第八章 电镜冷冻制样技术NEWB

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目前金属投影技术主要用于：观 察不适合负染色但需要金属投影来提 高反差的样品；可用于测量颗粒的大 小、高度，增加颗粒的尺寸，以改善 粒子在TEM的可见性；是复型技术、 冷冻断裂蚀刻复型技术的基础。
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（二）、金属投影基本概念及原理： 1. 金属投影技术的概念： 把具有高电子密度的金属材料（Pt， Pd,Au,Cu,Al),加热到其熔点之上，以一 定的角度沉积在样品表面形成投影，从 而增加样品的反差，并使图像具有立体 感。
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C 、投影角度θ 的调整 调整原则：样品越细小，θ ↘， 如核酸5～9 ° ，细菌30 ° 病毒、噬菌体12－15°
注意：样品与蒸发源的直线距离>10cm
D、金属投影 先喷3s~4min,厚10~20nm 再 90 °垂直喷碳，加固
E、样品颗粒大小的测量
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用于很小或很薄的生物材料，如病毒、 核酸、蛋白质分子等。 ⑵ Cu，Cr（铬的合金），颗粒粗20 Å， 用于对分辨率要求不高的较大样品， 如细菌等
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（三）、方法：
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1、一次投影 A、样品的准备： 制备样品悬液→滴样品液→摆载网→ 放入真空镀膜仪 B、金属的选取： 蒸发材料有粒状、块状、细丝状、薄片状 高分辨率的样品：粒度较细的Pt，Pt-C， Pt-Pd合金 一般的样品：粒度粗、易蒸发，低价的 Cu，Al，Cr
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金属投影与日光投影的比较
二、复型技术
（一）、技术概述
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唯一一种能用TEM观察样品表面方法 1、适用范围: 金属材料,矿物质、化合物表面 坚硬的生物材料：骨骼、牙齿、种子、 孢子、花粉、木材 2、定义：用电子透明的薄膜将某些坚硬材料表 面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜就是 样品表面结构的一个“模子”，称之为复型 （Replication)。
基本描述：用较厚的有机材料在样品表面印制一 级复型，剥离后以此为模板，进行金 属投影和喷碳，制成二级碳复型，最 后溶去一级有机复型膜，留下二级碳 复型膜。 常用方法：AC纸-C二级复型法 基本步骤：贴AC纸→样表结构铸印于AC纸→ 揭下AC纸（一级复型）→ 用石蜡将AC纸粘于玻板→ 金属投影与喷碳（二级复型）→ 溶掉AC纸→水浴脱蜡→清洗→捞膜
l tg H l h M ( l L) M
h:颗粒高度 θ :投影角度 l:照片上投影长度 M:放大倍数 H:蒸发源的高度 L:蒸发源与样品的水平距离
2、二次投影 一次投影之后，将样品旋转180°， 再次投影
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3、旋转投影: 金属蒸发时,样品30～60转/min 适于：极小颗粒 金属投影的电镜图像样品的颗粒呈 黑色，投影区呈白色
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4. 选用金属的标准 ⑴.具有高电子密度，和较高的电子 散射能力 ⑵.在喷镀层中金属颗粒细小，分布均匀， 高温下不升华，经久耐用 ⑶.在电子束作用下，金属不会粒状化 ⑷.化学稳定，不与样品反应 ⑸.熔点低，易于蒸发
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5. 常用的金属：
⑴ Pt，Pd，Pt-Pd,Au,颗粒细10Å
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(三)、冷冻断裂复型膜的命名
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(Branton,1975) 1.两个半膜: E半膜（外半膜）：连接细胞外空间及 细胞内空间(包括内质网腔、核周间隙、 线粒体内等)的半膜 P半膜（胞质半膜）：连接细胞质、核 质、线粒体和叶绿体基质的半膜 2.四个面： P半膜上的亲水面PS面（protoplasmic Surface) P半膜上的疏水面PF面（ protoplasmic fracture face) ES(extracellular),EF
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3、优点： ⑴ 分辨率极高，研究样品表面精 细结构； ⑵ 制样简单，不损伤样品，图像 具有立体感， ⑶ 在TEM下可以观察样品天然表 面或人工断面的细微结构特征。
（二）、制样方法
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1、一级复型 （负复型） 基本描述：先用有机材料直接在样品表面 印制复型，再将复型膜剥离样 品，金属投影来增加反差。 常用介质：0.5～1%火棉胶醋酸戊酯溶液 或0.5%formvar氯仿溶液 基本步骤：滴加福尔莫瓦溶液→成膜→漂膜 →洗膜→捞膜→金属投影和喷碳 加固→观察 基本特点：分辨率高，20～50Å，人工假象少； 复型膜软，剥离时易变形，且不易 与样品分离
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6、产生冰晶损伤的原因及排除方法 ▲原因：冷却速率不足；样品块过大 ▲排除方法： ①选择优质冷冻剂 ②使用最佳冷冻装置 ③剁碎样品 ④冷冻前用冷冻保护剂处理样品
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第二节 冷冻断裂(蚀刻)和复型技术
一 二 技术概况 基本原理
三
样品的制备
一、技术概况
（－）技术的特点
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1.蚀刻条件： 温度：－100～－110℃ 真空：1×10－5Torr 蚀刻速度：2nm/s 时间：15～90s 2.蚀刻速度的规则： 温度T↗ 蚀刻↗ 真空度↗蚀刻↗
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(四)复型原理： （＝2～2.5nm) 1、一般方法： 先45°喷Pt/C 2～5nm 后90 °喷C 7～15nm(加固) 2、复型的环境条件 真空优于5×10－5Torr 温度： －100℃ 3、间歇喷碳法： 喷1s,间歇3～4s,再喷1s,反 复4～5次，以防止热辐射损伤
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病毒荚膜：负染色
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病毒荚膜：旋转投影
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病毒荚膜：金属投影
三、电镜冷冻制样技术概述
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(一)、冰冻制样技术的分类 冷冻干燥、冷冻取代、冰冻超薄切片 冷冻断裂蚀刻及复型、冷冻扫描电镜技术等 (二)、特点： 1、快速固定，保持细胞或组织的生活状态 2、避免了化学药剂对样品产生的影响，减 少了样品超微结构和成分的损伤，有利 于保护生物大分子活性，用于组织化学、 细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、 尤其X－ray微区分析 3、操作步骤少，时间短，适于快速研究 与诊断
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3、结冰过程与结冰速率
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① 生物样品结冰过程： 细胞外结冰：结冰温度较高、速率低 细胞内结冰：结冰温度较低、速率高 ② 实验结果表明： 冷冻速率低时,冷度温度较高，胞间形成较 大冰晶，损伤细胞结构 冷冻速率很高时,冷度温度很低，胞内外同 时形成玻璃态冰，无损伤 ③ 结论: 防止冰晶形成的关键:提高冷却速率 （103 ～104℃/s） 、 降低冷冻温度
1.优点： ⑴.避免化学试剂对样品的损伤，保持细胞 原有结构。 ⑵.适于观察和研究细胞膜结构，立体感 强，分辨率高 ⑶.复型膜耐电子束的轰击，可长期保存, 是研究生物膜的常规技术
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2. 缺点： ⑴.冷冻会造成样品人为损伤，冰 晶损伤 ⑵.获取生物膜以外的结构信息不足 （二）应用： 主要用于研究生物膜的分子结构，以及 观察人及各种动物、植物、微生物细胞的 膜结构及细胞器的超微结构。
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（戊二醛固定液的温度为生理温度，彻底固 定后，冷却到4℃保存1－3h，在没彻底固定之 前保存在4℃下会引起膜脂质从细胞膜中分离 出来而造成人工假象。） ⑶漂洗：室温下PBS漂洗3次，10min／次
⑷冷冻保护：20－30％甘油等溶液渗透
8－24h
(二）操作步骤 1.冷冻
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（三）、应用范围： 形态学、组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、
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放射自显影、尤其X－ray微区分析领域；
其它材料的研究：塑料、橡胶、及高分子材料 （四）、冰晶损伤： 1、概念：由样品中游离态水分冻结形成冰晶而造 成的一种生物样品精细结构的损伤。 2、结冰过程： 0～－90℃ ： 六角型晶体 －90℃～－140 ℃： 立方体 低于－140 ℃：玻璃态无定形结构（非晶态）
3. 所用仪器 真空镀膜仪：10－4～10－5Torr ⑴ 仪器结构
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真空钟罩：玻璃或金属钟罩；两组电极（碳电 极、金属电极）；样品台。 真空系统：两级泵真空系统，10－4～10－5 Torr 加热电流供给系统：大电流变压器，提高40－ 50A电流。
⑵ 真空的作用：
防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。 防止样品受到金属氧化而引起的污染。
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2、预投影一级复型
基本描述：直接在样品表面进行金属投影
和喷碳，制成碳复型膜，再化
学法溶解掉样品，将复型膜打
捞在载网上。
典型方法：石蜡－铬预投影一级复型法
基本步骤：准备材料→喷铬喷碳→
石蜡补强→溶木材→脱蜡
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3、二级复型 （正复型）
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4、冷冻剂（冷媒） 常用：液氮、液态丙烷、氟里昂、 液氦，液态乙烷
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冷冻速率↗冰晶直径↘冷冻损伤↘
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5、冷冻保护剂 ★目的：防止冰晶损伤 ★原理： 保护剂与水分结合，减少样品中 的水分，从而降低样品的冰冻点 ★常用的保护剂： 甘油、二甲基亚砜（DMSO）、 蔗糖、乙二醇
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2.基本原理及特点： ⑴基本过程：真空蒸发→真空镀膜 ⑵基本原理：
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有金属沉积的部位散射能力强，TEM像呈现暗区 无金属沉积的部位散射能力弱，TEM像呈现亮区 ⑶基本特点： 图像反差明显，富有强烈的立体感 样品被“包埋”在金属膜中，即样品表面被金属 粒 子覆盖，其图像分辨率由金属粒子大小限制，样 品表面细微机构看不清，只能看到表面形貌。 不能分辨杂质和病毒，造成鉴定上的困难，故对 病毒样品的纯度要求较高
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第八章 电镜冷冻制样技术
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第一节 冷冻制样的基础知识
一 金属投影技术 二 复型技术 三 电镜冷冻制样技术概述
一 金属投影技术
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（一）发展概况： 1946,Willams建立金属投影技术，主要用 于观察颗粒材料，如病毒、细菌、原生动 物、孢子、分离的微纤丝、蛋白质分子、 核酸分子，以及其它非生物材料的微粒和 粉末材料。 1955，Hall,Huxley提出负染色技术； 1959,Horne和Brenner正式命名：Negative staining ，取代了金属投影技术。
将预处理后的样品装在冷冻蚀刻装置的样品 夹中， 直接冷冻或间接冷冻。
2.真空中断裂
5×10－5～1×10－5托，－100－－110℃
3.稍加热、蚀刻
样品温度从－110℃上升至－100 ℃，保持 15－90s
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4.喷镀覆型 45°投影喷铂，厚2－5nm，垂直喷碳 加固，10－20nm 5.复型膜和组织的分离： 腐蚀剂：动物：10～30％NaClO 植物：铬酸 6.清洗、打捞、干燥复型膜
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4、拟复型法和微粒复型法 基本描述：
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用于研究微颗粒材料，将其制 成悬浮液，喷到云母片上，干燥后 金属投影，喷碳加固,云母片斜插入 10％丙酮溶液，漂浮碳膜，捞膜后 电镜观察，此法为拟复型法。 若将膜片转移到溶剂中溶解掉 样品，得到该微粒的表面复型膜， 即为微粒复型法。
二、基本原理
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(一)分子生物膜结构的特性 1.生物膜的主要化学成分： 脂类（磷脂，胆固醇） 2.脂类分子的结构特点： 亲水的头部和疏水的尾部 3.脂类分子在水中三种排列： 小球分子团，脂双分子，层脂质体
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(二)断裂的原理 断裂总是沿着阻力最小平面进行的 即断裂总是从脂双分子层的疏水区 裂开 (三)蚀刻作用： 冷冻蚀刻： 样品断裂后，调控温度使之回升,断 裂面上冻结的冰直接升华为水而挥发， 从而暴露出更深一层结构的一种物理效 应。
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(五)冷冻断裂仪简介 1.专用冷冻断裂及复型装置 EIKO ：FD-2A、FD-3 2.附件型装置： 真空喷镀仪＋冷冻断裂装置＋温 度控制器
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生物电子显微技术 三、冷冻断裂(蚀刻)和复型样品的制备
(一)技术准备： 1.电极的准备
2.样品冷冻前的预处理 ⑴取材：活体取下样品1mm3 ⑵预固定:1%-2%戊二醛固定液固定1－3小时