菌种的来源
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发酵工程菌种的来源及选育
细菌分离：以乳酸菌为例
放线菌的分离
(一)采样
菜园土或林地土
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。 可以筛选新的放线菌。
从堆肥或过热的材料中如干 草或蔗渣中可分离到大量的嗜热 放线菌，从淡水和海洋环境中分 离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
自然风干，备用
气生孢子能耐干燥，耐湿热能力 高于营养体，室温保存20天， 放线菌的数量和组成变化不大， 细菌大部分死亡。
(二)生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物 理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响 实验中所要分离的细菌的数量和种类。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物， 部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤 维素或果胶。
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、 镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、
地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的
（2）化学法
通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。
微生物遗传育种的 第三章——菌种的分离筛选
第三章菌种的分离筛选● 1.菌种来源● 2.分离方法● 3.菌种保藏● 4. 菌种复壮典型的微生物新种分离筛选过程第一节菌种来源1.向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株。
国内主要菌种保藏机构：●AS—中国科学院微生物研究所●CMCC—中国医学细菌保藏管理中心●CVCC—兽医微生物菌种保藏管理中心●IA—中国医学科学院抗菌素研究所●IANP—华北制药厂抗菌素研究所●ID—中国医学科学院皮肤病防治研究所、●CAMS—中国医学科学院流行病学微生物研究所●IFFI—轻工业部食品发酵工业科学研究所等。
国外主要的菌种保藏机构●ATCC—美国标准菌种收藏所●NIH—美国国立卫生研究院●NRRL—美国农业部北方开发利用研究所●CMI—英联邦真菌研究所，CSH—美国冷泉港实验室●IAM—日本东京大学应用微生物研究所，IFO—日本大阪发酵研究所，KCC—日本科研化学有限公司，●NCTC—英国国立标准菌种收藏所●WB—美国威斯康星大学细菌学系等。
2.由自然界（土样、水、动植物体等）采集样品，从中进行分离筛选。
不可培养微生物是指目前尚不能实现人工培养的微生物。
原因可能为尚不了解该类微生物的营养需求和生长需要的理化环境。
目前人类认识和培养的微生物还不到其存在种类的1%。
3.从发酵制品中分离目的菌株。
如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌等。
采样过程（一）从土壤中采样要考虑土壤的有机质含量和通气状况、酸碱度和植被状况、地理条件和季节条件。
用采样铲采集5-25cm（北方干燥的土壤，采集10-30cm）土样10-25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，并编号，记录采集地点、土壤质地、植被名称、采集时间等。
土样采集后要尽快分离，否则可取3-4g撒到事先准备好的选择性培养基试管斜面，避免菌株因不能及时分离而死亡。
根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型采样（1）微生物的营养要求和代谢类型与其生长环境有很大的相关性森林土壤富含纤维素，可分离纤维素酶产生菌；肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，能分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌；面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等，容易分离到产生淀粉酶和糖化酶的菌株；从果园土和腐烂的柑橘、草莓及山芋中，容易分离到果胶酶产生菌。
第二章菌种选育3
基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤
单细胞或孢子悬浮液
诱
活菌计数
诱变处理 诱变处理预备实验
变
处理液活菌计数 平板分离
育
形态变异并计算其变异率
种
斜面培养
初筛、复筛 自然分离和再复筛
保藏及扩大试验
• 出发菌株的选择 • 诱变剂的选择 • 诱变操作（包括诱变剂量的选择） • 突变株的筛选 • 突变高产菌的表现及筛选条件的配合
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上 图。
步骤八
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中 划出第三区，如右上图。
步骤九
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区 中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营 养平板，如右上图。
步骤十
在营养平板上贴好标签， 标示好接种日期、操作者 姓名、菌种学名以及培养 基名称。
初筛：以量为主 复筛：以质为主
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突 变。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。
诱变剂
物理：紫外线，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 生物：噬菌体
诱变育种的主要环节 （1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液
——诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株，
选出性能优良的正变异株——筛选
变异株 代谢控制育种
基因工程定向育种
微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：
（1）所需培养基易得，价格低廉； （2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、
溶解氧、渗透压等） （3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短 （4）单产高 （选择野生型、营养缺陷型或调节
突变株）
（5）抗病毒能力强 （6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生
第二章生产菌种的来源
32
工业发酵菌种必须具备的基本特征
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较 多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易于控制； 抗杂菌和抗噬菌体能力较强； 遗传稳定性高、不易退化； 不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生 物菌株）
33
4、性能测定（毒性试验）
自然界的一些微生物在一定条件下会产毒； 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作 为食用无须作毒性试验外，其他均需 2年以上的毒性试 验； 医药卫生上的产品，还须通过安全试验和临床试验，获 得国家的药品生产许可证，方能使用； 生产性能测定； 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、温度、 pH值、提取工艺等； 经自然界分离筛选获得的有价值的菌种进一步进行人工 选育。
具体方法： 在固体选择培养基中加入酶作用的底物培养微生物，能够 利用此底物的酶产生菌得以生长，并且往往会在其菌落周 围形成一透明圈。 透明圈的大小与酶活力的高低成正相关，可以作为菌种初 筛的判断标准。 如：蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤 维素酶等
22
目的微生物筛选方法的研究进展 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。 微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干 年的研究重点。 －－陈文新院士 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定 目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作 用。如 :16SRNA同源性分析，基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等。
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几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 抗病毒药物产生菌：用小平板测定由病毒引起的细胞 变性效果，是一种有用的筛选方法；检测病毒复制中 特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂，是另一 种选择性更高的筛选方法。
31
生长因子产生菌：通过观察分离菌能否促进营养 缺陷型菌株的生长来检出。 免疫激活剂产生菌：可以用细胞表面酶的抑制法， 筛选免疫激活剂产生菌； 多糖产生菌：可以通过菌落外观的观察来识别 （黏稠)
怎样种植菌类
怎样种植菌类种植菌类需要准备好适当的菌种，合适的培养基和相应的培养条件。
下面将详细介绍种植菌类的步骤和注意事项。
一、选择适当的菌种1. 菌种来源：可以选择自然界中的菌株、购买商业菌种或从其他实验室获取。
2. 菌株纯化：从菌落或分生孢子开始，通过无菌操作将单株菌落转接到新的培养基上，得到纯化的单菌落。
二、制备培养基1. 培养基种类：常用的培养基有琼脂培养基、液体培养基和固体培养基等。
根据不同的菌种选择合适的培养基。
2. 培养基成分：培养基成分包括碳源、氮源、矿物元素和生长因子等。
可以根据菌种要求进行配方调整。
三、接种方式1. 空气接种：将菌株培养在固体培养基上，利用空气中的孢子或菌丝将菌种传播到新的培养基上。
2. 液体接种：将菌株培养在液体培养基中，通过种子液或发酵液将菌种移植到新的液体培养基中。
四、培养条件1. 温度：不同菌种对温度的要求不同，一般培养温度为20-30。
可以根据菌株的生长速度和适应环境进行调节。
2. pH值：不同菌种对pH值的要求也不同，一般在5-8之间。
需要根据菌株的要求进行调节。
3. 湿度：菌类需要一定的湿度才能正常生长，可以通过添加适量的水分或在培养箱中使用湿度调节器来保持适当的湿度。
4. 光照：大部分菌类对光照要求不高，可以保持适度的暗光环境。
但也有一些菌种对光照有一定的需求，需要根据菌株的要求进行调节。
五、培养器具和消毒1. 培养器具：常用的培养器具包括培养皿、试管、瓶子、无菌棉签、无菌注射器等。
需要使用无菌器皿和无菌操作工具，避免微生物的污染。
2. 消毒：培养器具在使用前需要进行消毒处理，常用的消毒方法有高温蒸汽灭菌、化学消毒和紫外线照射等。
六、菌落观察与保存1. 菌落观察：菌株生长一段时间后，可以观察其在培养基上的菌落形态、颜色等特征，以及菌丝的生长情况。
观察菌落可以对菌株进行鉴定和分类。
2. 菌株保存：可以通过冷冻保存、干燥保存或分生孢子保存等方法对菌株进行长期保存，以备后续使用。
《菌种的来源》PPT课件 (2)
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
5
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
AK:天冬氨酸激酶
HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
24
菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
自然选育在工业生产上的意义
问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
25
菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
37
菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
DNA shuffling
Fragment
Reassemble
Select best
with DNAseI
X
X
XXX
XX
X
XX
fragments
XXX
X
X
XX
recombinants
XXX
X
XXX X
XXX X
XXX X
XX XXX X X X X X
XX X
X
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离
挑选单菌落(注意形态的观察)
发酵试验
26
菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为诱变育种
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
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菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
AK:天冬氨酸激酶
HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
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菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
自然选育在工业生产上的意义
问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
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菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
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菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
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自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离
挑选单菌落(注意形态的观察)
发酵试验
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菌种的来源
❖ 菌株选育、分子改造
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为诱变育种
菌种来源
2.1.1.2 待筛选样品的性质
2.l.1.3 筛选方案的设计 基本上可利用以下三种不同的筛选方法 1）整体生物； 2）完整细胞； 3）亚细胞制剂。
2..1.2微生物选择性分离的原理和发展
在过去40年间曾筛选出许多产生新的有用的次级 代谢物的菌种。这些菌种多半是以经验式的筛选方法 获得的。大多数的抗生素均由放线菌纲产生。下面介 绍放线菌纲为主的分离方法原理和发展。 选择性分离方法大致可分为五个步骤： 含微生物材料的选择；材料的预处理；所需菌种的 分离；培养；菌落的选择和纯化。以上任何一个阶段 都可引入选择压力。
通常采用膜过滤法浓缩水中的细胞。然后将滤膜 置于培养基的表面，放置乃个小时后移去，或一直留 在上面。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响， 如处理放线菌繁殖体含量很低的海水，有人先将样品 离心然后才过滤。
收集在腐烂的稻草和其它植物材料中的嗜热放线 菌孢子可在空气搅动下进行。并可用－风筒或一简单 的沉淀室收集孢子。然后，用Anderson取样器将空气 撞击在培养基的平板上。这样可以减少分离平板中的 细菌数目。
2.1.3.l 施加选择压力的分离方法
A 富集液体培养 富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量 的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利 于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件。通过 把富集培养物接种到新鲜的同一种培养基可以重新建 立选择压力。重复移植几次后接种少量已富集的培养 物到固体培养基上。这里，移种的时间是关键，应在 所需菌种占优势的情况下移种。
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关） 生产特性要符合工艺要求
2.1菌种的来源 2.1.1 生物物质产生菌的筛选 2.1.l.1 微生物——生物产物的来源 微生物现在和将来都是具有各种生物活性的 新产物的丰富资源。这一章的目的是要研究如 何才能筛选到具有所需生物特性的新产物。除 了初级代谢产物，如氨基酸和维生素外，微生 物还用于生产许多次级代谢产物。筛选这类产 物的两个成功要素在于 1）产生菌的选择； 2）采用什么样的筛选方案（检测系统）。 选择筛选方法有两个要点即选择性和灵敏度。
第二章 生产菌种的来源
4、其他防线菌生产的抗生素
其他生产的抗生素的防线菌有： 诺卡氏 其他生产的抗生素的防线菌有 ： 菌 形 放 线 菌 （ Nocardioform Actinomycetes ） 、 游 动 放 线 菌 （ Actinoplanetes ） 及 足 分 枝 菌 （Maduromyetes）。
5、青霉属（Penicillum） 青霉属（
6、粘细菌（Myxobacteria） 粘细菌（
粘细菌次级代谢产物中抗菌活性物质的检 出率非常高，并且许多都是新发现的抗生素。 出率非常高 ， 并且许多都是新发现的抗生素 。 如纤维素堆囊菌（ 如纤维素堆囊菌 （ Sorangium cellulosum ） 产 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、
四、有机酸
柠檬酸 :黑曲霉 ,酵母 (解脂假丝酵母 、解脂 复膜孢酵母季也蒙假丝酵母 ） 乳酸 ：德氏乳杆菌 、赖氏乳杆菌 、植物乳杆 菌 、米根霉 苹果酸 ：黄曲霉 、米曲霉 、寄生曲霉 、华根 无根根霉、 霉 、无根根霉、膜醭毕赤酵母 衣康酸 ：土曲霉 、衣康酸曲霉、假丝酵母S-10 衣康酸曲霉、假丝酵母S
青霉菌属于腐生菌， 青霉菌属于腐生菌，广泛生存于土壤和 腐败的水果和蔬菜中。 腐败的水果和蔬菜中。 由于第一个工业化生产的抗生素青霉素是 中发现的， 由青霉属中的Penicillum notatum中发现的， 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 用途最广的抗生素， 用途最广的抗生素，因此青霉素在抗生素工 业中具有特别重要的地位。 业中具有特别重要的地位。
纤维素酶
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的 总称。它不是单种酶， 总称。它不是单种酶，而是起协同作用的多组分 酶系。 酶系。 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、梭状芽孢杆菌 等也能产生纤维素酶。 等也能产生纤维素酶。
菌种的来源—母种转管技术(食用菌生产技术课件)
置于恒温培养箱中避光培养。
5
作物生产技术 母种转管过程中需要注意的事项
注意：
原老种块勿再接入，接种种块不易太大。 试管口离开酒精灯火焰的无菌区范围。 试管口、瓶口尽量向下轻斜。 提前备好无菌棉塞，以更换受潮的棉塞。 转管过程中人员在接种室内不要走动。 及时清除杂物，保持台面干净清洁。
食用菌生产技术
作物生产技术
食用菌生产技术
项目二 菌种的来源
任务三 母种转管技术
1
作物生产技术 母种转管的概念
母种转管是指将分离培养成的 母种菌丝体，无菌操作移接于另外 空白试管培养基上，这个操作过程 叫做转管或转代。
食用菌生产技术
转管操作流程图
2
作物生产技术 母种转管所需要用到的设备与用具
食用菌生产技术
1.超净工作台 2.酒精灯 3.接种钩 4.接种铲 5.75%酒精棉球 6.95%酒精 7.工具支架 8.PDA斜面培养基 9.平皿
6
3
作物生产技术 无菌操作规程
要点：
接种环境消毒灭菌 提前开启超净工作台及 紫外线灯
换好工作服，清洗双手
酒精棉球消毒双手
试管口靠近灯焰；转管 动作快，时间勿太长。养
食用菌生产技术
试管每7支或10支一捆，贴好 标签，注明品种名称及日期等， 使用牛皮纸将棉塞端包好。
菌种来源ppt课件
➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况下 进行。
精选ppt
14
五、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一）
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步 分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或 利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法 精选ppt 生长圈法
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
3、菌的稳定性
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度
5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性
6、容易从培养液中回收产物
3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便
有希望成为效益高的生产菌株
精选ppt
6
三、含微生物样品的采集
土壤较（复丰杂富、；5应-2根5cm据、分土离质目、酸的碱灵度活、掌植握被状况、地理条件、季节）
分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：
样品采集
增殖培养
纯种分离
生产性能测定
精选ppt
3
调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计
序筛 选
采样
工
增殖条件探索
第一次增殖培养
作
第一次平板分离 第二次增殖培养
程
第一次原种斜面
根据实际情况进 行定量或半定量 测定
第二次平板分离 第二次原种斜面
定量或半定量测定
初筛精（选1pp株t 1瓶）
精选ppt
13
➢ 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。
控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 高如温分下离培真养菌可可将在土嗜豆热培微养生基物中加和入非链嗜霉热素微； 生物分开； ➢质控，需制从注分p而H离意可改细，菌分变所或离选需放嗜择菌线酸压菌型或力可生在嗜。长培碱的养微结基生中果物加有入；时制会霉改菌素变等培养基的性 ➢高重糖复或移高植盐几培次养后基接可种分少离量耐已高富渗集透的压培微养生物物到；固体培养 基上。
精选ppt
14
五、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一）
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步 分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或 利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法 精选ppt 生长圈法
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
3、菌的稳定性
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度
5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性
6、容易从培养液中回收产物
3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便
有希望成为效益高的生产菌株
精选ppt
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三、含微生物样品的采集
土壤较（复丰杂富、；5应-2根5cm据、分土离质目、酸的碱灵度活、掌植握被状况、地理条件、季节）
分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：
样品采集
增殖培养
纯种分离
生产性能测定
精选ppt
3
调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计
序筛 选
采样
工
增殖条件探索
第一次增殖培养
作
第一次平板分离 第二次增殖培养
程
第一次原种斜面
根据实际情况进 行定量或半定量 测定
第二次平板分离 第二次原种斜面
定量或半定量测定
初筛精（选1pp株t 1瓶）
精选ppt
13
➢ 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。
控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开； 在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性 高如温分下离培真养菌可可将在土嗜豆热培微养生基物中加和入非链嗜霉热素微； 生物分开； ➢质控，需制从注分p而H离意可改细，菌分变所或离选需放嗜择菌线酸压菌型或力可生在嗜。长培碱的养微结基生中果物加有入；时制会霉改菌素变等培养基的性 ➢高重糖复或移高植盐几培次养后基接可种分少离量耐已高富渗集透的压培微养生物物到；固体培养 基上。
生产菌种的选育培养—生产菌种的选育方法
2. 假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）
3. 毕赤酵母属（Pichia） 含丰富的蛋白质、维生素、酶，制造单细胞蛋白、酿酒
霉菌及其代谢产物
1. 曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus）
细菌及其代谢产物
醋杆菌属（Acetobacter）：醋酸、山梨醇 乳杆菌属（Lactobacillus）：乳酸、乳制品 芽孢杆菌属（Bacillus）：丙酮、乙醇、丁醇、淀粉 酶、蛋白酶、果胶酶
假单胞菌属（Pseudomonas ）：维生素B12、色素 黄单胞菌属（Xanthomonas）：维生素B12、黄原胶
2. 青霉属（Penicillum） 3. 根霉属（Rhizopus ）
米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis） 4. 红曲霉属（Monascus）
其它微生物
1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom） 2. 藻类（alga）
工业生产中对菌种的要求：
第二节 生产菌种的选育方法
菌种的来源：
●根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； ●从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
菌种选育的目的：改良菌种的特性，符合生产的需要。
菌种选育
选种 育种
方法：
选种——分离筛选 育种——诱变或杂交
一、发酵工业中的常用微生物
1、细菌 2、放线菌 3、酵母菌 4、霉菌
原生质体融合
1. 去除细胞壁。
2. 通过一定的手段 促使两个原生质 体融合。
代谢控制育种
原理：通过目的产物的生物合成途径、遗传控制及代谢调节机制的研究， 进行定向诱变，提高诱变效率。
3. 毕赤酵母属（Pichia） 含丰富的蛋白质、维生素、酶，制造单细胞蛋白、酿酒
霉菌及其代谢产物
1. 曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus）
细菌及其代谢产物
醋杆菌属（Acetobacter）：醋酸、山梨醇 乳杆菌属（Lactobacillus）：乳酸、乳制品 芽孢杆菌属（Bacillus）：丙酮、乙醇、丁醇、淀粉 酶、蛋白酶、果胶酶
假单胞菌属（Pseudomonas ）：维生素B12、色素 黄单胞菌属（Xanthomonas）：维生素B12、黄原胶
2. 青霉属（Penicillum） 3. 根霉属（Rhizopus ）
米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis） 4. 红曲霉属（Monascus）
其它微生物
1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom） 2. 藻类（alga）
工业生产中对菌种的要求：
第二节 生产菌种的选育方法
菌种的来源：
●根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； ●从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
菌种选育的目的：改良菌种的特性，符合生产的需要。
菌种选育
选种 育种
方法：
选种——分离筛选 育种——诱变或杂交
一、发酵工业中的常用微生物
1、细菌 2、放线菌 3、酵母菌 4、霉菌
原生质体融合
1. 去除细胞壁。
2. 通过一定的手段 促使两个原生质 体融合。
代谢控制育种
原理：通过目的产物的生物合成途径、遗传控制及代谢调节机制的研究， 进行定向诱变，提高诱变效率。
第2章 菌种的来源
第二章 菌种的来源
• 菌种的分离 • 培养分离
发酵工业对菌种的要求
原料廉价，所需代谢产物产量高； 培养条件易控制； 生长迅速，发酵周期短； 抗噬菌体和杂菌的能力强； 遗传性状稳定，不易变异退化； 发酵过程中的泡沫少； 对添加的前体物有耐受能力；并不能利用前体物作为 一般碳源； • 产物对菌株无反馈抑制； • 不是病原菌。 • • • • • • •
5.采好的样应及时处理， 5.采好的样应及时处理，暂不能处理的也 采好的样应及时处理 应贮存于4℃ 4℃下 但贮存时间不宜过长。 应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。 这是因为一旦采样结束， 这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境， 物群体就脱离了原来的生态环境，其内 部生态环境就会发生变化， 部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的 、采样季节：以温度适中， 秋初为好。 秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小 、采土方式：在选好适当地点后， 铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土 铲子除去表土 ， 取离地面 处的土 约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， 扎好， 标记， 记录采样时间、 地点、 扎好 ， 标记 ， 记录采样时间 、 地点 、 环 境条件等， 以备查考。 境条件等 ， 以备查考 。 为了使土样中微 生物的数量和类型尽少变化， 生物的数量和类型尽少变化 ， 宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。 逐步分批寄回，以便及时分离。
3．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的 干净、 干净 广口塑料瓶中。 广口塑料瓶中。 • 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静 由于表层水中含有泥沙， 水层中采集水样。 水层中采集水样。 • 方法是 ： 握住采样瓶底浸入水中 方法是： 握住采样瓶底浸入水中30-50cm处 ， 然后 处 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在 的话，应直接将瓶口反向于急流。 的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取 出时应迅速并带有较大的弧度。 出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样 所有水样都应在24h之内迅速进行检测， 或者 之内迅速进行检测， 瓶 。 所有水样都应在 之内迅速进行检测 4℃下贮存。 ℃下贮存。
• 菌种的分离 • 培养分离
发酵工业对菌种的要求
原料廉价，所需代谢产物产量高； 培养条件易控制； 生长迅速，发酵周期短； 抗噬菌体和杂菌的能力强； 遗传性状稳定，不易变异退化； 发酵过程中的泡沫少； 对添加的前体物有耐受能力；并不能利用前体物作为 一般碳源； • 产物对菌株无反馈抑制； • 不是病原菌。 • • • • • • •
5.采好的样应及时处理， 5.采好的样应及时处理，暂不能处理的也 采好的样应及时处理 应贮存于4℃ 4℃下 但贮存时间不宜过长。 应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。 这是因为一旦采样结束， 这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境， 物群体就脱离了原来的生态环境，其内 部生态环境就会发生变化， 部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的 、采样季节：以温度适中， 秋初为好。 秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小 、采土方式：在选好适当地点后， 铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土 铲子除去表土 ， 取离地面 处的土 约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， 扎好， 标记， 记录采样时间、 地点、 扎好 ， 标记 ， 记录采样时间 、 地点 、 环 境条件等， 以备查考。 境条件等 ， 以备查考 。 为了使土样中微 生物的数量和类型尽少变化， 生物的数量和类型尽少变化 ， 宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。 逐步分批寄回，以便及时分离。
3．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的 干净、 干净 广口塑料瓶中。 广口塑料瓶中。 • 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静 由于表层水中含有泥沙， 水层中采集水样。 水层中采集水样。 • 方法是 ： 握住采样瓶底浸入水中 方法是： 握住采样瓶底浸入水中30-50cm处 ， 然后 处 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在 的话，应直接将瓶口反向于急流。 的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取 出时应迅速并带有较大的弧度。 出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样 所有水样都应在24h之内迅速进行检测， 或者 之内迅速进行检测， 瓶 。 所有水样都应在 之内迅速进行检测 4℃下贮存。 ℃下贮存。
第二章 菌种的来源 (新)
2011-6-27
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问题： 问题：
生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生 微生物（包括动、植物细胞） 产我们所需的一切产品， 产我们所需的一切产品，但是涉及到工业 化生产对于某一种特定的产品， 化生产对于某一种特定的产品，只有特 才具有大量表达的潜力。 定的微生物才具有大量表达的潜力。
基因的直接进化： 基因的直接进化：
点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等
2011-6-27
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四、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、 (1977 枯草牙胞杆菌沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞) 酵母(既是微生物又是真核细胞)
谷氨酸发酵的菌种：
棒杆菌属，短杆菌属、 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属 或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 其它氨基酸生产菌：
常规菌种一般也是以谷氨酸生 产菌选育而成；工程菌， 产菌选育而成；工程菌，大肠 杆菌， 杆菌，枯草芽孢杆菌
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三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。 FDA的批准 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已 同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草 淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、 牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌
发酵工程菌种的来源
提高发酵产品质量：通过保藏和管理，可以保证发酵产品的质量和产量， 提高经济效益。
促进科学研究：通过保藏和管理，可以积累大量的菌种资源，为科学研究 提供重要的材料。
感谢您的观看
汇报人：XX
霉菌是一种真 菌，广泛存在
于自然界中
霉菌在发酵工 业中具有重要 的应用价值， 如酿酒、制醋、
制酱等
霉菌的种类繁 多，常见的有 曲霉、青霉、
红霉等
霉菌的生长条 件包括温度、 湿度、氧气等， 需要适宜的环 境才能生长繁
殖
细菌
乳酸菌：用于乳制品、饮料、食品 等发酵
霉菌：用于酱油、醋、腐乳等发酵
添加标题
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基因重组：通过 基因工程将目标 菌株中的基因进 行重组，实现基 因的优化和表达
菌种改良：通过 基因转移和基因 重组，实现菌种 的改良和进化， 提高菌种的性能 和产量
应用领域：基因 转移和基因重组 育种在发酵工程、 生物制药、环境 保护等领域具有 广泛的应用前景
代谢工程和系统生物学在菌种改良中的应用
菌种管理规定和操作规范
菌种来源：实验室、 自然环境、其他来 源
菌种保藏：低温、 干燥、无菌等条件
菌种管理：定期检 查、记录、更新等 操作
操作规范：无菌操 作、避免污染、正 确使用等要求
菌种保藏和管理的意义和作用
确保菌种活性：通过保藏和管理，可以保持菌种的活性和稳定性，提高发 酵效率。
防止污染：通过保藏和管理，可以防止菌种受到其他微生物的污染，保证 发酵过程的顺利进行。
03 基因工程菌种的构建
基因工程菌种的概念和意义
基因工程菌种：通过基因工程技术 改造微生物，使其具有特定的功能 或特性
意义：基因工程菌种的构建可以提 高发酵效率、改善产品质量、降低 生产成本，具有重要的经济和社会 价值
促进科学研究：通过保藏和管理，可以积累大量的菌种资源，为科学研究 提供重要的材料。
感谢您的观看
汇报人：XX
霉菌是一种真 菌，广泛存在
于自然界中
霉菌在发酵工 业中具有重要 的应用价值， 如酿酒、制醋、
制酱等
霉菌的种类繁 多，常见的有 曲霉、青霉、
红霉等
霉菌的生长条 件包括温度、 湿度、氧气等， 需要适宜的环 境才能生长繁
殖
细菌
乳酸菌：用于乳制品、饮料、食品 等发酵
霉菌：用于酱油、醋、腐乳等发酵
添加标题
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基因重组：通过 基因工程将目标 菌株中的基因进 行重组，实现基 因的优化和表达
菌种改良：通过 基因转移和基因 重组，实现菌种 的改良和进化， 提高菌种的性能 和产量
应用领域：基因 转移和基因重组 育种在发酵工程、 生物制药、环境 保护等领域具有 广泛的应用前景
代谢工程和系统生物学在菌种改良中的应用
菌种管理规定和操作规范
菌种来源：实验室、 自然环境、其他来 源
菌种保藏：低温、 干燥、无菌等条件
菌种管理：定期检 查、记录、更新等 操作
操作规范：无菌操 作、避免污染、正 确使用等要求
菌种保藏和管理的意义和作用
确保菌种活性：通过保藏和管理，可以保持菌种的活性和稳定性，提高发 酵效率。
防止污染：通过保藏和管理，可以防止菌种受到其他微生物的污染，保证 发酵过程的顺利进行。
03 基因工程菌种的构建
基因工程菌种的概念和意义
基因工程菌种：通过基因工程技术 改造微生物，使其具有特定的功能 或特性
意义：基因工程菌种的构建可以提 高发酵效率、改善产品质量、降低 生产成本，具有重要的经济和社会 价值
02 菌种选育
02 菌种选育本章内容：第一节菌种的来源2.1.1 生物物质产生菌的筛选2.1.1.1 M—生物产物的来源M是各种生物活性产物的丰富资源，要获得所需生物特性的新产物，关键是：①、选择M；②、筛选方案(检测系统)。
M细胞内含物及其培养基成分极其复杂，且所需的产物可能每毫升只有微克到毫克，在选择筛选方法时必须考虑选择性和灵敏度两个方面，即需灵敏度很高的专一性检测方法。
2.1.1.2 待筛选样品的性质寻找新产物的产生菌可用固体或液体培养基筛选。
但次级代谢物的大规模生产是用沉没培养法进行的，由于在固体培养基和液体培养基中产生的次级代谢物的方式不一样，因此有些研究人员以液体培养法为惟一的筛选手段。
2.1.1.3 筛选方案的设计基本上可利用以下三种不同的筛选方法：①、整体生物；②、完整细胞；③、亚细胞制剂。
2.1.2 M选择性分离的原理和方法大多数抗生素均由放线菌产生。
下面介绍放线菌为主的分离方法原理的发展。
选择性分离方法大致可分为五个步骤：①、含M材料的选择；②、材料预处理；③、所需菌种分离；④、菌种培养；⑤、菌种选择和纯化。
以上任何一个阶段都可引人选择压力。
2.1.2.1 含M材料的选择在选择菌种来源时，存在一些选择标准。
对于天然材料，如土壤的选择，来源越是广泛的样品，含有目的类型的M的可能性越大，获得新菌种的可能性越高；另一方面，可寻找已适应相当苛刻的环境压力的M类群。
这种方法已获得某些成功(见表2-1)。
从被污染的实验室培养基中分离出嗜盐菌(Actinopolyspora halophila)，从盐场分离出嗜盐链霉菌，说明在富盐环境中存在一类尚待开发的放线菌。
酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的放线菌类群有很大不同。
因此，也有可能利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。
自然环境的菌群可因人类的活动而改变。
于土壤中加入去莠津(atrazine)会导致放线菌菌群数量的增加。
如诺卡氏菌属能生长在Carboxanilide杀真菌剂中。
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BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹
长江大学生科院生物工程系
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国外菌种保藏机构
ATCC(American Type Culture Collection）美 国典型菌种保藏中心 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本 技术评价研究所生物资源中心 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 UKNCC (The United Kingdom National Culture Collection ) 英国国家菌种保藏中心
2018年10月18日星期四
ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 SIA 四川抗菌素工业研究所 AS 中国科学院微生物研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 YM 云南省微生物研究所 CCTCC 中国典型培养物保藏中心 CMBGCAS 海洋微生物中心 CUHK 香港中文大学保藏中心
国内菌种保藏机构27
ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CIVBP 中国兽医药品监察所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心 HKUCC 香港大学保藏中心
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人工诱变 的菌株不 能合成 反 馈 抑
高丝氨酸脱氢酶
不能合成
可以大量 积累
制
2018年10月18日星期四
人工诱变控制黄色短杆菌 长江大学生科院生物工程系 的代谢过程生产赖氨酸P459
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氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚； 代谢途径比较简单。 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌。 其它氨基酸生产菌：常规菌种一般是以谷氨酸生产菌选 育而成；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌， 工程菌。
初级代谢和次级代谢异同？
1 概念不同 2 产物不同 3 存在范围不同 4 对微生物的作用不同 5 同微生物生长过程的关系 6 对环境条件的敏感性或遗传稳定性上明 显不同 7 相关酶的专一性不同 8 两者既有区别性又有连续性
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系 5
2、氨基酸生产有关的微生物
50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵， 是发酵工业发展历史上的一个转折点。
代谢控 制发酵
用人工诱变的方法，有意识地改变微生物 的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵
形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵 中得到成功应用。
2018年10月18日星期四
长江大学生科院生物工程系
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二、微生物材料的标本采集
遵循原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种 一般通过以下途径获得菌种： ①向菌种保藏机构索取有关菌株； ②由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等； ③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离 蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生 菌。
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系 12
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系 8
3、酶制剂生产有关的微生物
利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉 通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始 于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产α —淀粉酶。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌 和地衣芽孢杆菌等； β-淀粉酶：米曲霉、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌等； 纤维素酶：木霉、青霉； 蛋白酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌等。
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系 1
内容速览
2.2目的微生 物的分离 2.1工业化 菌种的要 求及介绍 1自然 选育
2.3菌 种选育 （链）
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系
2诱变 育种
2
§1 工业化菌种的要求及
已工业化产品生产菌介绍
一、工业化菌种的要求 P51
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系 9
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§2 自然界程 二、微生物材料的标本采集 A、不同的土壤特点 B、地理和气候条件 C 、微生物的生理特性 D 、极端环境条件下采样分离 三、标本的预处理 四、目的微生物富集的一些基本方法
2018年10月18日星期四
二、已工业化产品生产菌介绍
1、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物P40，需要生物体进行复杂的代 谢，目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素、四 环素、红霉素等） 真菌（青霉素、头孢菌素等）
一些产芽孢的细菌（多 黏菌素、丁胺菌素等） 植物或动物来源（蒜素、番 茄素、鱼素等）
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第二章 菌种的来源(4学时)
教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生
产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注 意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本 特性和菌种的选育。
教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点
、地理和气候条件，土样的采集方法； 生化反应分离法； 诱变育种。
能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；
遗传性能要相对稳定；
菌种改造的可操作性要强；
抗噬菌体及杂菌污染能力强；
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好 与致病菌无关）；
发酵条件如温度、pH、溶解氧、泡沫等易控制。
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系 3
五、菌种分离
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一、菌种分离的一般过程 P14
标本采集 → 预处理 → 富集培养 → 菌种分离（初筛、复筛） → 发酵性能鉴定 → 菌种保藏 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大？ 如何在后续的操作中使这种可能性实现？
2018年10月18日星期四 长江大学生科院生物工程系 11