第二章 微生物发酵制药技术
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微生物发酵制药(下)
发酵制药
培养技术
4．连续式操作
概念：培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程中， 不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌体在内的 发酵液，直至发酵结束。 特点： 恒定状态的发酵，发酵罐内体积及其物系的组成将不 随时间而变。 培养基连续稳定流加；产物连续稳定收获；提高菌体 密度；自动化。 缺点：时间长，杂菌污染、突变机会增多。
第二章 微生物发酵制药工艺
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 微生物发酵与制药 微生物生长与生产的关系 制药微生物生产菌种建立 培养基制备 灭菌工艺
2.5
灭菌工艺
灭菌方法与原理 培养基灭菌工艺 空气除菌工艺
发酵制药
灭菌工艺
几个概念
杂菌：除生产菌以外的任何微生物。 污染：感染杂菌的培养或发酵体系。 消毒：杀灭或清除病原微生物，达到无害化 程度，杀灭率99.9%以上。 杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微 生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。 灭菌：微生物杀灭率99.999999%以上。
发酵制药
培养技术
5、灌流（注）式操作
概念：培养液一起装入发酵罐，接种后培 养过程中，不断补充新培养基，取出部分条 件培养基，菌体仍然滞留罐内。 特点： 除去有毒害的代谢物 补充营养物质
发酵制药
培养技术
小结
发酵培养的基本过程 培养技术:概念与特点 操作方式：区别，特点
发酵制药
培养技术
思考题
（1）如何种子罐级数确定？ （2）深层培养、固定化培养、高密度培养有何 特点？ （2）各种操作方式的异同点，如何选择应用？
发酵制药
培养技术
2.6.3 发酵培养的操作方式
1、分批式操作；间歇式操作；不连续操作 2、流加式操作，补料－分批式操作 3、半连续式操作，反复分批式或换液培养 4、连续式操作，衡态操作 5、灌流式操作
生物技术制药 第二章 发酵工程 ppt课件
甘油悬液法：基因工程菌
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50
冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以 在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株 无需进行冷冻保藏，便于运输
液氮法：最为有效，保藏15年以上， 宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物
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51
第三节、发酵设备及消毒灭菌
一、发酵设备
ppt课件
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43
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错位PCR
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基本步骤
(1)用DNase I消化功能 相同的一组基因片段(A)， 从而产生随机小片段(B)。
(2)经提纯后，用无引物(经变 性后可互为引物)的类似PCR反 应重新装配这些小片段成完整 长度的重组基因片段(C)，在 装记过程中被证明有低水平点 突变产生。
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27
（二）放线菌
产抗生素最多的一类微生物 另外生产B12,酶，甾体转化 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的
代谢，目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素；四 环素；红霉素等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
链霉菌
ppt课件
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（三）真菌
抗生素 维生素 酶制剂 有机酸等 药用真菌（大型真菌）
5
(二)发酵工业
定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无 机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。
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6
(1)传统生物技术
发酵食品 有机酸 氨基酸 核酸类物质 酶制剂 医药工业（抗生素…） 饲料工业（单细胞蛋白 环境工程（废物处理） 其它 （冶金工业…）
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第二章 微生物发酵制药技术
三、微生物发酵药物的来源
1、微生物菌体的发酵
SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）
生物防治制剂（如苏云金杆菌）
活性乳制剂
细胞的生长与产物的积累成平行关系，
生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段
单细胞蛋白质的优点 ①生长繁殖迅速：生产能力可达2～6kg/（m3.h）。 ②不受外界条件的影响，可以人工控制工业化生产。 ③营养价值高：微生物细胞内蛋白质含量（占细胞 干物质）： 细菌 60～80％， 小球藻和螺旋蓝细菌50～65％ 酵母菌40～55％， 霉菌20～50％ 大豆35～40％, 小麦10～12％，牛肉18～22％ 此外这些微生物细胞中还含有丰富的碳水化合物和 维生素、麦角甾醇、矿物质、各种酶和未知生长 因子
第二章 微生物发 酵制药技术
第一节 概述
一、微生物发酵制药的发展简史
自然发酵时期 纯培养技术时期 通气搅拌的好气性发酵工程技术时期 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期 发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期 微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时 期
发酵工程的4个阶段
物质得以交换
原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现
遗传物质的交换
基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，
技术含量高，应用面广
三、制药微生物菌种的保藏 (Culture conservation)
目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，
防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不 发生变异。
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代
谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离
稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
第2章微生物发酵制药工程-4
• Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发- Q显-Q辐射 • 发酵是一个复杂的生化过程，底物和生成物很多， 但是发酵热的计算以主要的物质即在反应中起决定 作用的物质来近似计算。
发酵过程温度的控制
• 最适发酵温度的选择—变温发酵 • 在生产上，为了使发酵温度控制在一定的范围，常 在发酵设备上装有热交换设备，例如采用夹套、排 管或蛇管进行调温，冬季发酵时空气还需要进行加 热。
发酵染菌能给生产带来严重危害，防止 杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工 作内容。尤其是无菌程度要求高的液体 深层发酵，污染防止工作的重要性更为 突出。
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂 菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量 或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至 停产。
染菌的具体危害：
1）分解产物 2）污染产品 3）抑制生产菌的生长和代谢的产生 4）影响产物的提取率
无菌室内无菌度的要求
• 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂 的经验，长出的菌落在3个以下为好。
对种子培养基染菌的处理
• 一般均应灭菌后坚决弃去，并对接触过的设备，管道全部灭菌， 加长灭菌时间等。
六、空气带菌及其控制
• 空气过滤器效能下降：过滤介质松动、老化、吸潮 • 肉汤平板检测无菌空气质量 • 通过定期检查管件，更换过滤介质和加强检修
• 为了获得最高的生产率，须要采用摄氧速率与传氧 速率相平衡时菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变
化的曲线和摄氧速率随菌浓变化曲线的交点所对应
的菌体浓度，这就是临界菌体浓度。菌体超过此浓 度，抗生素的比合成率和体积产率都会迅速下降。
菌体浓度的控制
• 发酵过程中要把菌体浓度控制在适宜的范围之内， 主要靠： 1. 调节基质浓度； 2. 采用中间补料，控制CO2和O2量； 3. 若生长缓慢，菌体浓度低时，可补加磷酸盐，促 进生长。
微生物发酵制药
次级代谢产物：是比较复杂的化合物，不是细胞 生长必需的，对生命有意义（抗逆境条件）。抗 生物、毒素、色素。
整理课件
3
发酵罐发酵
整理课件
4
摇床发酵
立式
卧式
整理课件
5
静置发酵
整理课件
6
发酵制药
利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵、代谢 合成药物，然后从中提取、精制纯化，获得药 品的过程。
整理课件
的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反
应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子
转移造成的损伤。离子注入生物学效应显示出一些不
同于辐射生物学的特征，相当于物理和化学诱变两者
相结合的复合诱变效应
（2）激光辐射诱变和微波电整理磁课件辐射诱变
整理课件
17
二、制药微生物菌种的选育
1、选育的目的
改善菌种的特性，使产量提高，改进质 量、降低成本、改革工艺、方便管理及综 合利用等
2、选育的方法：
A、自然选育；
B、诱变育种
C、杂交育种
整理课件
18
自然选育
定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变 而进行的菌种筛选过程。
应用： 1）菌种的纯化 2）菌株的复壮。 2）选育高产菌株
菌体自溶期（cell autolysis phase)
整理课件
10
发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延 滞期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，整理Βιβλιοθήκη 件22诱变方案设计
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发酵罐发酵
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摇床发酵
立式
卧式
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静置发酵
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发酵制药
利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵、代谢 合成药物，然后从中提取、精制纯化，获得药 品的过程。
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的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反
应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子
转移造成的损伤。离子注入生物学效应显示出一些不
同于辐射生物学的特征，相当于物理和化学诱变两者
相结合的复合诱变效应
（2）激光辐射诱变和微波电整理磁课件辐射诱变
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二、制药微生物菌种的选育
1、选育的目的
改善菌种的特性，使产量提高，改进质 量、降低成本、改革工艺、方便管理及综 合利用等
2、选育的方法：
A、自然选育；
B、诱变育种
C、杂交育种
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自然选育
定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变 而进行的菌种筛选过程。
应用： 1）菌种的纯化 2）菌株的复壮。 2）选育高产菌株
菌体自溶期（cell autolysis phase)
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发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延 滞期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，整理Βιβλιοθήκη 件22诱变方案设计
生物制药学——第二章 生物制药工艺学基础
原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、 粉剂等供临床应用的各种剂型。
一、生物材料与生化活性物质
（一）生物制药的生物材料来源
生物资源：主要有动物、植物、微生物的组织、器 官、细胞与代谢产物。
开发新途径： 动植物细胞培养、微生物发酵、 基因工程、细胞工程、酶工程等。
一、生物材料与生化活性物质
红霉素 杀念珠菌素 Bialaphos FK506
（约8700种）
放线菌产生的多种多样的次生代谢产物
Hygromycin B
Kanamycin B
Rifamycin SV
Cephamycin C
Erythromycin streptomycin
Spinosyn A
Abamectin
Validamycin A
人源性生化药物 动物生化药物 植物生化药物 微生物源生化药物 海洋生物生化药物
生化制药的六个阶段：
1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎 3.提取：
从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。 4.纯化：
粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、 透析、超 离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。 5.浓缩、干燥及保存 6.制剂：
生化成分：氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、 脂类、维生素等。
新的有效生物药物逐年增加：天花粉蛋白、木瓜 蛋白酶、天麻多糖等。
5、微生物—细菌
常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主 要发展领域有： （1）氨基酸：
利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸产生 氨基酸。 （2）有机酸：柠檬酸、苹果酸、乳酸
生物材料来源
1、动物脏器 2、血液、分泌物和其他代谢产物 3、海洋生物 4、植物 5、微生物
一、生物材料与生化活性物质
（一）生物制药的生物材料来源
生物资源：主要有动物、植物、微生物的组织、器 官、细胞与代谢产物。
开发新途径： 动植物细胞培养、微生物发酵、 基因工程、细胞工程、酶工程等。
一、生物材料与生化活性物质
红霉素 杀念珠菌素 Bialaphos FK506
（约8700种）
放线菌产生的多种多样的次生代谢产物
Hygromycin B
Kanamycin B
Rifamycin SV
Cephamycin C
Erythromycin streptomycin
Spinosyn A
Abamectin
Validamycin A
人源性生化药物 动物生化药物 植物生化药物 微生物源生化药物 海洋生物生化药物
生化制药的六个阶段：
1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎 3.提取：
从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。 4.纯化：
粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、 透析、超 离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。 5.浓缩、干燥及保存 6.制剂：
生化成分：氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、 脂类、维生素等。
新的有效生物药物逐年增加：天花粉蛋白、木瓜 蛋白酶、天麻多糖等。
5、微生物—细菌
常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主 要发展领域有： （1）氨基酸：
利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸产生 氨基酸。 （2）有机酸：柠檬酸、苹果酸、乳酸
生物材料来源
1、动物脏器 2、血液、分泌物和其他代谢产物 3、海洋生物 4、植物 5、微生物
第二章 微生物发酵制药技术
• 不同碳源对毛霉产蛋白酶的影响
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 空白 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 玉米粉
酶活（u/g）
中性条件下酶活 外加碳源对产酶的影响 碱性条件下酶活
1400 1200
酶活（u/g）
1000 800 600 400 200 0
空白
• 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～32 ℃ ，
• 青霉菌生长温度为30 ℃ 。
• 2、根据培养条件选择
• 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。
• 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低
些，溶氧浓度也可髙些。
• 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利
用快，会使菌过早自溶。
注意：遗传特性不稳定，容易继续 变异； 需要经常进行选育工作； 能提高平均生产水平，但不 能大幅提高。
第二节 制药微生物与产物的生物合成
二、制药微生物菌种的选育
（一）自然选育
生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液 分离出单菌落
斜面种子
高产菌株
沙土管菌种
斜面种子
摇瓶复筛
高产纯化株
第二节 制药微生物与产物的生物合成
4.水 5.前体：内源性、外源性
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（二）培养基的种类与选择 1.培养基的种类 （1）孢子培养基：制备孢子 （2）种子培养基： 孢子发芽、菌体生长繁殖 （3）发酵培养基
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（三）影响培养基质量的因素 1.原材料质量的影响 2.水质的影响 3.灭菌的影响 4.pH的影响 5.其他影响因素：黏度
第一节 概 述
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 空白 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 玉米粉
酶活（u/g）
中性条件下酶活 外加碳源对产酶的影响 碱性条件下酶活
1400 1200
酶活（u/g）
1000 800 600 400 200 0
空白
• 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～32 ℃ ，
• 青霉菌生长温度为30 ℃ 。
• 2、根据培养条件选择
• 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。
• 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低
些，溶氧浓度也可髙些。
• 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利
用快，会使菌过早自溶。
注意：遗传特性不稳定，容易继续 变异； 需要经常进行选育工作； 能提高平均生产水平，但不 能大幅提高。
第二节 制药微生物与产物的生物合成
二、制药微生物菌种的选育
（一）自然选育
生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液 分离出单菌落
斜面种子
高产菌株
沙土管菌种
斜面种子
摇瓶复筛
高产纯化株
第二节 制药微生物与产物的生物合成
4.水 5.前体：内源性、外源性
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（二）培养基的种类与选择 1.培养基的种类 （1）孢子培养基：制备孢子 （2）种子培养基： 孢子发芽、菌体生长繁殖 （3）发酵培养基
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备
（三）影响培养基质量的因素 1.原材料质量的影响 2.水质的影响 3.灭菌的影响 4.pH的影响 5.其他影响因素：黏度
第一节 概 述
微生物发酵制药技术基础—培养基和设备的灭菌
K1
K `1
ln（ K 2 ） ln（ K`2 ）
K1
K `1
即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要
大于培养基成分破坏速率的增加倍数。
从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生 物死亡和培养基破坏这两种过程。温度升高，菌体死亡 速率大于培养基成分破坏的速率。
不同灭菌温度、时间与培养基成分破坏情况（Ns/No=10-3）
缺点： • 设备较庞大； • 维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生
局部过热或灭菌不足的现象； • 喷淋冷却管道很长，对于黏度较高、固形物含量较
多的培养基极易堵塞。
2.喷射加热器加热的连续灭菌流程
优点：能保证培养液在喷射加热器和维持管中的先进 先出，避免了培养基过热和灭菌不彻底现象，培养基 总的受热时间短，营养物质的损失不严重。
依设备和工艺条件的不同，连续灭菌分：
• 连消塔加热的连续灭菌流程 • 喷射加热器加热的连续灭菌流程 • 薄板换热器加热的连续灭菌流程
1.连消塔加热的连续灭菌流程
这是国内味精厂普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连 消塔与蒸汽直接混合，在连消塔内的停留时间为20～30s，达 到灭菌温度132℃。再送入维持罐保温，时间8～25min，最后 由喷淋冷却器冷却至后续的发酵或培养温度。
连续灭菌的优缺点
优点 • 短时间内加热到保温温度且能快速冷却，减少养分的损失 • 操作条件恒定，灭菌质量稳定 • 易于实行管道化和自动化控制 • 避免反复加热和冷却，提高了热利用率 • 发酵设备利用率高
缺点 • 设备要求高，需另外设置加热冷却装置 • 操作比较麻烦 • 染菌机会多 • 对蒸汽要求高 • 不适合大量固体物料的灭菌
（二）对数残留定律
微生物发酵制药
第三阶段 • 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素
迅速工业大规摸生产。 • 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、
核酸发酵成功。
2019/11/7
河南中广集团.天义生物谷
发酵工程的第四阶段
第四阶段 • 20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。 • 20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。 • 20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合
真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)
• 产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、 • 顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)
都生产头孢菌素C
2019/11/7
河南中广集团.天义生物谷
真菌之酵母菌属(Saccharomyces)
啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤 酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞 色素C、凝血质和辅酶A等。
灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)
产链霉素 产金霉素 产红霉素 产土霉素
2019/11/7
河南中广集团.天义生物谷
2019/11/7
河南中广集团.天义生物谷
发酵菌种的选育要求
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代 谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
定、不易变异退化 安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
迅速工业大规摸生产。 • 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、
核酸发酵成功。
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发酵工程的第四阶段
第四阶段 • 20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。 • 20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。 • 20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合
真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)
• 产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、 • 顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)
都生产头孢菌素C
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真菌之酵母菌属(Saccharomyces)
啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤 酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞 色素C、凝血质和辅酶A等。
灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)
产链霉素 产金霉素 产红霉素 产土霉素
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河南中广集团.天义生物谷
发酵菌种的选育要求
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代 谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
定、不易变异退化 安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
第2章微生物发酵制药工艺
次级代谢产物：比较复杂的化合物，不是细胞生长 必需的，对生命活动有意义（抗逆境条件）。抗生 素，毒素，色素。
2、发酵制药
概念 利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代
谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化， 获得药品的过程
抗生素的发现
1928年，英国细菌学家Fleming B发现抗菌物 质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14 种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开 始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶 段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半 合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际 生产和应用的只有100余种。
次级代谢产物生物合成的基本特征
（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含 有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯 醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、 核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、 环肽等键。
（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类 学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色 链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生 大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相 同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌 素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种 次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化 合物。
growth phase）
发酵后期(fermentation anaphase) 菌体自溶期(cell autolysis phase)
发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞 期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－先氨基酸作为碳源，释放出氨，
2、发酵制药
概念 利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代
谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化， 获得药品的过程
抗生素的发现
1928年，英国细菌学家Fleming B发现抗菌物 质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14 种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开 始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶 段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半 合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际 生产和应用的只有100余种。
次级代谢产物生物合成的基本特征
（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含 有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯 醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、 核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、 环肽等键。
（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类 学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色 链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生 大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相 同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌 素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种 次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化 合物。
growth phase）
发酵后期(fermentation anaphase) 菌体自溶期(cell autolysis phase)
发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞 期、对数生长期和减速期。
代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－先氨基酸作为碳源，释放出氨，
微生物发酵制药技术
30
发酵制药流程
31
发酵制药工艺
32
五、微生物发酵基本过程特征
菌体生长与产物合成的三个阶段： 发酵前期（fermentation prophase) 菌体生长期（cell growth phase) 发酵中期(fermentation metphase) 产物合成期（product synthesis phase) 发酵后期（ fermentation anahase） 菌体自溶期（cell autolysis phase)
维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用
的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。
细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)
生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化
是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌， 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542
细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)
1。稀释涂布
2。平板划线纯化
43
斜面传代
44
防止菌株衰退的措施
菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵 产品的得率降低. 1、衰退的可能原因 （1）、基因突变 （2）、分离现象 2、防止菌种衰退的方法 A、从菌种选育方面考虑；B、尽量减少传代次数 C、创造良好的培养条件；D、利用不易衰退的细胞传代; E、采用有效的菌种保藏方法
33
发酵前期特征
从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞 期、对数生长期和减速期。 代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降－以氨基酸为碳源，释放氨，后 氨被利用。先降后升－以糖为碳源，释放出丙酮酸 等有机酸，后被利用。
微生物发酵制药工艺
合子
虽然有成功报导，但多数效果不显著。
发酵制药
生产菌种的建立
（3）原生质体融合育种
概念 通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同 种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲 本遗传性状的新细胞.
发酵制药
操作过程
a. 原生质体制备： 用去壁酶处理将微生 物细胞壁除去，制成 原生质体。 e.高产菌株
发酵制药
生产菌种的建立
药物的筛选
琼脂扩散法——活性测定： 非致病菌为对象，筛选生物活性物质。 耐药和超敏菌种。 HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。 靶向筛选 高通量筛选 高内涵筛选
发酵制药
生产菌种的建立
2、菌种选育——自然选育（1）
定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自 然突变而进行的菌种筛选过程。 应用： （1）菌种的提纯复壮。（2）防止退 化，稳定生产水平。1年1次。 过程 菌 种 单孢 子 平板 单菌落 优良 分离 测活 菌株 效率低, 增产幅度小
dX r= dt
比生长速率μ：单位菌体浓度的生长速率 生长速率的标准化，菌体活力大小
dX ⎛ 1 ⎞ μ= ⎜ ⎟ dt ⎝ X ⎠
发酵制药
生长与生产的关系
菌体生物量与时间的关系是S形曲线。 分为五个阶段
减速期 dX/dt =μmax X dX/dt =μ X dX/dt = (μ - kd) X = 0 dX/dt = - kd X 延滞期 指数生长期 衰亡期 静止期
发酵前期(fermentation prophase) 菌体生长期（cell growth phase） 发酵中期(fermentation metaphase) 产物合成（生产）期(product synthesis phase) 发酵后期(fermentation anaphase) 菌体自溶期(cell autolysis phase)
电子教案与课件：《制药工艺学(第二版)》 第2章 微生物发酵制药工艺 (2.5)_( 灭菌工艺)
kd Aexp RT
A为常数，E为死亡活化能，T为绝对温度，R为气体常数。
发酵制药
灭菌工艺
灭菌时间与比死亡速率之间的关系
t 1 ln( X 0 ) kd X
➢ kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关 ➢通常：杀死芽孢的温度和时间为指标，X＝0.001。
➢确保彻底灭菌，实际操作中增加 50％ 的保险系数。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.2 培养基的灭菌操作
2.5.2.3 连续灭菌操作
➢ 优点: 采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 热能利用合理，易于自动化控制。
➢ 缺点: 发酵罐利用率低，增加了连续灭菌设备及操作
环节，增加染菌几率；对压力要求高，不小于 0.45 mPa，一般为0.45～0.8 mPa 。 ➢ 不适合: 粘度大或固形物含量高的培养基灭菌。
甚至是产品的质量。
发酵制药
灭菌工艺
制药工艺的灭菌
• 灭菌： 指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备、
空间中所有生物的技术或工艺过程。
➢发酵和细胞车间：无菌培养，培养基和空气无菌； ➢制剂车间：无菌洁净空间，设备无菌，原料无菌； ➢制药用水：无菌纯净水； ➢相关工艺：需要验证。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.1 常用灭菌方法与原理 灭菌质量要求
发酵制药
灭菌工艺
灭菌操作举例1
❖ 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭 菌及管道灭菌
①从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达 0.147MPa，维持45min；
②灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过 达到死角灭菌；
③灭菌完毕，关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤 器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098MPa。
A为常数，E为死亡活化能，T为绝对温度，R为气体常数。
发酵制药
灭菌工艺
灭菌时间与比死亡速率之间的关系
t 1 ln( X 0 ) kd X
➢ kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关 ➢通常：杀死芽孢的温度和时间为指标，X＝0.001。
➢确保彻底灭菌，实际操作中增加 50％ 的保险系数。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.2 培养基的灭菌操作
2.5.2.3 连续灭菌操作
➢ 优点: 采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 热能利用合理，易于自动化控制。
➢ 缺点: 发酵罐利用率低，增加了连续灭菌设备及操作
环节，增加染菌几率；对压力要求高，不小于 0.45 mPa，一般为0.45～0.8 mPa 。 ➢ 不适合: 粘度大或固形物含量高的培养基灭菌。
甚至是产品的质量。
发酵制药
灭菌工艺
制药工艺的灭菌
• 灭菌： 指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备、
空间中所有生物的技术或工艺过程。
➢发酵和细胞车间：无菌培养，培养基和空气无菌； ➢制剂车间：无菌洁净空间，设备无菌，原料无菌； ➢制药用水：无菌纯净水； ➢相关工艺：需要验证。
发酵制药
灭菌工艺
2.5.1 常用灭菌方法与原理 灭菌质量要求
发酵制药
灭菌工艺
灭菌操作举例1
❖ 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭 菌及管道灭菌
①从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达 0.147MPa，维持45min；
②灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过 达到死角灭菌；
③灭菌完毕，关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤 器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098MPa。
微生物药物的发酵生产技术
青霉素的产生菌——产黄青霉（Penicillium chrysogenum）51-20和点青霉（P. notatum），目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。目前青霉素的发酵单位最高达到60000U/ml。
In 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDA’s Center for Drug Evaluation and Research.
pH的影响和控制：
青霉素发酵的最适pH一般认为是，应尽量避免pH超过7.0。 当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH ； 当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。 可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。
青霉菌生长的适宜温度是30℃，分泌青霉素的适宜温度是20℃，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。 0-56 h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184 h，最后24 h回复到27.2℃培养。这样变温培养法可比常温25℃培养产量增加16%。
发酵的影响因素及控制
碳源、氮源的影响和控制：
In 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDA’s Center for Drug Evaluation and Research.
pH的影响和控制：
青霉素发酵的最适pH一般认为是，应尽量避免pH超过7.0。 当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH ； 当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。 可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。
青霉菌生长的适宜温度是30℃，分泌青霉素的适宜温度是20℃，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。 0-56 h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184 h，最后24 h回复到27.2℃培养。这样变温培养法可比常温25℃培养产量增加16%。
发酵的影响因素及控制
碳源、氮源的影响和控制：
微生物发酵制药技术基础—培养基的选择
发酵培养基选择
提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分 利于减少培养基原料的单耗 利于提高培养基和产物的浓度以提高生产能力 利于提高产物合成的速度，缩短发酵周期 减少副产物的形成便于分离纯化 原料低廉，质量稳定，取材容易 原料减少对通气搅拌的影响，提高氧利用率，降能耗 利于产品分离纯化，减少产生三废物质
一次升温液化法过程如下：用纯碱溶液将30％～35％淀粉乳（13 ～14°Bé）调整pH至6.2～6.4，然后加入Ca2+和α-淀粉酶，搅匀 后泵入密闭的液化锅内，加热到88～90℃，保温15～20min。液 化完毕，用碘液检查，合格后，即升温至100℃，加热使酶失活 。α-淀粉酶用量为8～10U/g淀粉。反应液中Ca2+浓度为 0.01mol/L。
0.8％，在70℃及酸性条件下搅拌后过滤。 6.过滤除杂
酸解法
评价
优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周 转快。 缺点： •要求设备耐腐蚀、耐高温和耐压。 •副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90％左右。 •对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较 高的精制淀粉。
DE值
DE值：dextrose equivalent value （葡萄糖当量值）
根据微生物的特点选择培养基
用于大规模培养的微生物主要有细菌、酵母菌、 霉菌和放线菌等四大类。它们对营养物质的要 求不尽相同，要依据微生物的不同特性，来考 虑培养基的组成。
液体和固体培养基的选择
• 发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发 酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风 培养。
• 固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌 落特征鉴定、活细胞数测定等方面。
• 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需 要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。
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5. 甾体类激素
6. 治疗酶及酶抑制剂
消化酶类、消炎酶类、心血管疾病治疗酶抗肿瘤酶类等。
L-天冬酰胺酶
第二节 制药微生物与产物的生物合成
发酵制药的基本过程
影响 产品 质量 、决 定生 产水 平高 低的 3个 因素
一、制药微生物的选择
样品的采集与处理
富集培养与分离
二、制药微生物菌种的选育
繁殖无明确关系的代谢产物。如： 抗生素、生物碱、色
素 等。
第三节 发酵工艺条件的确定
一、培养基及其制备 二、灭菌操作技术 三、微生物发酵的 3 种主要操作方式 四、发酵过程中的主要参数及控制
一、培养基及其制备
培养基 是专门用于提供微生物生长繁
殖和生物合成各种代谢产物所需要的 按一定比例配制的多种营养物质的混
干扰蛋白质合成药
药
1 、抗生素类药物
抗生素是在低微浓度下能抑制或影响活的机体生命过程 的生物次级代谢产物及其衍生物。目前已发现的抗生素 有抗细菌、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗原虫、抗藻类、 抗寄生虫、杀虫、除草和抗细胞毒性等的抗生素。
2. 氨基酸类药物 目前大部分氨基酸可用发酵法生产。 3. 核苷酸类药物 利用微生物发酵工艺生产的该类药物有肌酐酸、肌苷、 腺苷酸、腺苷等。 4. 维生素类药物 在工业上大多数维生素是通过化学合成获得的，近年来 已发展用微生物发酵法来生产维生素。
药物发酵常用的碳源：
• 2. 氮源
• 氮源是构成微生物细胞和代谢产物中的氮素
来源的营养物质。
• 其主要功能是构成微生物细胞和含氮的代谢
产物。当培养基中碳源不足时，可作为补充
碳源。
常用氮源
3. 无机盐及微量元素
微生物在生长繁殖和生产过程中，需要某些无机盐和 微量元素如 P 、 Mg 、 S 、 K 、 Na 、 Fe 、 C l 、 Zn 、 C o 等， 以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节 物。 这些物质一般在低浓度时对微生物的生长和产物的合 成起促进作用；在高浓度时常表现出明显的抑制作用。
1.无菌检查 检查时间：接种前后、种子培养过程中及发酵过程中 检查途径：无菌试验、发酵液直接镜检和发酵液的生 化分析（温度、pH等变化） 2.染菌的判断
是否染菌的 主要依据
（二）培养基的种类
对发酵生产影响较大的
孢子培养基 种子培养基 发酵培养基
• 2.选择
• 一般来讲培养基的选择首先是培养基成分的确定，
然后再决定各成分之间如何最佳的复配。
（三）影响培养基质量的因素
培养基质量变化可能会引起生产水平大幅度
波动或菌体代谢异常的现象。
引起培养基质量变化的因素主要有：
第二章 微生物发酵制药 技术
第一节 概述
一、相关概念 二、微生物发酵制药研究的内容 三、微生物发酵药物的来源 四、微生物发酵药物的分类
一、相关概念
发酵 ：是指利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来大量生
产或积累微生物细胞、酶类和代谢产物的过程。
发酵制药 ：利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代谢合成药
四、微生物发酵药物的分类
通常是按其化学本质和化学特征进行分类的：
生物来源 作用对象 作用机制 化学结构
细菌 霉菌 酵母菌 放线菌
抗菌药 抗肿瘤药 抗病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂
抑制细胞壁合成药 抗生素 影响细胞膜功能药 维生素
氨基酸 核苷酸 抑制核酸合成药 甾体激素 抑制生物能量反应 酶及酶抑制剂
• 4. 水
• 水是菌体生长所必不可少的，它是构成培养
基的主要组成成分。
• 生产中使用的水有：深井水、自来水、地表
水。
• 水质要定期检测。
化学化工高纯水设备
混床设备-离子交换床
• 5. 前体
• 前体是指在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合 成而自身结构无显著改变的物质。培养基加入前体后，可明 显提高产品产量和主要组分含量。 • 如青霉素发酵培养基中加入苯乙酸或苯乙酰胺，不仅可以提
1. 原材料品种和质量；
2. 培养基的配制工艺；
3. 灭菌操作。
二、灭菌操作技术
• （一）灭菌
• 灭菌：用化学或物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有生命 的有机体的技术或工艺过程。
• 工业上常用的灭菌方法：
化学物质灭菌； 辐射灭菌； 过滤介质灭菌； 热灭菌（干热灭菌和湿热灭菌）
• （二）无菌检查与染菌的处理
物，然后从中分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物 产品的生产过程。
二、微生物发酵制药研究的内容
1. 研究内容
菌种的选育
发酵工艺
产物的分离和提纯
2. 具体讨论：
微生物的来源和改造 微生物药物的生物合成和调控机制 发酵工艺与主要参数的确定
发酵过程的优化控制 质量控制
三、微生物发酵药物的来源
要想通过发酵工程获得在种类、数量和质量等方面符合人们要求的
产品，最重要的是要有优良的菌种。
发酵菌种的选育方法
自然选育
诱变育种 杂交育种 基因工程 人工育种
怎样才能得到 优良的菌种呢？
如果生产是微生物 直接合成的产物 如果生产是一般微生物 不能合成的产物
可以从自然界中划线分 离出相应的菌种，再用 物理或化学的方法使菌 种产生突变，从突变个 体中筛选出符合生产要 求的优良菌种。
抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等
结构常较复杂对环境条件敏感
4. 微生物转化发酵
利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定
部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支 链等。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构 位置特异性、立体特异性。
如： 甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物
可用基因工程、细胞工程 的方法对菌种的遗传特性 进行定向的改造，以构建 细胞或工程菌，从而达到 生产相应产品的目的。
（一）自然选育
也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工处理而直接进行
筛选的育种方法，又称为单菌落分离。 自然选育的主要作用是对菌种纯化以获得遗传背景较为均一的细胞
群体。一般菌种经过多次传代或长期保藏后，由于自然突变或异核
体和多倍体的分离，使有些细胞的遗传性状发生改变，造成菌种不 纯，严重者生产能力下降，称为 菌种退化 。
因此在工业生产和发酵研究中要经常进行菌种纯化。微生物的自然
突变率很低，因此通过自然选育来获得优良菌株的效果远不如诱变 育种。
单菌落分离法
自然选育的一般程序，是把菌种制备成单 孢子悬液，经过适当的稀释以后，在固体 平板上进行分离，挑取部分单菌落进行生 产能力的测定。经反复筛选，以确定生产 能力更高的菌株代替原来的菌株。
（二）诱变育种
诱变育种 是用物理、化学和生物的一种或多种
诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其 DNA 突变频率大幅度提高，然后采用简便、快速、 高效的筛选方法。 诱变育种是当前生产上普遍使用的一种菌种选育 方法。
三、制药微生物菌种的保藏
1. 定期移植保藏法
2. 沙土管保藏法 3. 液状石蜡保藏法 4. 液氮保藏法 5. 冷冻干燥保藏法
合物。
（一）培养基的成分
• 所有的发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和
产物合成所需的能源，包括 碳源、氮源、无机
盐类、生长因子及前体物 等。
• 对于大规模的发酵生产，除考虑上述微生物的需
要外，还必须重视培养基原料的价格和来源 。
1. 碳源
碳源是组成培养基的主要成分之一。 其主要功能有两个： ①供给菌生命活力所需要的能量； ②构成菌体细胞成分和代谢产物。
微生物发酵药物 是运用微生物学和生物化学的理论、方法和技术，
从微生物菌体或其他发酵液中分离、纯化得到的一些重要生理活性 物质。
发酵分类：
菌体发酵 酶发酵 代谢产物发酵 转化发酵
1. 微生物菌体发酵
微生物菌体发酵是以获得具有药用菌体为目的的发酵。 主要有：
药用真菌 （冬虫夏草、茯苓等）
6. 低温冻结保藏法
7. 谷粒（麸皮）保藏法
四、微生物代谢产物的生物合成
微生物生命过程中能合成多种多样的代谢产物，按代谢
产物与微生物生长繁殖的关系，可分为两类：
初级代谢产物 ：微生物代谢产生的，并是微生物自身
生长繁殖所必需的代谢产物。如： 氨基酸、蛋白质、核
苷酸、多糖、核酸 等。
次级代谢产物 ：微生物代谢产生的，而与菌体的生长
高青霉素 G 的含量比例，还可以提高青霉素的含量。
• 但是培养基中前提物质浓度超过一定量时，对菌体的生产显 示毒副作用。
发酵过程中所用的一些前体物质
萄糖提供能源，琼脂是培养基的凝固剂。
• 【思考题} • 判断下列培养基中的各成分分别属于哪பைடு நூலகம்物质？ • 1、平板计数琼脂（PCA） 胰蛋白胨 5.0g 酵母膏粉 2.5g 葡萄糖 1.0g 琼脂 15~20g 水 1L 最终pH值 7.0+0.2 胰蛋白胨提供碳源和氮源，酵母膏粉提供维生素 B，葡
生物防治制剂 （如苏云金杆菌） 活性乳制剂
细胞的生长与产物的积累成平行关系， 生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段
2. 微生物发酵酶
各种酶制剂
天冬酰胺酶： 抗癌 纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓 青霉素酰化酶：青霉素生产
3. 微生物代谢产物发酵
初级代谢产物：
与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须 的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累 次级代谢产物： 与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成