动力学亲和力分析
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成动态平衡）时，复合物的浓度
动力学分析和亲和力分析的相关性? 3
• 细胞本身就是一个动态系统 – 极少处在平衡状态 • 同样的亲和力，不同的反应，动力学数据一般并不相
同
» 动力学数据提供了更多的信息
同样的亲和力，不同的动力学
• 所有4个化合物的亲和力数据相同 KD = 10 nM = 10-8 M • 结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变，本例中为4个
• 动力学分析
» 获得反应速率常数和亲和力平衡常数
» 对分子间相互作用的详细描述
» 具有相同亲和力数据的反应，结合和解离速率常数往往完 全不同
» 对于了解生物学反应过程来说，获得反应速率常数往往比 亲和力分析更为重要
减少物质迁移的影响
• 更低的 Rmax (ligand密度) • 高进样流速
» 高流速有效减少了扩散距离
• 可选的预设分析模式中已考虑了物质迁移效应
实验设计
实验设计
稳态实验--分析亲和力
• 通过一系列不同的分析物浓度，确定达到稳态的结合水平 • 较高的偶联水平 • 浓度范围至少应该覆盖芯片表面的 20-80% 饱和度(RMAX) • 设置对照芯片表面 • 设置至少一个浓度的样品重复 • 设置零浓度样品
Net rate equation:
d [AB] dt M/s
ka [A] [B] kd [AB]
M-1s-1 M
M s-1
M
where
ka association rate constant [M-1s-1] kd dissociation rate constant [s-1]
平衡常数(EQUILIBRIUM CONSTANTS)
KD
kd ka
[A] [B] [AB]
the equilibrium dissociation constant [M]
BIACORE中的平衡和动力学
ka
A + B AB
kd
• A 是溶液中的待分析物(analyte)
» A的游离浓度由流动系统控制，在检测中保持恒定
• AB 是结合复合物
» AB的浓度可通过直接检测RU得到，表示为R
动力学/亲和力分析
基础知识介绍
什么是动力学和亲和力?
• 动力学
» 反应发生的速度? – 与时间相关 » 结合 – 分子间结合的速度 » 解离 – 分子复合物解离的速度 » 动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复
合物是否能够结合还是完全解离
• 亲和力
» 分子间结合的强度? – 与时间无关 » 亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形
At equilibrium:
Association
Dissociation
ka
[A]
[B]
M-1s-1
M
M
kd [AB]
s-1
M
The equilibrium constants:
KA
ka kd
[AB] [A] [B]
the equilibrium association constant [M-1]
必须考虑的几个因素
动力学分析
• 试剂纯度 • 偶联方法 • 偶联水平 • 配体活性 • 样品流速 • 分析物浓度范围
分析物浓度
动力学分析
• 浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度—饱
和浓度）
• 设置至少一个浓度的样品重复 • 设置零浓度样品
总结
• 亲和力分析
B A
B
» 获得亲和力平衡常数
A
» 适合分析结合和解离速度较快的相互作用过程
[Rmax R] RU
kd R s-1 RU
A has one binding site and reacts with immobilized ligand B has n identical and independent binding sites
传感图中的变量和表示方式
传感图中的信息 • Rmax, Req 和 KD的关系
• 监测结合和解离速率
» 亲和力
动力学
• 监测稳态水平
» 亲和力
动力学
• 监测溶液中游离的分析物分子
» 亲和力
动力学
1:1 动力学模型的速率方程
Association: Dissociation:
AB
d [AB] dt
-d [AB] dt
ka kd
AB
பைடு நூலகம்
ka [A] [B]
kd [AB]
B A
B A
物质迁移（MASS TRANSPORT）
• 在Biacore中，和动力学测量相关的一种现象
» 描述生物分子从溶液向芯片表面转移的过程 » 和生物分子间的相互作用无关
• 在Biacore中，所检测到的反应速率是物质迁移
现象和分子间的相互结合作用的综合结果
» 通过使用合适的反应环境，质量转移导致的影响能够 被最大程度地控制
数量级
Respons e
所有靶位 点被占据
浓度 = 100 nM
浓度 = 1000 nM
kon koff
(M-1s-1) (s-1)
106 10-2 105 10-3 104 10-4 103 10-5
30
60
min
min
时间
30
60
min
min
时间
用BIACORE获得动力学和亲和力数据的3种方 式
• B 是偶联在传感芯片上的分子
» 总浓度能用 RU表示, 相当于最大结合反应理论值 Rmax » B的游离浓度即 Rmax-R
我们无需知道复合物和配体的实际浓度！
BIACORE中的速率和亲和力
AB
ka kd
AB
d [AB] dt
ka [A] [B] kd [AB]
dR dt
ka C
RU/s M-1s-1 M
什么是物质迁移? • 扩散的物质迁移
» 单一样品在静态的系统中
分析物 梯度
• 经过一定的时间，靠近芯片表面的分析物的浓度将
会逐渐降低，并逐渐在溶液中形成一个分析物浓度 梯度
分析物的消耗和补充
流动相高度
1
扩散距离
2
3
1. 分析物由持续流动的样品所补充 2. 随着流速的下降，扩散效应会逐渐占据主导性、 3. 在配体/分析物表面发生的生物分子相互作用
动力学分析和亲和力分析的相关性? 3
• 细胞本身就是一个动态系统 – 极少处在平衡状态 • 同样的亲和力，不同的反应，动力学数据一般并不相
同
» 动力学数据提供了更多的信息
同样的亲和力，不同的动力学
• 所有4个化合物的亲和力数据相同 KD = 10 nM = 10-8 M • 结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变，本例中为4个
• 动力学分析
» 获得反应速率常数和亲和力平衡常数
» 对分子间相互作用的详细描述
» 具有相同亲和力数据的反应，结合和解离速率常数往往完 全不同
» 对于了解生物学反应过程来说，获得反应速率常数往往比 亲和力分析更为重要
减少物质迁移的影响
• 更低的 Rmax (ligand密度) • 高进样流速
» 高流速有效减少了扩散距离
• 可选的预设分析模式中已考虑了物质迁移效应
实验设计
实验设计
稳态实验--分析亲和力
• 通过一系列不同的分析物浓度，确定达到稳态的结合水平 • 较高的偶联水平 • 浓度范围至少应该覆盖芯片表面的 20-80% 饱和度(RMAX) • 设置对照芯片表面 • 设置至少一个浓度的样品重复 • 设置零浓度样品
Net rate equation:
d [AB] dt M/s
ka [A] [B] kd [AB]
M-1s-1 M
M s-1
M
where
ka association rate constant [M-1s-1] kd dissociation rate constant [s-1]
平衡常数(EQUILIBRIUM CONSTANTS)
KD
kd ka
[A] [B] [AB]
the equilibrium dissociation constant [M]
BIACORE中的平衡和动力学
ka
A + B AB
kd
• A 是溶液中的待分析物(analyte)
» A的游离浓度由流动系统控制，在检测中保持恒定
• AB 是结合复合物
» AB的浓度可通过直接检测RU得到，表示为R
动力学/亲和力分析
基础知识介绍
什么是动力学和亲和力?
• 动力学
» 反应发生的速度? – 与时间相关 » 结合 – 分子间结合的速度 » 解离 – 分子复合物解离的速度 » 动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复
合物是否能够结合还是完全解离
• 亲和力
» 分子间结合的强度? – 与时间无关 » 亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形
At equilibrium:
Association
Dissociation
ka
[A]
[B]
M-1s-1
M
M
kd [AB]
s-1
M
The equilibrium constants:
KA
ka kd
[AB] [A] [B]
the equilibrium association constant [M-1]
必须考虑的几个因素
动力学分析
• 试剂纯度 • 偶联方法 • 偶联水平 • 配体活性 • 样品流速 • 分析物浓度范围
分析物浓度
动力学分析
• 浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度—饱
和浓度）
• 设置至少一个浓度的样品重复 • 设置零浓度样品
总结
• 亲和力分析
B A
B
» 获得亲和力平衡常数
A
» 适合分析结合和解离速度较快的相互作用过程
[Rmax R] RU
kd R s-1 RU
A has one binding site and reacts with immobilized ligand B has n identical and independent binding sites
传感图中的变量和表示方式
传感图中的信息 • Rmax, Req 和 KD的关系
• 监测结合和解离速率
» 亲和力
动力学
• 监测稳态水平
» 亲和力
动力学
• 监测溶液中游离的分析物分子
» 亲和力
动力学
1:1 动力学模型的速率方程
Association: Dissociation:
AB
d [AB] dt
-d [AB] dt
ka kd
AB
பைடு நூலகம்
ka [A] [B]
kd [AB]
B A
B A
物质迁移（MASS TRANSPORT）
• 在Biacore中，和动力学测量相关的一种现象
» 描述生物分子从溶液向芯片表面转移的过程 » 和生物分子间的相互作用无关
• 在Biacore中，所检测到的反应速率是物质迁移
现象和分子间的相互结合作用的综合结果
» 通过使用合适的反应环境，质量转移导致的影响能够 被最大程度地控制
数量级
Respons e
所有靶位 点被占据
浓度 = 100 nM
浓度 = 1000 nM
kon koff
(M-1s-1) (s-1)
106 10-2 105 10-3 104 10-4 103 10-5
30
60
min
min
时间
30
60
min
min
时间
用BIACORE获得动力学和亲和力数据的3种方 式
• B 是偶联在传感芯片上的分子
» 总浓度能用 RU表示, 相当于最大结合反应理论值 Rmax » B的游离浓度即 Rmax-R
我们无需知道复合物和配体的实际浓度！
BIACORE中的速率和亲和力
AB
ka kd
AB
d [AB] dt
ka [A] [B] kd [AB]
dR dt
ka C
RU/s M-1s-1 M
什么是物质迁移? • 扩散的物质迁移
» 单一样品在静态的系统中
分析物 梯度
• 经过一定的时间，靠近芯片表面的分析物的浓度将
会逐渐降低，并逐渐在溶液中形成一个分析物浓度 梯度
分析物的消耗和补充
流动相高度
1
扩散距离
2
3
1. 分析物由持续流动的样品所补充 2. 随着流速的下降，扩散效应会逐渐占据主导性、 3. 在配体/分析物表面发生的生物分子相互作用