DNA电泳常见问题分析

DNA电泳常见问题

凝胶电泳操作注意事项

1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。

2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。

3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。

4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

5、DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。

6、DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。

7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。

8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。

9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。

11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。

12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量

DNA电泳常见问题分析之一

1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？

过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。

一个让PAGE胶很快聚合的方法：

不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。

2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？

1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。

2、电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。

3、上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。

3 跑出的DNA带模糊？

1、DNA降解：避免核酸酶污染。

2、电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

3、所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

4、DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。

5、DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

6、有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

7、DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

4 有不规则DNA带迁移?

1、对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。

2、电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。

3、DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。

5 跑出的DNA条带带弱或无DNA带？

1、DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。

2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

3、DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

4、对于EB染色的DNA，所用光源不合适??应用短波长（254nm）的紫外光源。

6 跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?

1、如果是小DNA带走出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。

2、分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。

3、DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。

DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适??在脉冲凝胶电泳上分析。

7 做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？

有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。

8：为什么marker条带非常模糊，无法辨别具体条带？

A：出现上述情况，可能有以下几个原因：

1. marker条带出现了降解。请确保在使用过程中避免核酸酶污染；

2. 电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；

3. 电泳条件不合适。电泳时电压应不超过20V/cm，温度应低于30℃；

4. marker上样量过多。请根据说明书选用合适上样量；

5. 凝胶质量不好。建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。

9：为什么marker条带出现不规则的条带（如哑铃状等）？