高效液相中流动相比例调整
液相色谱流动相梯度设置
液相色谱流动相梯度设置液相色谱（HPLC）是一种高效的分离技术，广泛应用于许多领域。
流动相是液相色谱中的一个关键组成部分，其有效性直接影响谱图分辨率和峰形好坏。
液相色谱流动相的梯度设置是样品分离和达到最佳分析结果的关键步骤之一。
液相色谱流动相梯度设置指的是在运行过程中，将流动相的组成按比例和/或浓度进行调整以实现样品分离的过程。
在液相色谱中，两种流动相常见的类型是正相和反相。
正相条件下，极性较高的物质在移动相中有较强的亲和性，而反相则相反。
梯度设置的核心是合理调整正相反相条件下的比例和浓度，以实现最佳的分离效果。
在设置梯度之前，需要考虑液相色谱柱、溶液pH值等因素。
液相色谱柱是分离某种分子时的关键部件。
选择正确的柱子是分离成功的关键因素，柱子的直径、温度等参数也需要根据实际情况进行调整。
对于pH值，需要考虑样品的酸碱性质以及流动相条件下的缓冲能力等。
在具体调整流动相梯度时，需要进行以下步骤：1.初始梯度的选择。
初始梯度是在进样后，液相进入柱子前流量的固定比例。
选择合适的初始梯度有助于避免流速过快或过慢等问题，并提高谱图的质量。
2.曲线调整。
流动相梯度的曲线形状可以是线性、渐变或步阶状，而具体的形状会影响谱图分离的分辨率。
通常情况下，线性梯度是最常用的，但在一些情况下，选择其他形式的梯度可以帮助更好地分离样品。
3.流速设置。
流速对于梯度的切换也有影响。
通常情况下，流速较小时，梯度可以更加平滑，但是需要更长时间才能进行分离。
流速高时分离速度更快，但分离的分辨率低，峰形也可能不理想。
4.流动相比例调整。
在设定反相梯度时，常常需要调整甲醇或醋酸的浓度来达到最佳的分离效果。
一般来说，使用高浓度甲醇可以促进非极性化合物的分离，而醋酸的加入则可以促进极性物质的分离，具体量的调整需要根据样品的特性进行。
5. pH值的调整。
pH值的调整对于液相色谱分离特定物质时是很有用的，而具体的调整需要结合实验结果和样品特性进行。
高效液相色谱仪流动相配置操作规程
高效液相色谱仪流动相配制标准操作规程1.目的明确高效液相色谱法流动相配制过程，保证操作过程的规范性.2.适用范围适用于实验室高效液相色谱法流动相配制。
3.职责实验室分析人员负责按本规程进行操作。
4. 内容4.1流动相批号的编写原则：流动相批号按配制日期编制,如批号20150609，代表2015年06月09日配制。
4。
2流动相配制4.2。
1含水流动相和不含水流动相的配制所用量筒应区分开，配制不含水的有机溶剂类流动相所用量筒必须是干燥状态，不得有水。
4。
2.2根据样品分析方法所规定的流动相体积比例配制,在清洁的带塞量筒中分别倒入相应的溶剂,若该流动相需加入适量的酸或碱，则戴上一次性手套，用专用注射器吸取规定体积的酸或碱，加入量筒,盖上塞子摇匀，振动过程应主要排气。
4。
2.3含盐的缓冲液类流动相的配制应根据规定比例配制，分别秤取规定重量的盐于清洁的带塞量筒中，加入适量纯水，振摇,待固体完全溶解后，再加纯水至规定刻度，盖上塞子，摇匀。
4.2。
4若该流动相对PH值有特殊要求，根据流动相配制规定的体积比例,用酸或碱调节PH值，用PH计测定直至规定范围内。
4。
3流动相抽滤4.3。
1含水流动相和不含水流动相的抽滤装置应区分,抽滤不含水的有机溶剂类流动相所用装置必须是干燥无水的.4.3。
2抽滤装置准备：将过滤器套在三角烧瓶上，用镊子夹取0。
45μm的水系或有机滤膜一张，放在砂芯过滤器上（注意：滤膜应将过滤面完全覆盖)；再将量杯压在滤膜上,量杯边缘和过滤器的边缘对齐;用配套的夹子将过滤器和量杯接头边缘固定（注意夹子位置应避开抽滤嘴)；将抽滤软管套在抽滤嘴上。
4.3.3抽滤：将少量配置好的流动相倒入量杯内，观察是否有漏液现象，若出现漏液须重新固定过滤器和量杯。
如未漏液则继续倒入流动相(注意不要超过量杯最大刻度线），开启真空泵抽滤。
抽滤结束先拔掉与抽滤嘴连接的真空软管,再关闭真空泵。
4。
3。
4脱气：将抽滤好的流动相转入流动相试剂瓶内(少量润洗一次倒入废液桶内再盛装)，盖上瓶盖（瓶盖不得拧紧），常温下超声波超声15至20分钟。
高效液相色谱流动相选择
高效液相色谱流动相选择流动相流动相的性质要求：一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
流动相选择1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。
这是一个聪明而又省力的办法。
调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应<2cp)。
高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。
最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。
如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。
应选用挥发性溶剂。
流动相的pH值采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。
简述高效液相色谱法中流动相的要求
简述高效液相色谱法中流动相的要求高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）是一种用于分离和分析化学、生物和制药样品的色谱技术。
在高效液相色谱过程中，流动相的选择和性能对分析的准确性和分离效果有着重要的影响。
下面将详细介绍高效液相色谱法中流动相的要求。
1.基础流动相特性：流动相应具有一定的极性和溶解性能。
常用的流动相包括水和有机溶剂，如甲醇、乙醇和乙腈等。
流动相的选择应考虑到待分离组分的性质和分析目的，要保证样品能够溶解并很好的分离。
常用的流动相配比为水/有机溶剂（如乙腈）的比例，比如常见的70:30、50:50等。
2.pH值调节：根据待分离物和色谱柱的性质，适当调节流动相的pH值可以改变待分离物的电离状态，从而影响它们在色谱柱上的分配行为。
比如，对于具有酸性基团的分析物，可以通过酸或碱的加入来调节流动相的pH值，以影响它们与色谱固定相之间的相互作用。
3.离子强度调节：有些样品中可能存在电解质，其离子强度会对分离产生影响。
在这种情况下，可以通过添加相应的盐来调节流动相的离子强度，以改变分析物与色谱固定相的相互作用。
常用的盐有甲酸铵、硫酸铵、三氟乙酸等。
4.流速控制：流动相的流速也对色谱分离的效果有着重要的影响。
流速过快可能导致分离不充分，流速过慢则会增加分析时间。
流速的选择需根据待分离物的性质、色谱柱的尺寸和色谱仪的性能等因素综合考虑。
5.除气和过滤：流动相中的气泡和杂质会影响液相的流动性和检测信号的稳定性。
因此，在使用前应对流动相进行除气处理，以减小气泡对色谱分离的干扰。
同时，对流动相进行过滤处理，可以去除其中的固体颗粒和微生物等。
通常使用0.45μm的滤膜进行过滤。
6.流动相稳定性：流动相应具有良好的稳定性，以保证分析结果的准确性和重复性。
一般来说，流动相中的溶液成分要充分溶解，不发生相分离和析出现象。
所以，流动相的配制要求严格，要遵循相应的配方和混合方法，并在使用前进行充分的搅拌和均匀。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。
其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查；(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
液相色谱流动相梯度设置
液相色谱流动相梯度设置液相色谱（HPLC）是一种高效的分离和分析技术，它广泛应用于生命科学、药物研发、环境监测和食品分析等领域。
在液相色谱分析中，流动相是至关重要的因素之一，它不仅影响分离效果，还直接影响分析结果的准确性和重现性。
而流动相梯度则是液相色谱分析中的一种常用技术，通过调整流动相成分的比例，可以实现复杂混合物的有效分离。
以下将详细介绍液相色谱流动相梯度设置的相关内容，包括梯度的原理、设置方法、优化策略和应用注意事项等。
一、梯度的原理在传统的等浓度流动相条件下，样品成分的分离需要较长的时间，尤其是对于复杂混合物的分析。
而流动相梯度则通过在分离过程中时序地改变流动相成分的比例，可以加快分离速度，提高分离效果，实现高效的分离和分析。
梯度的原理主要包括以下几个方面：1.梯度的线性变化：梯度的线性变化是指流动相成分的比例在分离过程中按照线性规律变化。
这种变化方式可以有效地提高各组分的分离程度，但是需要根据样品的特性和分离要求来确定梯度的斜率和时间。
2.梯度的非线性变化：除了线性变化外，梯度还可以采用非线性变化方式，比如S形曲线、斜率曲线等，以适应不同样品的分离需求。
非线性梯度的设置通常需要根据经验和实验结果进行优化。
3.梯度的相容性：梯度的设置需要考虑流动相的相容性，确保在整个分离过程中，不同成分之间不会发生相互作用或沉淀，从而影响分离效果。
4.梯度的延伸性：梯度的延伸性是指梯度的变化范围可以根据需要进行延伸或缩短，以适应不同样品的分离要求。
延伸性通常可以通过调整梯度的斜率和时间来实现。
二、梯度的设置方法梯度的设置是液相色谱分析中非常重要的一步，合理的梯度设置可以有效提高分离效果和分析速度。
梯度的设置方法通常包括以下几个步骤：1.根据样品特性确定梯度类型：首先需要根据样品的特性和分离要求来确定梯度的类型，包括线性梯度、非线性梯度、等温梯度等。
不同类型的梯度适用于不同的分离需求，需要根据实际情况进行选择。
高效液相色谱原理和操作详解
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (17)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）HPLC应用一、样品测定1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
高效液相色谱仪操作手册(戴安全自动)
液相色谱操作规程-U3000(全自动)一、操作前准备:1.1流动相的配制:1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。
1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜(0.45um)还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。
1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。
1.2对照品供试品处理:1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品,用适当的溶剂(最好采用流动相或流动相的主成分)进行充分溶解(也可借助超声波进行超声溶解),使其浓度为0.1~1mg/mL(根据检测结果再适当调节溶液的浓度)。
1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜(0.45um)还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。
1.3色谱柱的选择:根据样品的性质选择适当的色谱柱。
二、开机:2.1打开电源,打开仪器接线板电源开关;2.2打开电脑显示器电源,打开电脑主机电源,启动电脑;2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源;等待各个部件自检完成2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动,等显示“本地仪器控制器运行空闲”,关闭界面。
2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标(工作站主程序)。
2.6在左下方点击仪器,则在右边会自动显示该仪器控制面板2.7 旋开泵上的排液阀(两圈以上);设置A通道为100%,点击“冲洗”,然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”;(默认冲洗5分钟);然后用同样的方法分别“冲洗”流路中其他通道气泡;排完气泡后关闭排液阀;2.8设置流动相的比例及流速后,点击“马达”。
此时泵自动会以设置的流速进行运行。
2.9在控制面板“自动进样器”控制框中,分别执行“灌注注射器”,“清洗缓冲环”,“清洗针外壁”,执行“到进样位置”;(操作过程中注意注射器有没有气泡。
如有先机器排气,如果不行手动拆除排气泡。
)3.0 在控制面板“柱温箱”控制框中,设置准备分析样品所使用的柱温箱温度。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。
其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查；(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
流动相比例的调节原则
流动相比例的调节原则流动相比例的调节原则概述：在化工生产过程中，流动相比例的调节是非常重要的。
当两种或多种液体混合在一起时，它们的流动速度和比例会影响反应速率和产品质量。
因此，流动相比例的调节是化工生产中必不可少的一环。
一、流量计测量原理1.1 流量计分类根据测量原理和安装方式，流量计可以分为很多种类。
常见的有差压式、涡街式、电磁式、超声波式等。
1.2 差压式流量计差压式流量计是最基本的一种流量计。
它利用管道中产生的压差来测量流速。
差压传感器测得管道内两点之间的压差，再通过公式计算出实际流速。
1.3 涡街式流量计涡街式流量计是利用介质通过涡轮时所产生的涡旋来测量流速。
当介质通过涡轮时，会使得涡轮转动，并且转动频率与介质速度成正比。
1.4 电磁式流量计电磁式流量计是利用法拉第定律来测量流速。
当介质通过电磁式流量计时，会在管道内产生一个电磁场，通过检测电磁场的变化来计算流速。
1.5 超声波式流量计超声波式流量计是利用超声波在介质中传播的速度和方向来测量流速。
当超声波通过介质时，会受到介质密度、粘度、温度等因素的影响。
二、流动相比例调节原则2.1 流动相比例调节的目的在化工生产中，往往需要将两种或多种液体混合在一起进行反应或制品加工。
此时，如果两种液体的比例不正确，就会影响反应速率和产品质量。
因此，需要对液体进行流动相比例调节。
2.2 流动相比例调节的方法常用的流动相比例调节方法有两种：手动调节和自动控制。
手动调节是指通过人工观察和操作来实现液体比例的调整。
这种方法简单易行，但需要经验丰富的操作人员，并且容易受到环境因素干扰。
自动控制是指通过仪表设备和控制系统来实现液体比例的自动调整。
这种方法可以实现实时监测和控制，精度高、稳定性好，但需要投入大量的设备和人力。
2.3 流动相比例调节的原则（1）准确测量液体流量。
在进行流动相比例调节时，首先要保证液体流量的准确测量。
只有准确测量了液体流量，才能进行后续的液体比例计算和控制。
高效液相色谱法操作规程(2015版药典)
范围：原料、中间体、成品检验。
责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。
内容：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
1.1色谱柱反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。
常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多空微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2~8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
高效液相色谱使用详细操作步骤
高效液相色谱使用操作步骤一、泵操作面板PUMP:运行键START:梯度运行键 PURGE:快冲键RESET ：复位键 HOLD ：程序暂停键STOP ：泵停止键TIME 0 RSVR ABCENTER （设置溶剂） TIME 0 PROGENTER （设置程序） TIME 0 % A30ENTER （设置比例）TIME 0 B 30ENTER（设置比例） TIME 0 %3 C 40 ENTER （设置比例）DELP ROG1 ENTER （删除程序）1.对于梯度泵设定举例如下：（人参皂昔得梯度）TIME 0%A 81 ENTER TIME 15 % A 81 ENTER TIME 60 %A 65 ENTER TIME65 %A 0ENTERTIME P ROG 0 TIME ：程序开启键FLOW ：流速: 精品文档,超值卜•载PROG ：程序RSVR: ABCDEL ：删除程序PMAX:最大压PMIN ：最小压力 ENTER:确定 TIMEFLOWENTER（设置流1 ENTERTIME 80 % 0 ENTERTIM E 81 % 81 ENT ERTIME 100 % 8 1 ENTER因为A+ B之与始终就就是100%,所以B相就不用设了O 7、对于对照品在这种条件下只要对照品得峰全部出完后按下RESET键等2 0分钟即可进第二针进完针后按START后再按下R E SET键等基线基走直才可进下一针。
二、检测器操作面板RESET :复位键A/Z:调零键WL:调波长ENTER:确定三、实验前得准备工作1、实验前流动相提前配好过滤脱气。
2、置换流动相时把泵得滤头从原来得流动相中换到新得流动相中滤头要轻拿轻放。
3、液路排气顺序:首先打开排气阀一按PURGE键进行排气结束后一按STOP键停止一再拧紧排气阀一按PUMP4、打开检测器首先观察右上角笊灯指示灯确认氣灯就就是否点亮，按WL键调好实验波长后按A/Z键调零。
高效液相流动相的选择
高效液相流动相的选择 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020高效液相色谱流动相选择流动相1.流动相的性质要求一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
流动相选择1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。
这是一个聪明而又省力的办法。
调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应<2cp)。
高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。
最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。
如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。
应选用挥发性溶剂。
流动相的pH值采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
液相流动相比例调整
液相流动相比例调整
液相流动相比例调整是指调整液相的流动速度和相对浓度比例。
液相在化学工程中常用于反应、萃取、分离等过程，通过调整液相流动相比例可以实现对反应速率、分离效果等参数的控制与优化。
液相流动的相对速度和浓度比例可以通过改变液相流速、液相进料比例、混合物的组成或浓度等方式进行调整。
常见的调整方法包括以下几种：
1. 改变液相流速：液相流速是液相流动的速度，可以通过调整液相流速来改变液相的相对速度比例。
增加液相流速可以增加液相的流动速度，减小液相流速可以减小液相的流动速度。
2. 调整液相进料比例：液相进料比例是指不同液相组分进入反应器或分离设备的比例。
可以通过调整液相进料比例来改变液相的相对浓度比例。
3. 改变混合物的组成或浓度：通过改变混合物的组成或浓度可以改变液相的相对浓度比例。
可以通过增加或减少某种特定组分的含量来调整液相的浓度比例。
液相流动相比例调整在化学工程中具有重要的应用价值，可以对反应速率、产品纯度、分离效果等进行优化和控制。
通过合理的调整液相流动相比例，可以达到更好的工艺效果和经济效益。
药典液相色谱条件调整范围举例说明
各国药典液相色谱条件调整范围在采用药典方法对药品进行检测时，难免需要对药典中的方法进行调整，以达到更好的分离检测效果。
好多朋友并不能准确清晰了解能不能调、怎么调？下面就这个问题进行了说明，主要是以药典的液相色谱条件中流动相调整为例，其他部分如色谱柱、温度、进样量等可自行参考药典相关部分。
首先，能不能对药典液相色谱条件进行调整？答案当然是可以，但是要遵循一定的调整要求，超出该范围的就需要进行再验证。
调整范围是多少？不同的药典有不同的要求，下面以中国药典2015版、欧洲药典8.0版和美国药典USP36版为例进行说明。
1. 中国药典中国药典-0521高效液相法对此进行了说明，调整流动相组分比例时：当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7 X～1.3 X ;当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X + 10%。
都是中文，这里就不在举例说明了，见下面附图。
2. 欧洲药典欧洲药典-2.2.46 Chromatographic separation techniques对此进行了说明，以等度洗脱为例，调整流动相组分比例时：小比例组分的调整范围是“相对30%或绝对2%”，取其大。
举个栗子：对于一个10%的组分，相对30%的调整范围是7%-13%，绝对2%的调整范围是8%-12%，因此适用相对30%的调整范围。
对于一个5%的组分，相对30%的调整范围是3.5%-6.5%，绝对2%的调整范围是3%-7%，因此适用绝对2%的调整范围。
3. 美国药典美国药典-<621> Chromatography部分对此进行了说明，调整流动相组分比例时：小比例组分（≤50%）的调整范围是“相对30%或绝对10%”，就不再举栗进行细节说明了，感兴趣的朋友可以参阅以下部分：。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法一、流动相准备将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。
流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。
二、开机首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。
三、抽气抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。
抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。
四、调节流动相比例与流速在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。
五、2410示差检测器的使用1、打开2410示差检测器开关2、调整检测器内、外温度3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。
六、2487紫外检测器的使用1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。
2、设置检测波长3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定一、样品准备取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。
配80％甲醇，冰箱冷冻。
二、提取样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。
小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。
三、过滤取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。
四、浓缩将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
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高效液相中流动相比例调整
高效液相色谱法中流动相比例调整的要求是：“其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对于与自身的改变量不超过+-30%且相对于总量的改变量不超过+-10%为限，如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的10%为限”请问这里的“相对于总量的改变量”是什么意思啊到底该如何计算器调整幅度范围。
“总量”指流动相的总量。
比如甲醇-水（1：3），则甲醇变化的比例可在1±30%，即改变量不超过（~：3）;总量的10%，则为（1+3）±10%，即；因此甲醇改变量不得超过，即甲醇最大允许调整比例为1±40%（~：3）.不知道我解释的是否准确。
比如一个流动相甲醇-水（20:80）相对于自身的改变量不超过+-30%
20*30%＝6
流动相的范围是14:86到26:74
相对于总量的10%
流动相的变化范围为10:90 到30:70
三楼正解，一楼错误
应为比如甲醇-水（1：3），则甲醇变化的比例可在1±30%，即改变量不超过（：至：）;总量的10%，则为（1+3）±10%，即；因此甲醇改变量不得超过，即甲醇最大允许调整比例为1±40%（：至：）. 30%的相对改变量小于10%总量绝对改变量，最终以30%为准即（：至：）
若甲醇-水（2：3），30%的相对改变量为（：至：），总量的10%改变量为（：至：）
根据原则“如30%相对改变量的数值超
过总量的10%时，则改变量以总量的10%为限”
最终以10%为准（即：至：）
一般以百分比例来表示会更直观，如甲醇-水（2：3），即甲醇-水（40：60）期调整范围为
（30：70至50：50），而不是30%相对改变量的（28：72至52：48）
三元组分时，可调节比例较低的两个组分，调整原则同上，一般只调整其中一个与大比例组分，另一个不调整。
如A-B-C（50:40:10）调整A、B组分时，30%相对改变量的数值超过总量的10%，所以调整范围为（40:50:10至60:30:10），调整A、C组分时，调整范围为（47:40:13至53:40:7）
还有不懂的，可以看看《2010版中国药品检验标准操作规范》85页。