第七章肠道致病菌检验与鉴定
肠道致病菌微生物学检查简述
• 然后观察下层
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• （3）肠道致病菌的分离鉴定 • ①标本收集 • ②分离培养 • ③初步鉴定 • ④血清学鉴定 • ⑤生化反应
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标本 ？和球菌的不同
选择鉴别培养基 SS平板
双糖管等
37℃
24h
生化反应
粪便标本肠道致病菌 分离鉴别流程
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示教：生化反应举例
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糖发酵试验(fermentaton test)
示教：单第1糖4页发/酵共2管9页
甲基红试验（methyl red test）
-
+
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VP（Voges-Proskauer）试验
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-+
+
-
－
+
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Urease Test 尿素酶试验
：
H2S Production
硫化氢试验
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-+
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IMViC试验(Indole Test; Methyl Red (MR) Test; Voges-Proskauer (VP) Test; Citrate Utilization Test)
大肠埃希菌 ＋ ＋ － － 产气杆菌 － － ＋ ＋
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EMB（Eosin Methyl Blue)平板 ——分离肠道病原菌的弱选择培养基
病原菌:透明,无色，小菌落 非致病菌:紫黑色
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克氏双糖培养基
乳糖 硫酸亚铁 固体 葡萄糖 半固体 指示剂:酚红
7-3第七章食品微生物检验-大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌计数
（一）大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌
1、大肠菌群
在一定培养条件下(一般是37℃24小时)能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌 氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。（GB4789.3—2010）
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与 粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌， 这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这 群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌 和阴沟肠杆菌等。
2、粪大肠菌群
• 根据生长温度的差异，将能在37C生长的称为总 大肠菌群，而在44.5C仍能生长的大肠菌群称为 耐热大肠菌群(thermo-tolerant coliform group) 或 粪大肠菌群（faecal coliform Fc），在人和动物 粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。 因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直 接和贴切，主要就是大肠艾希氏菌，但也包括克 雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使 其与粪便污染的相关性受到了影响。
3)大肠艾希氏菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示 着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近 年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠艾希氏菌检测作为微生物污 染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
4)大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但 用途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况 的通用指标，粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠 杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。作为粪便污染的指示 菌，大肠埃希菌检出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检 出意义略差一些。
医学微生物中粪便标本肠道致病菌的鉴别流程
医学微生物中粪便标本肠道致病菌的鉴别流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copyexcerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!医学微生物中粪便标本肠道致病菌的鉴别流程一、准备工作阶段。
肠道致病菌的分离与鉴定
肠道致病菌的分离与鉴定一、实验目的(1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤(2)掌握平板划线分离法(3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义二、实验材料(1)实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、(2)实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基三、实验流程(1)肠道致病菌的分离①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。
②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMBt养基。
将培养基置于37C培养18~24小时。
(2)肠道致病菌的纯化①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37 C培养18~24小时。
②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。
（3）肠道致病菌的鉴定①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KIA 培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养18~24小时。
取出并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养18~24小时。
取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。
（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。
常见肠道致病菌的分离与鉴定
6.副溶血弧菌
将粪便标本接种于弧菌增菌液中，6~8小时接种 TCBS平板，同时接种TCBS平板，35°C培养18~24 小时，检查有无呈绿色或蓝色中心，圆形，直径 2~3mm的菌落，挑取可疑菌落接种克氏双糖铁和尿 素动力靛基质培养基进行初步生化鉴定，最后采用 商品化鉴定系统鉴定至种。
7.艰难梭菌
二、培养与鉴定
医院中引起的腹泻一般不会是感染了食源性病原 菌引起，故对于住院超过3天的患者的粪便标本不 进行常规培养，除非是为了分离艰难梭菌和测定毒 素以诊断抗生素相关性腹泻。
1．沙门、志贺菌属菌培养
黏液、脓血便接种于SS琼脂平板或XLD琼脂平板和麦 康凯（MAC）琼脂平板（或中国蓝琼脂平板）以及血平板， 35℃孵育18～24小时，挑取不发酵乳糖菌落，至三糖铁琼 脂初步观察生化反应并进行血清学凝集试验。可根据生化反 应结果初步判断细菌菌属，再根据血清学鉴定结果鉴定至种
不染色标本
1．霍乱弧菌感染 标本呈米泔样或洗肉水样，镜检发现逗点状或弯曲 状的弧菌，呈流星样穿梭，运动活泼。加入O1群或O139群霍乱弧菌 多价诊断血清，大于80%的细菌停止运动或运动明显减弱 2．弯曲菌感染 呈S形、螺旋形并快速、拧塞样或投镖样运动的细菌 3．酵母样真菌感染 高倍镜发现光亮的卵圆形孢子或假菌丝
标本的运送
1．标本采集后应尽快送检 室温保存≤2小时 2．特殊细菌 艰难梭菌培养标本在4℃环境≤ 24小
时；弯曲菌与弧菌的标本需加入CaCl2(100mg/L) 3．置于运送培养基中的直肠拭子保存时间室温≤
24小时
标本验收
检查申请单信息填写是否完整、正确，包括标 本采集时间、采集方式、抗生素使用情况、标本 量是否足够、标本容器有无渗漏等
标本拒收
1．粪便标本放置时间超过2小时 2．成形粪便或粪便标本混有尿液 3．粪便标本量过少、干涸或保存不当 4．直肠拭子未置于运送培养基中应及时与临床医师联系， 说明原因，要求重新留取标本送检
化脓性球菌和粪便标本肠道致病菌的鉴定流程
化脓性球菌和粪便标本肠道致病菌的鉴定流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!肠道致病菌包括多种细菌，其中化脓性球菌是一类常见的病原菌，对其进行鉴定是临床微生物学工作中的重要任务之一。
化脓性球菌、粪便标本肠道致病菌的鉴定流程
化脓性球菌、粪便标本肠道致病菌的鉴定流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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实验肠道致病菌分离鉴定
镜检：球阳杆阴 阳紫阴红
第9页，本讲稿共22页
葡 萄 球 菌
链 球 菌
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（2）触酶实验
原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过O2
2H2O+O2
操作步骤：
在洁净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与
生理盐水中乳磨均匀，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3 ％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。
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观察上次实验结果、进行分析
紫外线杀菌实验
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抗生素敏感试验
抑菌圈直径
第5页，本讲稿共22页
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形成， 敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm：极度敏感 5-20mm：中度敏感
10-15mm：轻度敏感
<10mm: 不敏感 无抑菌圈: 耐药
本次试验以粪便为标本进行肠道菌的分离鉴定。粪便标 本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以及大肠杆菌 等肠道菌，要求从标本中分离出单一的致病菌，并通过后 续的试验鉴定出致病菌。
第17页，本讲稿共22页
S.S琼脂培养基
S.S琼脂培养基中含有胆盐、煌绿和枸橼酸钠等成分 ，不仅能抑制G+菌的生长，也能抑制肠道非致病菌的 生长。
第13页，本讲稿共22页
2）操作：玻片法
▪ 取干净玻片一块
▪ 血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端
▪ 用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血浆充 分混匀
▪ 结果观察：30秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑浊，而 兔血浆则呈块状或颗粒状者为阳性。
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（4）甘露醇试验或血清肉汤接种
1）甘露醇发酵试验：
肠道细菌鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握肠道细菌分离和鉴定的基本原理和方法。
2. 了解肠道细菌的生理生化特性，提高对常见肠道细菌的识别能力。
3. 通过实验，提高无菌操作和实验技能。
二、实验原理肠道细菌是人体肠道内的一类微生物，主要包括厌氧菌和需氧菌。
本实验采用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化肠道细菌，通过观察菌落特征和进行生理生化实验，对分离得到的细菌进行鉴定。
三、实验材料1. 实验动物粪便样本2. 肠道细菌通用培养基3. 血琼脂平板4. 琼脂平板5. 肉汤培养基6. 生理盐水7. 稀释液8. 接种环、接种针、酒精灯、培养皿、试管、试管架等四、实验步骤1. 样品制备：取粪便样本，用生理盐水进行稀释，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4等不同浓度的稀释液。
2. 平板划线法分离：取血琼脂平板，用无菌接种环蘸取稀释液，在平板上划线，重复划线直至获得单菌落。
3. 纯化：将单菌落挑取至新的血琼脂平板上，重复划线直至得到纯化的菌落。
4. 菌落特征观察：观察菌落的形态、颜色、大小、边缘、表面等特征。
5. 生理生化实验：a. 观察细菌的革兰氏染色结果。
b. 进行糖发酵实验，观察细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖等糖类的发酵情况。
c. 进行吲哚实验，观察细菌是否能产生吲哚。
d. 进行甲基红实验，观察细菌发酵糖类后产酸情况。
e. 进行V-P实验，观察细菌是否能进行丙酮酸发酵。
6. 鉴定：根据菌落特征和生理生化实验结果，对分离得到的细菌进行鉴定。
五、实验结果与分析1. 菌落特征观察：实验共分离得到5种菌落，其中3种为圆形、红色、光滑、湿润的菌落，2种为圆形、无色、不透明、干燥的菌落。
2. 生理生化实验结果：a. 革兰氏染色：3种菌落为革兰氏阳性菌，2种菌落为革兰氏阴性菌。
b. 糖发酵实验：3种菌落能发酵葡萄糖，2种菌落不能发酵葡萄糖。
c. 吲哚实验：3种菌落产生吲哚，2种菌落不产生吲哚。
d. 甲基红实验：3种菌落发酵葡萄糖后产生有机酸，使培养基变红，2种菌落发酵葡萄糖后不产生有机酸。
医学微生物中粪便标本肠道致病菌的鉴别流程
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第七章肠道致病菌的检验与鉴定
5、沙门氏菌哪几个菌型具有Vi抗原，Vi抗原对O抗 原血清涟试验有何影响，对含Vi抗原菌，如何做O 抗原血清学试验。
6、沙门氏菌在SS平板，TSI培养基上生长的现象如 何，说明其原理。
7、分离纯化后怎样选用最少的生化试验方法初步鉴 定检验菌是否是沙门氏菌属的细菌。
8、如何进行沙门氏菌的血清学试验。
赖氨酸脱羧E（+），补做ONPE试验，可判定沙门 氏 菌 属 和 埃 希 氏 菌 属 （ ONPE （ - ） 为 沙 门 氏 菌 ， ONPE（+）大肠艾希氏菌
5、血清学试验（最后鉴定）
（1）、沙门氏菌诊断血清的种类： 10种组合血清：主要用于伤寒和副伤寒沙门氏菌鉴
定 26种组合血清：常见致病菌的定群与分型 57种组合血清：常见定型，初步鉴定A—F群以外
（3）属外抗原关系：
志贺氏菌与艾希氏菌属的O抗原关系 非常密切，除A群9型和D群宋氏菌与埃氏 希菌的O抗原关系未见报道外，每一个型 都与一定的艾希氏菌的O抗原有关。
4、K抗原对O抗原血清学试验的影响
可阻碍O抗原的血清学凝集试验，煮沸 处理即可。
（五）志贺氏菌的抵抗力
• 志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志 贺氏菌最弱。
－
-
B
1～6 1a、1b、2a、 +
-
x、y变种 2b、3a、3b
3c、4a、4b
鲍氏菌 宋内氏菌
C 1 ～ 15
D
1
+
-
+
＋
甘露醇-
葡萄糖+
甘露醇+
靛基质- 靛基质+
乳糖-
乳糖+
靛基质-
靛基质+
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三、沙门氏菌食物中毒
（一）、引起食物中毒最常见的沙门氏菌：
鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌
（二）、易引起沙门氏菌中毒的食品 肉、蛋、乳类食品
行业关注：美国两种花生酱含沙门氏菌
第七章肠道致病菌检验与鉴定
(三)、中毒原因
1、食用病畜禽的肉制品食品 2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染 3、用不洁净水外理食品
第七章肠道致病菌检验与鉴定
第二节、沙门氏菌检验
一、概况 （一）沙门氏菌的发现与食物中毒 （二）沙门氏菌的命名
根据所致疾病命名 根据菌的发现地区命名 以发现者的名字命名 （三）沙门氏菌的抵抗力 60 ℃ 30′可杀死
第七章肠道致病菌检验与鉴定
（四）沙门氏菌的分类地位及定义
1、地位：是肠杆菌科、埃希氏菌族、沙门氏 菌属中的细菌
第七章肠道致病菌检验与鉴定
（四）、临床病状（所致病菌）
1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发热的菌血病。 由伤寒与副伤寒菌引起，潜伏期7~20天
2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发热、恶心、呕吐、 腹泻、出冷汗、及全身不适，病程2~3天
3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙 门氏菌等引起
第七章肠道致病菌检验与鉴定
第七章肠道致病菌检验与鉴定
第一节 概述
一、食品中常见的肠道致病菌
• 沙门氏菌 • 志贺氏菌 • 大肠艾希氏菌 • 变形杆菌 • 耶尔森菌
第七章肠道致病菌检验与鉴定
二、生物学特性
1、形态与染色 均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽胞，多数具有周身鞭毛
能运动，志贺氏菌属无鞭毛无动力。 2、培养和生化反应 （1）、需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培
第七章肠道致病菌检验与鉴定
第七章肠道致(沙病菌门检验氏与鉴菌定（红色）侵入人体细胞
2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好， 37 ℃，24h，能形成菌落中等大小，直径2～ 3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透 明，边缘整齐的菌落
3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无 菌膜。
第七章肠道致病菌检验与鉴定
四、微生物检验
（一）、基本步骤（程序） 检样→增菌（前增菌）→分离培养→生化
试验初步鉴定→血清学反应最后鉴定→报告
第七章肠道致病菌检验与鉴定
1、前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的M 恢复活力;
2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，基它细菌变到 抑制;
3、选择性平板分离培养：分离出所需的细菌; 4、生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目
第七章肠道致病菌检验与鉴定
3、H抗原（鞭毛抗原）
耐热性差：60℃15′或酒精处理可破坏
沙门氏H抗原有两种： 第 1 相 ： 特 异 相 ， 用 英 文 小 写 字 母 表 示 a 、 b 、 c……z
z1~z55 第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示1、2、3……其
中也有用小写字母a、n、x等表示。
第七章肠道致病菌检验与鉴定
（四）、抗原结构 主要两种：
A、O抗原 B、H抗原 C、表面抗原（K抗原） D、菌毛抗原
第七章肠道致病菌检验与鉴定
2 、O抗原 （1） O抗原的表示方法 共有58种，用字母O和阿拉伯数字标记：O1 、
O2 、O3、 O4 如： 伤寒杆菌： O9 、O12
第七章肠道致病菌检验与鉴定
2、定义 是肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及 抗原结构相似，被O1噬菌体裂解的一群革兰 氏阴性杆菌。
第七章肠Hale Waihona Puke 致病菌检验与鉴定二、生物学特性
（一）、形态与染色： 革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数
有鞭毛，有动力，短小杆菌。 （二）、培养特性
1 、 需 氧 或 兼 性 厌 氧 ， 最 适 温 度 37℃ ， PH7.2~7.4。
养基混浊生长。 （2）、肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳
糖、葡萄糖产酸或产酸产气。 （3）、可还原硝酸盐为亚硝酸盐。
第七章肠道致病菌检验与鉴定
三、抗原类型
O抗原 H抗原 K抗原
菌毛抗原
也称菌体抗原，细胞壁脂肪糖，耐热100℃不 被破坏
也称鞭毛抗原，鞭毛蛋白，不耐热，60℃ 30′可破坏
也称表面抗原（荚膜抗原），多糖，具有阻抑 O抗原发生凝集的现象，加热60℃30′可消除 抑阻作用
第七章肠道致病菌检验与鉴定
四、 致病性
（一）、致病物质 1、内毒素：能引起机体发热，白细胞减少，低血糖，
血压降低，严重者休克。 2、外毒素：对小肠粘膜细胞具有物殊毒害作用，引起
腹泻。
第七章肠道致病菌检验与鉴定
（二）、所致病疾 1、伤寒和副伤寒 2、食物中毒 3、细菌性痢疾
第七章肠道致病菌检验与鉴定
五、微生物检验的基本程序
检样→处理→增菌培养→分离培养→ 生化试验→血清学鉴定→报告
第七章肠道致病菌检验与鉴定
思考题
1、肠道致病菌具有哪些生物学特性? 2、肠道致病菌具有哪些抗原？又称为什么？有
什么特点？ 3、写出肠道致病菌检验的基本程序
第七章肠道致病菌检验与鉴定
4、表面抗原：
沙门氏菌有三种：Vi、M、5抗原、K抗原 Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清
学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃ 30′，100 ℃ 5′ 含有Vi 抗原的沙门氏菌：
伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌
第七章肠道致病菌检验与鉴定
（2）沙门氏菌的分群及表示方法 用大写字母及相关符号表示：
A、B、C、D、E、F ……Z、 O51 ~O63、 O65~ O67
第七章肠道致病菌检验与鉴定
（3）沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原 A群----O2 B群----O4 C群----O6 C1群----O7、 C2群---- O6 O8 、 C3群----O8 、 C4群----O6 O7 O14 D群----O9 F群----O11 E群----O3 E2群----O3、 O10族 E3群----O3、 O15 E4群----O1 、O3 、O19
（三）、生化特性 1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤
寒沙门氏菌少数不产气） 2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇 3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿
素（-），不产生乙酰甲基甲醇（V—P）（-）， 4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+） 5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱氨酸（-）