胶原蛋白的研究进展及其应用

胶原蛋白的研究进展及其应用林祥明厦门大学生命科学学院，福建厦门（361005）E-mail：lxmwxr@摘要：胶原蛋白来源广泛，有许多优良性质且用途广泛。

本文概述了胶原蛋白的结构、特性、研究现状及其制备方法，阐述了胶原蛋白及其水解产物在化妆品、医药、功能保健食品等相关领域的应用。

关键词：胶原蛋白制备进展应用1. 引言胶原蛋白为人体主要的细胞外间质成分之一，是人体蛋白质的一大家族。

胶原蛋白分子的异常合成与沉积是纤维化反应的基础。

在胚胎发育、组织重建、损伤修复等过程中，生长因子及分化因子对胶原蛋白基因的表达具有重要的调控作用[1]。

近年来人们进行了这些因子等对胶原基因转动调控作用的研究，这将有助于阐明胶原蛋白基因表达的调控机制。

胶原蛋白基因的表达是其本身的顺式作用、反式作用因子以及诸多调控因子相互作用的结果[2]。

到目前为止，已报道的胶原类型大约有19种，对天然胶原的研究有助于进一步理解靶药物和胶原之间结构功能关系。

有人用人成纤维II型胶原的三维结构模型来进行合成胶原组织、胶原的结构和功能的研究，利用这一系统进一步研究侧链基团的立体化学和特定分子的相互作用，继而评价胶原相关疾病的临床治疗效应。

此外，连接分子末端非螺旋末端肽是胶原分子抗原性的主要来源，而且用胃蛋白酶除去末端肽的缺失胶原是很有应用前景的药物载体，特别是用于基因递送[3，4]。

胶原蛋白是构成动物机体的重要功能物质，它具有其他合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性。

胶原蛋白质结构和功能特点的多样性和复杂性，决定了其在许多领域的重要地位，以及良好的应用前景。

目前胶原已广泛地应用于食品、化妆品、营养保健品、生物肥料以及医用材料等领域。

2. 胶原蛋白的概况胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质，是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中，是结缔组织中极其重要的一种蛋白质，占哺乳动物体内蛋白质总量的25%~30%，相当于体重的6%[5]，是人体重要的细胞外基质成份。

胶原还可作为组织的支持物，起着支撑器官、保护机体的功能，对细胞、组织乃至器官行使正常功能并对外伤修复有重大影响。

胶原蛋白的种类很多，一般皮肤和骨骼中的是Ⅰ型胶原蛋白，软骨中的是Ⅱ型胶原蛋白，胚胎皮肤中的是Ⅲ型胶原蛋白，细胞基底膜中的是Ⅳ型胶原蛋白。

通常胶原蛋白由三条多肽链构成三股螺旋结构，氨基酸的主要组成为脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）。

胶原特有的左旋α链相互缠绕构成胶原的右手复合螺旋结构，这一区段称为螺旋区段，其最大特征是氨基酸呈现（Gly-X-Y)n周期性排列[6]。

胶原蛋白的氨基酸组成有如下特点[7]：（１）胶原蛋白中缺少Cys和Try；（２）胶原蛋白Gly的含量几乎占1/3；（３）胶原蛋白中存在其它蛋白质中不存在的羟赖氨酸，以及其他蛋白质很少含有的羟脯氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸含量是各种蛋白质中最高的；（４）胶原蛋白α-链的Ｎ-端氨基酸是焦谷氨酸，它在一般蛋白质中是少见的。

各型胶原可按其功能分为两组：第一组是成纤维胶原。

ECM中的纤维主要由它们构成。

它们分子中的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成。

这组包括I-III,，V和XI型。

第二组是非纤维胶原。

它们胶原域中的三股螺旋是不连续的，这种中断是由于Gly-X-Y重复三联体不完善所致，即Gly-X-Y为Gly-X-Gly-X-Y或Gly-X-Y-X-Y所取代。

这组中的胶原相互变异也很大，称为Fibril-associated collagen with interrupted triple helices(FACIT)，指具有中断三股螺旋而与纤维相连结的胶原。

它们自身虽不形成纤维，但在ECM中是与纤维相连结的。

这一亚组包括IX, XII和XIV型，后来报道的XVI型和RH型(可能应是XIX型)也可列入此亚组。

另一亚组是成片层结构的胶原。

其中有IV型(基底膜型)、VII型(Descemet氏膜型)和X型胶原，它们在ECM中装配成片层结构。

IV型这一亚组在ECM中由四聚体聚集成串珠样细丝，功能尚未完全清楚。

最后一亚组是VI型胶原，在ECM中起锚促连结作用[8]。

胶原蛋白质结构和功能上的多样性和复杂性是不同水平造成的。

首先起因于基因水平，已知编码胶原蛋白的基因己超过30个，而这些基因经过不同的剪接方式和不同的启动子操作，就会产生更多不同的α多肤链。

IV型胶原就已鉴起出6种α链(αl-α6)。

其次，胶原蛋白的三股螺旋不仅可从由同型胶原的α链组成同质三聚体或异质三聚体的三股螺旋，而且还可以由不同型胶原的α链来组成，如已发现由J型和X型链杂交组成的混合型三股螺旋，它们之间实际是异构重整的产物。

最后，这些胶原分子又可以不同方式聚集成超分子，装配成适应不同功能需要的各种ECM结构。

己知II型胶原在形成软骨组织的纤维时就需要有FACIT中的约IX型胶原参加[9，10]。

胶原用于医药学方面有许多优点，高亲水性、无毒、体内生物相容性、降解性好。

这些优点使得胶原在生物医学方面有多种多样的应用形式，在体内相对稳定。

但是，作为一种蛋白质，对酶降解亦很敏感，比如，胶原末端肽清除酶。

有关副作用的报道仅限于作为外科整形时，进行胶原移植时引发的局部红肿。

尽管将来胶原在应用于基因递送和组织工程时有可能发现新的副作用，但由于其能避免治疗药物、肽类、蛋白质等引起的副作用，有必要进一步阐明和评价胶原系统的作用。

3. 胶原蛋白的生物合成和降解3.1 胶原蛋白的生物合成胶原生物合成的方式与其他分泌蛋白质相似，但胶原具有其特有的反应过程。

胶原的生物合成大致分为3步[2]：第1步：胶原的各个肽链所对应的遗传基因信息，由mRNA将编码蛋白所需的信息转录到核糖体，在核糖体上合成多肽链。

第2步：合成形成的多肽链侧链的羟基化(羟脯氨酸、羟赖氨酸的生成)和糖基化作用后，生成3条多肽链。

第3步：分泌到细胞外的前胶原分子，被切断形成通常的胶原分子，形成纤维，并在纤维分子内引入交联键。

此外，还可以利用转基因生物反应器生产胶原蛋白[11]，通常利用以下生物体为材料：细菌（主要是大肠杆菌）、酵母（毕赤酵母、酿酒酵母）、单细胞藻类、昆虫细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物的转基因乳腺反应器（奶牛、奶山羊、兔、豚鼠、大鼠或小鼠），以及动物膀胱上皮细胞反应器[12-14]。

3.2 胶原蛋白的生物降解原纤维和胶原其他相关的形式具有非常稳定的结构，其寿命至少为6个月，通常会更长。

例如，在骨中I型胶原蛋白的半衰期为1年，软骨中II型胶原蛋白的更替更慢。

然而，胶原的缓慢更替、伤口愈合、发育和组织重建都要求胶原能够在受控的情况下分解。

胶原三股螺旋可以防止多数蛋白酶的降解作用，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。

确切的说，有一系列特异的基质金属蛋白酶（MMP）与所有细胞外基质成分（包括天然和变形胶原）的降解有关。

MMP受到严格的调控，包括酶原活化和称为“金属蛋白酶组织抑制剂”等特异抑制剂的参与。

金属蛋白酶家族活化时都需要Zn2+和Ca2+，家族中的每种酶都有不同的特异性。

不同的金属蛋白酶分别降解明胶、特定的非成纤胶原或蛋白多糖。

MMP-1、MMP-8和MMP13在大约距离胶原N端3/4分子长度的一个特定位置上切断胶原原纤维，从而打开三股螺旋。

该切点位于I型胶原α1链序列的-Gly（775）-Ile（776）处，它已经广泛用于分子鉴定、N端或者C端的结合位点或突变位点的确定。

有人认为，该切点的特异性是由缺乏亚氨基酸的C末端和富含亚氨基酸的N末端区域决定的。

采用X 射线晶体学和NMR已经确定了某些MMP的三维结构。

催化亚单位可以降解胶原三股螺旋，但是失去了位于一个类似β-propellar的血液结合素区域的特异性。

然而，有关此位点的具体信息及其与胶原三股螺旋的结合位点和结合模式仍有待于进一步了解。

人们已经发现一些疾病过程与胶原降解有关，关节炎就涉及软骨胶原原纤维大范围的降解。

最近的研究表明，胶原的降解对于肿瘤生长和转移是必需的[15]。

4. 胶原蛋白的提取胶原蛋白的提取一般集中于胶原蛋白较为丰富的组织，例如皮肤和肌腱。

胶原的提取除了传统的来源——牛、猪、羊，还拓展到许多其他的资源，例如人的胎盘[16]、海洋生物[17]，甚至是利用基因生物技术从转基因动物获取重组人胶原蛋白[18，19]。

从组织中提取I型胶原蛋白最主要的障碍就是胶原蛋白分子间的共价交联。

胶原蛋白在有机溶剂中是不溶的。

水溶性胶原蛋白只占有整个胶原蛋白总量很小的一部分，而且水溶性胶原蛋白的量还取决于动物的年龄以及提取用的组织类型。

在一些组织中，特别是幼小的动物的皮肤中，胶原蛋白的交联度很低，在适当的条件下可以提取部分胶原蛋白；聚集在胶原纤维中的胶原蛋白也可以溶解而被提取到水溶液中。

不同组织的本身特性及交联情况，决定了提取胶原蛋白所用的溶剂以及相应的回收率[20]。

4.1中性盐溶解胶原蛋白提取胶原蛋白常使用的溶剂是中性盐溶液(0.15~2mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液[21]。

前者只适合提取组织中最新合成的胶原以及交联度可以忽略的胶原。

调变提取温度、振荡速率以及对组织的溶剂体积比，可以提取胶原，但不可避免地会改变所提取胶原的组成[21]。

提取的胶原经过透析、沉降、离心即可得纯化胶原。

但对于大多数动物组织来说，中性盐溶解胶原的含量极低甚至没有，因此采用中性盐溶剂提取胶原的方法不适合大规模提取胶原。

4.2 酸溶性胶原在胶原的提取中，稀酸，例如0.5mol/L醋酸，柠檬酸缓冲液，pH值在2~3之间的盐酸溶液，要比中性盐溶剂更为有效。

稀酸可以破坏醛亚胺型分子间的交联，但不能破坏较为稳定的酮亚胺型的交联。

因此，稀酸溶液不适合从酮亚胺交联键较为丰富的组织，例如骨、软骨中提取胶原。

一般利用稀酸溶液提取胶原的流程是先将组织在较低温度下研磨粉碎，再用中性盐溶液清洗，除去可溶性蛋白和多糖，然后在低的离子强度条件下提取胶原[22]。

利用稀盐或是稀酸溶液只能溶解出组织中大约2%的胶原。

调整溶液合适的pH值或温度，所溶解出的胶原能够重新构成与天然胶原纤维性质类似的纤维[17]。

然后利用最常使用的2种方法强碱或酶处理，破坏胶原的交联键，将组织中剩下的98%的胶原提取出来。

4.3 强碱和酶法提取胶原利用强碱和强碱盐溶液可以将结缔组织中剩余的胶原溶解出来，例如利用10%的NaOH 和10%的Na2AO4溶液共同处理结缔组织48h左右[23]，可以溶解出大部分胶原。

与不溶性胶原结合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，胶原纤维瓦解。

最终所得胶原的大小和分子质量，取决于处理时间以及碱的浓度。

强碱盐可以控制胶原的溶涨，并保护胶原天然的三股螺旋结构。

必须指出的是，与明胶类似，所提取的胶原的等电点也降低，这是因为在提取过程中，天冬酰胺和谷氨酰胺转变为天冬氨酸和谷氨酸。