8.7印迹法

两部分工作
DNA 探针
变性 琼脂糖凝胶电泳
杂交
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
转移印迹 胶 膜
暴光
X-ray 片
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
Northern印迹杂交（Northern blot）。这是 一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜 上的方法。 DNA印迹技术称为Southern印迹技术，RNA 印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern 印迹杂交。
PVDF膜：
与尼龙膜相似，其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成 分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容 易被封闭。杂交本底低，结实耐用，可多次杂交。
3 印迹方法



虹吸印迹法 真空转移法 电转移法
(1)毛细管转移 本方法由Southern发明,故又称为Southern转移 (或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其 他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。
8.6
一、概述
印迹法
§印迹法（blotting）：将各种生物大分子从凝胶转 移到一种固定基质上的过程称为印迹技术 （blotting）。 §Southern在1975年首先提出了分子印迹的概
念。
二、类型
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
1 原理
RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的 RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，将 它们原位转移到固有膜上，在适宜的离子强度及 温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成RNA－ DNA杂交双链。
Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印 迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲 基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用 NaOH，因为它会水解RNA的2‘-羟基基团。RNA 变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合。
5、单链DNA探针： 利用M13噬菌体载体合成。 优点 无自我复性现象。 缺点 需再克隆到M13载体中 杂交体不如RNA探针稳定 技术难度大
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)

蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质利用 某种动力（毛细作用、扩散作用、电动力）， 有凝胶转移到固相膜上，然后利用探针，即特 异性抗体进行检测。
2、基因组DNA探针：
利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成 一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载 体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而 进入文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、 提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因 片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。PCR方 法也可制备DNA探针。在选择此类探针时要特别注意 真核基因组中存在的高度重复序列。要尽可能使用基 因的编码顺序（外显子）作为探针，而避免使用内含 子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序 列存在引起非特异性杂交而出现假阳性。
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting)
1、原理 硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附 能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理， 覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸 水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上 的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的， 即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经 过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与 对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记 的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显 影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋 白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的 表达。
抗原 一抗
标记
二抗
2、固相膜种类 1）硝酸纤维素膜（NC膜）


与蛋白质可能是通过疏水作用非共价结合。使 用时不需要活化，在p H8.0时，蛋白质比较容 易吸附于膜上。 问题是小分子量的蛋白质与NC膜的结合力较 差。
1 原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保 持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
4 步骤

待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜：

硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法

探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测
DNA 样品 限制性内 切酶消化
常用的固相支持物：硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等。 硝酸纤维膜： 是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的 吸附作用。RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于 结合到此膜上，尤其是在高盐浓度下，其结合能力可使 80-100μg/cm2吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依 靠疏水作用而吸附在膜上。 优点 杂交信号本底较低。 缺点 ①由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分 牢固，随杂交及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂 交信号下降。②对小分子量的DNA片段（<200bp）结 合能力不强。③靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移。 ④易破碎。
2）重氮化纤维素膜



有DBM和DPT两种，使用前必须活化才能使蛋白 质分子共价地结合在膜上。 优点：能确保低分子量的蛋白质与膜结合，并可 以一次印迹后，先后用多种探针分别检测。 缺点：比较粗糙，印迹效果没有NC膜好，接合量 也小于NC膜。由于活化后呈黄色，不适于酶法检 测。
3）阳离子化尼龙膜（Zeta－探针膜）
②
① ③
印迹实验
2、固有膜
1）特点 良好的固相支持物应具备的条件： 1. 具有较强的结合核酸分子的能力（>10μg/cm2）。 2. 与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反 应。 3. 与核酸分子结合牢固。 4. 非特异性吸附少。 5. 具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操 作。
2）种类

甲醛变性凝胶电泳
甲醛能与碱基结合形成具有一定稳定性的 加合物，阻止碱基配对。同时甲醛对蛋白质分 子中的亲和基团如胍基、巯基等具有一定反应 性，可以使酶失活，从而在电泳过程中有效抑 制RNase的作用。
3 特殊问题



电泳胶中不能加溴化乙啶，因RNA与溴化乙啶结 合后转移效率下降； 转移完毕后立即使膜干燥，固定RNA，这样RNA 不再对Rnase敏感； 固定以后，需要去处变性剂然后杂交，这样可以 提高杂交灵敏性。
4、RNA探针：
以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合 酶于体外转录而成。 优点 ①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。 ②单链，不存在变性和自我复性。 ③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。 ④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而 使本底降低。 缺点 RNA容易降解。
3、DNA探针：
由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成 cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体 中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、 酶切及纯化该cDNA片段即可。也可利用反向技术制备，即以mRNA 为模板逆转录合成第一链cDNA，然后加入一对相应于目的序列两 端的PCR引物进行PCR扩增，再电泳分离、纯化，即可得到特定的 cDNA片段。 优点 双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比 寡核苷酸探针高，杂交信号强。 缺点 由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现 象。
4 探针
定义：核酸探针是指能与特定核酸序列 发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言， 核酸探针带有特殊的标记物。
探针的类型：
1、寡核苷酸探针 2、基因组DNA探针 3、cDNA探针 4、RNA探针 5、单链DNA探针
1、寡核苷酸探针：
由实验者设计、经核苷酸合成仪合成。目前的合成仪均 可合成70-100bp长的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸 针长18-30bp。 优点： （1）制备方便，实验者可根据需要自行设计，避免了天然 核酸探针存在的高度重复序列。（2）由于大多数寡核苷 酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也 会显著影响影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点 突变分析。（3）比活度高，适用于大多数杂交，如DNA 序列测定、Sounthern、Northern原位杂交等。 缺点：探针短，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂 交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大； 探针特异性差，背景噪音也大。
(2)电泳转移。 将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。 该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较 大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控 制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采 用电泳转移。
(3) 真空转移 有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝 酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再 将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流 下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的 优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正 常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移 后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是 如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背 景比毛细转移要高。
2）电转移法

这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和 NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电 极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方 向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结 合到NC膜上。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。


两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠 层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传 统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电 压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积 缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸 透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相 比，这种方法要快（15-45 分钟）。
提取RNA
放射自显影
琼 脂 糖 凝 胶 变 性 电 泳 碱变性、转移到NC膜 与DNA或RNA探针杂交
2 常用的变性凝胶
变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素、 甲酰胺。尿素和甲酰胺会引起琼脂糖固化，故 只限于RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳。羟甲基汞 对RNA的变性作用是很理想的，但由于毒性太 大而不宜采用。 对于Northern杂交来说，乙二醛变性较甲 醛要好些，杂交后的条带较甲醛变性电泳清晰， 但在操作上较甲醛变性凝胶电泳困难一些，使 用最多的是甲醛变性凝胶电泳。

该膜对蛋白质有很高的结合力，可用来检测目 的蛋白含量很微的样品，也可已经多次杂交， 缺点是对封闭物浓度的要求较高。
4）DEAE

该膜适于进行快速的酶分析，但用缓冲液浸泡 后易碎，很少采用。
3 印迹方法 1）毛细管印迹法


毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶 上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重 物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过 凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过 疏水作用产生不可逆的结合。 但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部 分蛋白质（10%-20%）。
尼龙膜：
对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350500μg/cm2。对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。 不一定通过真空干烤，只需短时间紫外线照射，核酸中的部 分嘧啶碱即可与膜上带正电荷的氨基相互交联，从而使结合 更加牢固。 优点 吸附力强、机械性能好。 缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；杂 交信号的本底也高。