保存5.1储备菌种的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种(Saccharomyces Carlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入2～3支琼脂培养基管中，在30℃恒温箱中培养18～20h，取出，于冰箱中保存不超过两周。
保存数周以上的储备菌种，不能立即做制备接种液用，必须在使用前每天移种一次，连续2～3次，才可使用。
5.2种子培养液的制备：加5mL吡哆醇Y培养基及维生素B6标准应用液0.2mL(3.6)于试管中塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min，放冷，于冰箱中保存。
每次制备2～4管备用。
6操作步骤6.1种子液的制备：需无菌操作。
用接种环从新鲜琼脂斜面培养基上取下卡尔斯伯酵母菌转种到种子培养液(5.2)中塞上棉塞，以45°倾斜度于30℃温度下培养18～20h，在1500r/min下离心5～10min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水5mL稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。
6.2样品提取液的制备称取样品0.5～10g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL 0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩埚盖于瓶口，于121℃高压水解样品5h，取出冷却后，加约10mL4mol/L氢氧化钠，以滇甲酚绿作外指示剂，调节pH值至4.5(指示剂由蓝绿色变为黄绿色)。
将三角瓶内容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤后，滤液于冰箱中保存备用(保存期不宜超过36h)。
6.3样品试液管的制备每支试管中分别加入0.05，0.10，0.20mL的样品提取液，每个样品需做两组，再加入5mL吡哆醇Y培养基。
6.4标准系列管的制备每支试管中分别加入维生素B6标准应用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相当于维生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培养基。
6.5灭菌样品管(6.3)和标准管(6.4)混匀后，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。
6.6接种和培养待试管冷至室温后，在无菌条件下操作，用注射器在每支试管中接种一滴种子液，混匀后，于30℃温箱内培养18～20h。
6.7测定将培养后的标准系列管和样品管，在液体快速混合器上混匀后立即测定混浊度。
用分光光度计于550nm波长下以标准系列的空白管调零点，分别读取各管的光密度值。
7计算以标准系列的含量(ng)为横坐标，以所对应的标准系列的光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
用样品的光密度值在标准曲线上查出每管中维生素B6含量，再折算成每毫升样品中维生素B6含量。
c＝(u1十u2十u3)/3 (2)式中：X——样品中维生素B6的含量，mg/100g；c——样品提取液中维生素B6的浓度，ng/mL；μ——各样品测定管中维生素B6的浓度，ng/mL；V——样品提取液的定容总体积，mL；m——样品质量，g；100/106——折算成每100g样品中维生素B6毫克数。