基因组DNA 文库的构建演示教学
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➢对于高等真核生物，基因数量庞大且复杂，单个 目的基因所占比例极其微小，难以直接分离。
➢为增加成功分离的可能性，需要将这个基因进行 扩增，但由于分离的是未知基因，故无法进行特 异性扩增，只能构建该生物材料的基因文库。
构建基因组DNA文库的作用
➢分离有用的目的基因：
• 分离特点的基因片段； • 分析特点基因结构；
可用载体DNA片段
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
S
被限制酶切开的DNA片段
琼脂糖凝胶电泳 S 纯化约20kb片段
泳分级分 的提取
离
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
重组噬菌体
侵染大肠杆菌
➢①工具的准备；
➢②载体的制备；
➢③HMW DNA的提取 ；
➢④HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；
➢⑤载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；
➢⑥重组克隆的挑选和保存；
注1：高纯度大分子量基因组DNA (High molecular weight DNA, HMW DNA)。 注2：构建噬菌体文库，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进 行包装并侵染宿主。 注3：以下，以 λ噬菌体为例简述DNA文库的制作过程（P184）。
大肠杆菌
基因文库
⑤ 体 外 包 装 与 转 化
小
➢1.DNA
➢2.
➢3.
➢4.
➢5.
结
如Байду номын сангаас
基
基
为
何
因
因
什
制
组
组
么
文
DNA
DNA
作
要
库
一
构
与
cDNA
个
文
文
建
DNA
库
库
的
的
文
特
作
文
文
库
点
用
库
库
的
区
别
DNA
基因组DNA 文库的构建
制作：### 主讲： ###
基因组DNA文库与cDNA文库
➢cDNA文库：
➢以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转 录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，每 个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。
➢cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定 发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文 库具有组织或细胞特异性。
基因组DNA文库与cDNA文库
➢基因组DNA文库： ➢指将某生物的全部基因组DNA用限制性内切
酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再 与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细 胞获得的所有阳性菌落。 ➢其实质就是采用“化整为零”策略，将庞大的 基因分解成一段段，每段包含一个或几个基因。
为什么要构建基因组DNA文库
①
λ噬菌体载体；
工
具
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ； 准
备
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R cos
• 研究基因表达调控。 ➢保存生物的全部基因：
• 全基因组物理图谱的构建； • 全基因组序列测定。
基因组DNA文库的特点
➢代表性
• 文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆 盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。
➢随机性
• 采用机械切割或酶切法随机断裂DNA，保证克隆的随机 性。
DNA 大小的比值。
制作基因组DNA文库的常用载体
➢λ噬菌体：最常用到的载体。 • 广泛用于细菌、真菌等基因组较小的物种研究。
➢柯斯质粒： • 稳定性较差，大量复制易缺失。
➢细菌人工染色体（BAC）： ➢P1源人工染色体（PAC）： ➢酵母人工染色体（YAC）：
• 可以插入大片段DNA，主要用于基因组做图等。
• 增加文库重组克隆的数目，提高覆盖基因组的倍数。
Clark 和 Carbon 于1975年提出如下公式：
ln(1-p) N= ————————
ln(1-f) 该公式用于预测一个完整基因组文库应该包含的克隆数目。
➢N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数。 ➢p：表示所期望的目的基因在文库中出现的概率。 ➢f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组
➢为增加成功分离的可能性，需要将这个基因进行 扩增，但由于分离的是未知基因，故无法进行特 异性扩增，只能构建该生物材料的基因文库。
构建基因组DNA文库的作用
➢分离有用的目的基因：
• 分离特点的基因片段； • 分析特点基因结构；
可用载体DNA片段
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
S
被限制酶切开的DNA片段
琼脂糖凝胶电泳 S 纯化约20kb片段
泳分级分 的提取
离
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
重组噬菌体
侵染大肠杆菌
➢①工具的准备；
➢②载体的制备；
➢③HMW DNA的提取 ；
➢④HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；
➢⑤载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；
➢⑥重组克隆的挑选和保存；
注1：高纯度大分子量基因组DNA (High molecular weight DNA, HMW DNA)。 注2：构建噬菌体文库，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进 行包装并侵染宿主。 注3：以下，以 λ噬菌体为例简述DNA文库的制作过程（P184）。
大肠杆菌
基因文库
⑤ 体 外 包 装 与 转 化
小
➢1.DNA
➢2.
➢3.
➢4.
➢5.
结
如Байду номын сангаас
基
基
为
何
因
因
什
制
组
组
么
文
DNA
DNA
作
要
库
一
构
与
cDNA
个
文
文
建
DNA
库
库
的
的
文
特
作
文
文
库
点
用
库
库
的
区
别
DNA
基因组DNA 文库的构建
制作：### 主讲： ###
基因组DNA文库与cDNA文库
➢cDNA文库：
➢以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转 录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，每 个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。
➢cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定 发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文 库具有组织或细胞特异性。
基因组DNA文库与cDNA文库
➢基因组DNA文库： ➢指将某生物的全部基因组DNA用限制性内切
酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再 与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细 胞获得的所有阳性菌落。 ➢其实质就是采用“化整为零”策略，将庞大的 基因分解成一段段，每段包含一个或几个基因。
为什么要构建基因组DNA文库
①
λ噬菌体载体；
工
具
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ； 准
备
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R cos
• 研究基因表达调控。 ➢保存生物的全部基因：
• 全基因组物理图谱的构建； • 全基因组序列测定。
基因组DNA文库的特点
➢代表性
• 文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆 盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。
➢随机性
• 采用机械切割或酶切法随机断裂DNA，保证克隆的随机 性。
DNA 大小的比值。
制作基因组DNA文库的常用载体
➢λ噬菌体：最常用到的载体。 • 广泛用于细菌、真菌等基因组较小的物种研究。
➢柯斯质粒： • 稳定性较差，大量复制易缺失。
➢细菌人工染色体（BAC）： ➢P1源人工染色体（PAC）： ➢酵母人工染色体（YAC）：
• 可以插入大片段DNA，主要用于基因组做图等。
• 增加文库重组克隆的数目，提高覆盖基因组的倍数。
Clark 和 Carbon 于1975年提出如下公式：
ln(1-p) N= ————————
ln(1-f) 该公式用于预测一个完整基因组文库应该包含的克隆数目。
➢N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数。 ➢p：表示所期望的目的基因在文库中出现的概率。 ➢f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组