基因工程知识点(考试必备)

第一章绪论

一．基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

二．重组DNA技术与基因工程的基本用途

1.分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源

2.大规模生产生物活性物质

3.设计、构建生物的新性状甚至新物种

4.DNA扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。

三. 基因工程的基本形式

第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程

第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程

第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程

第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程

四．基因工程的应用

1.生物技术制药

2.食品轻工氨基酸有机酸维生素单细胞蛋白食品、香料香精

工程材料 3.农业植物生长激素生物农药农药清除剂生物肥料畜禽疫苗五.基因的制备：化学合成法（DNA连接酶）物理化学方法（分离、纯化）生物学方法（限制性内切酶）酶促合成法（逆转录酶+连接酶）

六.常见的载体：微生物质粒（一种环状DNA分子）某些噬菌体等病毒

1. 什么叫基因工程？有什么特征？

2. 基因克隆的主要目的是什么？

3. 基因工程的三大要求是什么？

4. Watson与Crick和 P. Berg因什么成果（材料和结果）获得诺贝尔奖？

5. 基因工程有哪些主要环节？

6. 生物安全性评价的目的是什么？

7. 生物安全性评价的主要内容是什么？

第二章．基因重组

一. 染色体的本质

1、由DNA、蛋白、RNA组成的线性复合结构

2、是生物遗传信息的载体

3、能够在细胞核染色后看的到的物质

4、与染色质关系：同一物质在不同细胞周期的不同表现形式。分裂过程中以棒状的染色体形式存在。

二、DNA与染色体的关系

1、DNA是染色体的一个主要组成部分

2、从DNA到染色体要经过4级包装，总共压缩了8400倍，形成染色体

三、DNA的组成：戊糖（脱氧核糖）+碱基+磷酸根

四、DNA浓度的测定

方法1：利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值。

方法2：测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。

方法3：用于粗略检测DNA浓度，通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。

五：怎样将混合DNA片段分开呢？

1、电泳分离

2、琼脂糖凝胶分离大片断

3、聚丙烯酰胺分离小片断

第三章、工具酶载体

一、常见的工具酶：限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶核酸酶核酸内切酶掌握5种工具酶的概念、内涵。

熟悉5-10种常见酶切位点。

了解5种工具酶的应用。

二、限制性内切酶

1、限制性核酸内切酶的发现及其生物功能

（1）识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链

（2）主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵

（3）细菌的限制与修饰作用

1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III

I类能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。

II类识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。

III类识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。

因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。

2、命名原则

取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。

该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。

如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。

若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。

如，HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。

3、II 型限制性核酸内切酶的基本特性

识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列

大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧

4、限制性核酸内切酶

1111对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法

使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解

低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切

一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切

0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇

冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥

5、影响限制性核酸内切酶活性的因素

（1）DNA样品的纯度：

蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等

1.加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶

2.加大反应总体积

3. 延长反应时间

（2）DNA样品的甲基化程度：

（3）核酸内切酶的缓冲液性质：

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象

EcoR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’

三、DNA连接酶

1、DNA连接酶的基本性质

（1）连接酶特点

1.常见的连接酶是T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase）

2.来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3‘端羟基和5’端磷酸基因，脱水形成3‘-5’磷酸二酯键

3.连接双链DNA上的单链缺口（Nick），因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端。

4.连接RNA模板上的DNA链缺口。

5.连接平头双链DNA速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，因属于分子之间的连接.

（2）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键

（3）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键

（4）连接多个平头双链DNA分子：

2、DNA连接酶的反应条件(见PCR实验步骤)

1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量

3、平头双链DNA片段的连接操作

分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多

提高平头末端连接效率的方法包括：

1.加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

2.加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

3.加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用

4.加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM

四、DNA聚合酶

1、大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）

大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质:

1、5‘→3‘的DNA聚合酶活性

2、5‘→3‘的核酸外切酶活性

3、3‘→5‘的核酸外切酶活性

2、大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）

Klenow酶的基本性质：

大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow 酶Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性

3、T4-DNA聚合酶

T4-DNA酶的基本特性

1.5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性

2.在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切

3.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止