第十章转基因植物详解
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转基因植物
转基因植物
拥有来自其他物种基因的植物
01 由来
03 转化受体 05 潜在危害
目录
02 优点 04 转化方法 06 国外现状
转基因植物(Genetically modified plants)是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不 同物种之间的杂交，但今天该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出 拥有新特性的植物。
美国转基因植物的商业化速度进展很快，其推广应用走在其它国家的前列。1994年美国Calgene公司研制的 转基因延熟番茄首次进入商业化生产，到1998年底就有30多例转基因植物被批准进行商业化生产。1999年全球转 基因植物种植面积中，美国就占72%，达2870万公顷；其次是阿根廷670万公顷；占17%；加拿大400万公顷，占 10%；中国名列第4位，1999年种植面积达30万公顷，占1%，其他国家的种植面积都小于1%。
在国家“863”高新技术研究与发展计划及国家科技攻关计划的资助下，中国转基因植物的研究和开发取得 了显著的进展，有些研究已经达到国际先进水平。据1996年国生物技术学会统计，中国投入研究和开发的转基因 植物达47种，涉及各类基因103种有近20种转基因植物进入了田间试验或环境释放阶段。至1999年，农业部批准 可进行商业化生产的国内研制的转基因植物有5种，它们分别是：抗虫棉花、改变花色的矮牵牛、延熟番茄、抗病 毒的甜椒和番茄。
谢谢观看
农作物生物技术育种的研究已经不再处于实验室阶段，而是进入了实际应用，走到了商业化阶段。转基因植 物在全球的种植面积增长迅速，种植转基因植物的国家从1992年的1个增长到1996年的6个，1998年9个，1999年 进一步扩大到12个国家。全球转基因植物的种植面积1996年仅为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年增长 到2780万公顷，1999年又比1998年增长44%，达到3990万公顷。
拥有来自其他物种基因的植物
01 由来
03 转化受体 05 潜在危害
目录
02 优点 04 转化方法 06 国外现状
转基因植物(Genetically modified plants)是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不 同物种之间的杂交，但今天该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出 拥有新特性的植物。
美国转基因植物的商业化速度进展很快，其推广应用走在其它国家的前列。1994年美国Calgene公司研制的 转基因延熟番茄首次进入商业化生产，到1998年底就有30多例转基因植物被批准进行商业化生产。1999年全球转 基因植物种植面积中，美国就占72%，达2870万公顷；其次是阿根廷670万公顷；占17%；加拿大400万公顷，占 10%；中国名列第4位，1999年种植面积达30万公顷，占1%，其他国家的种植面积都小于1%。
在国家“863”高新技术研究与发展计划及国家科技攻关计划的资助下，中国转基因植物的研究和开发取得 了显著的进展，有些研究已经达到国际先进水平。据1996年国生物技术学会统计，中国投入研究和开发的转基因 植物达47种，涉及各类基因103种有近20种转基因植物进入了田间试验或环境释放阶段。至1999年，农业部批准 可进行商业化生产的国内研制的转基因植物有5种，它们分别是：抗虫棉花、改变花色的矮牵牛、延熟番茄、抗病 毒的甜椒和番茄。
谢谢观看
农作物生物技术育种的研究已经不再处于实验室阶段，而是进入了实际应用，走到了商业化阶段。转基因植 物在全球的种植面积增长迅速，种植转基因植物的国家从1992年的1个增长到1996年的6个，1998年9个，1999年 进一步扩大到12个国家。全球转基因植物的种植面积1996年仅为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年增长 到2780万公顷，1999年又比1998年增长44%，达到3990万公顷。
转基因植物
800kb，其中T-DNA区为12-24kb，vir区 有35kb，T-DNA上有tms、tmr和tmt三套 基因，分别编码合成植物生长素、分裂 素和生物碱的酶。在T-DNA两端各有一 个25bp的末端重复序列LB和RB，在TDNA的切除及整合过程中起着重要作用。
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
园艺植物育种学(10.7)--分子育种
第十章 分子育种一、名词解释1.植物基因工程：指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA分子，转化到受体细胞，使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译或表达。
2.生物安全：是指生物技术从研究、开发、生产到实际应用整个过程中的安全性问题。
3.分子标记：是指以生物大分子，尤其是生物体的遗传物质—核酸的多态性为基础的遗传标记。
4.分子标记辅助育种：指借助于目标基因紧密连锁的分子标记的基因型分析，鉴定分离群体中含有目标基因的个体，以提高选择的效率，即采用分子标记辅助选择手段，减少育种过程中的盲目性，从而加速育种进程。
二、问答题1.基因的克隆方法和技术有哪些？（1）鸟枪法（2）mRNA分离法（3）转座子标签法及T-DNA插入突变法（4）基因图谱的克隆法（5）其他方法2.植物遗传转化方法和特点有哪些？（1）农杆菌介导的遗传转化（2）DNA理化转移方法①化学刺激质粒进入原生质体②电融合法③微注射④基因枪法⑤超声波处理法⑥碳化硅纤维介导DNA转移法⑦电泳法（3）种质系统转化法①花粉管通道法②胚囊及子房注射法③生殖细胞浸泡法3.转基因植物有哪些分析鉴定方法？（1）外源基因整合的鉴定DNA Southern杂交 PCR（2）外源基因转录水平的鉴定Northern 杂交 RT-PCR（3）外源基因表达蛋白的检测Western杂交（4）外源基因控制表型性状的鉴定。
4.转基因植物为何要进行安全性评价？如何评价？基因工程技术的出现，使人类对有机体的操作能力大大加强，基因在动物、植物和微生物之间相互转移，甚至可将人工设计合成的基因转入到生物体内进行表达，创造出许多前所未有的新性状、新产品甚至新物种，这就有可能产生人类目前的科技知识水平所不能预见的后果，危害人类健康、破坏生态环境。
因此要进行安全评价。
生物安全评价与控制，通常根据所涉及受体生物安全等级、操作的基因安全等级、两者结合的产生遗传工程体的安全等级设定不同的安全水平。
基因工程转基因植物PPT课件
Ti Plasmid
T-DNA region
auxin
Left border
Right border
vir genes ori
已知农杆菌 附着到植物 细胞后，只 留在细胞间 隙中。TDNA首先在 细菌中被加 工、剪切、 复制，然后 转入植物细 胞。
（2） Ti质粒的功能区域
※ T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农 杆 菌 侵 染 植 物 细 胞 时 ， 从 Ti 质 粒 上 切 割 下 来 转 移 到 植 物 细 胞 的 一 段 DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
农杆菌介导法
1）农杆菌
农杆菌包括根癌农 杆菌（Ti质粒）和发根 农杆菌（Ri质粒），质 粒中含有一段可移动的 DNA称为T-DNA，可作 为外源DNA的载体。
农杆菌: 广泛用于植物基因工程。 包含Ti质粒:【肿瘤诱导质粒（细菌 质粒）】；
T-DNA: (Transferred-DNA), 可以转 移进入植物基因组.
优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转 化效率高。
缺点：遗传稳定性差、嵌合体 因此需要连续的再生系统
1.1 受体
1.1.3 直接分化再生
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶 段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。
优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗 传稳定；
缺点：材料局限，转化率低。
1.1 受体
受体 是指用于接受外源DNA的转化材料。 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1) 高效稳定的再生能力； 2) 受体材料要有较高的遗传稳定性； 3) 外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4) 对筛选剂敏感； 5) 转化率高 常用的受体材料有以下几大类型:
第10章 植物遗传转化
8
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了 共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞 作为靶材料。 操作简便。
21
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点：
1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体 材料进行遗传转化操作，然后经过培养直接在 外植体上形成不定芽的情况。 这种系统的特点是 1）获得再生植株的所 需时间短，操作简单；2）遗传变异少；3）外 源基因稳定性高；4）嵌合体比例偏高；5）受 植物物种的限制比较大。
25
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性 5，生殖细胞受体系统
以花粉粒或卵细胞为受体细胞进行直接的 转化的技术系统，也叫种质系统。 5.1，花粉管通道法； 5.2，花粉粒浸泡法； 5.3，花粉粒基因枪转化法； 5.4，子房微注射法。
26
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
16
第二节
转化的受体系统
一、转化受体的条件
5，农杆菌敏感性 对于农杆菌介导的基因转化来说，需要受 体材料对农杆菌敏感，因为只有对农杆菌敏感 的材料才能够接受农杆菌的转化。一般认为， 大多数双子叶植物对农杆菌敏感而单子叶植物 不敏感。 农杆菌有不同的菌株，同一材料对不同菌 株的敏感程度可能存在不同；目前，还可以采 用化学试剂（乙酰丁香酮）来弥补敏感性的不 足。
第10章 微生物与基因工程
➢ 携带了氨卞青霉素抗性基因（ampR）
➢ 多克隆位点区位于lacZ‘基因中，在此位点上插入外源基因会 导致lacZ‘基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。
.
.
.
质粒的不足
（1）外源DNA≤15kb。 （2）转化效率低，约0.1％的转化率。
.
二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体的优点： （1）遗传背景清楚； （2）容纳外源DNA≤23kb。 （3）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。 缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位
.
.
⑵ 插入一小段多克隆位点区
➢ 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点 的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会 破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和 宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板 上，则形成无色噬菌斑。
.
➢ M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适 于克隆300～400bp的外源DNA片段；
.
M13噬菌体的改造
➢ 野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生 型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。
➢ 在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均 为复制和组装所必需的基因。
➢ 外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对 野生型M13的改造主要在IG区中进行。
.
⑴ 插入β－半乳糖苷酶选择标记
第十章
微生物与基因工程
基因工程技术
➢ 基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿 主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基 因产物，或令生物表现出新的形状。
.
基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，
➢ 多克隆位点区位于lacZ‘基因中，在此位点上插入外源基因会 导致lacZ‘基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。
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质粒的不足
（1）外源DNA≤15kb。 （2）转化效率低，约0.1％的转化率。
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二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体的优点： （1）遗传背景清楚； （2）容纳外源DNA≤23kb。 （3）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。 缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位
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⑵ 插入一小段多克隆位点区
➢ 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点 的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会 破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和 宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板 上，则形成无色噬菌斑。
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➢ M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适 于克隆300～400bp的外源DNA片段；
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M13噬菌体的改造
➢ 野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生 型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。
➢ 在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均 为复制和组装所必需的基因。
➢ 外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对 野生型M13的改造主要在IG区中进行。
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⑴ 插入β－半乳糖苷酶选择标记
第十章
微生物与基因工程
基因工程技术
➢ 基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿 主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基 因产物，或令生物表现出新的形状。
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基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，
《转基因植物》课件
未来转基因植物的研究将更加注重可 持续性和环境保护，例如开发抗旱、 耐盐和固氮能力的转基因作物。
此外，随着基因编辑技术的发展，如 CRISPR-Cas9系统，将有望实现更为 精确和高效的基因操作，为转基因植 物的研发带来更多可能性。
03
转基因植物的优缺点
转基因植物的优点
01
02
03
04
提高抗逆性
转基因植株的抗逆性分析
检测转基因植株对环境胁迫的抗逆能力，如抗虫 、抗病、抗旱等。
ABCD
转基因植株的表型分析
比较转基因植株与非转基因植株在生长、发育、 产量等方面的差异。
转基因食品的安全性评估
根据国际公认的转基因食品安全评价标准，对转 基因食品进行全面的安全性评估。
05
转基因植物的实际应用
转基因作物的种植
转基因植物的应用
转基因植物在农业生产中具有广泛的应用，可以提高作物的产量和品质，降低生 产成本，提高农业生产效益。
此外，转基因植物还可以用于生物能源、生物医药、环境保护等领域，为人类社 会的可持续发展提供重要的技术支持。
02
转基因植物的研发历程
转基因植物的起源
转基因植物的起源可以追溯到20世纪70年代，当时科学家开 始研究通过改变植物基因来改良作物。
02
转基因技术是现代生物技术的重 要组成部分，它能够打破物种界 限，实现基因在不同物种之间的 转移和表达。
转基因植物的种类
根据外源基因的来源和功能，转基因 植物可以分为抗虫转基因植物、抗病 转基因植物、抗除草剂转基因植物、 抗逆境转基因植物等。
此外，根据转基因的目的和应用，还 可以将转基因植物分为食用转基因植 物、非食用转基因植物、工业用转基 因植物等。
基因工程转基因植物PPT课件
。操作简便、成本低。
1.2.2 载体介导转移系统
最常见的转基因方法,具体方法有农杆菌介导法、 病毒介导法等。
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外 源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复 制和表达。
农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(rootindcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最 多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中 。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生 出转基因植株。
关键特征:主要适用于双子叶植物和祼子植物 实例: 农杆菌转化法示意图：
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数 禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因 植株。
(3) 微注射法
细胞操作：
利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方 式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将 供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。
子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作
Ti Plasmid
T-DNA region
auxin
Left border
Right border
vir genes oriቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
已知农杆菌 附着到植物 细胞后，只 留在细胞间 隙中。TDNA首先在 细菌中被加 工、剪切、 复制，然后 转入植物细 胞。
（2） Ti质粒的功能区域
※ T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农 杆 菌 侵 染 植 物 细 胞 时 ， 从 Ti 质 粒 上 切 割 下 来 转 移 到 植 物 细 胞 的 一 段 DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
1.2.2 载体介导转移系统
最常见的转基因方法,具体方法有农杆菌介导法、 病毒介导法等。
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外 源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复 制和表达。
农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(rootindcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最 多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中 。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生 出转基因植株。
关键特征:主要适用于双子叶植物和祼子植物 实例: 农杆菌转化法示意图：
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数 禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因 植株。
(3) 微注射法
细胞操作：
利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方 式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将 供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。
子房注射法或花粉管通道法： 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作
Ti Plasmid
T-DNA region
auxin
Left border
Right border
vir genes oriቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
已知农杆菌 附着到植物 细胞后，只 留在细胞间 隙中。TDNA首先在 细菌中被加 工、剪切、 复制，然后 转入植物细 胞。
（2） Ti质粒的功能区域
※ T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农 杆 菌 侵 染 植 物 细 胞 时 ， 从 Ti 质 粒 上 切 割 下 来 转 移 到 植 物 细 胞 的 一 段 DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
第十章 转基因植物的检测与鉴定
二、外源基因整合的PCR-Southern检测
该方法是先对被检测材料进行外源基因的PCR扩增， 然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带 进行杂交。 注意：设置三个对照 空白对照：无任何DNA模板；
阳性对照：以外源基因的重组质粒DNA为模板；
阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。
图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图
3、标记方法
放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外 标记法包括化学法、酶法和PCR法
酶法：是先将标记物标记在核苷酸上，然后通
过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸 序列中，产生合适探针。 包括切口平移法及随机引物法。
PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到 PCR产物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP荧光素 标记的dNTP）所得PCR产物可用作探针。 化学法：是通过标记物的活性基团与核酸分子 中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记 物直接与核酸分子相连。
抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物 素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与 被检的单链DNA中同源序列杂交，检出时，加入被酶等 标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生 物素蛋白特异结合，形成杂交DNA-生物素-抗生物素酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的 标记物性质进行检出。
一、ELISA检测
1、抗体的制备
抗体：是机体应抗原刺激产生的一组特殊的 球蛋白，Ig表示。
ELISA检测中涉及的抗体有两种，未标记的抗 体和酶标记的抗体，酶标记的抗体有包括两 种：一是针对特异抗原的酶标一抗，一是针 对一抗的酶标二抗。
10转基因植物2012
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。 因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生 出转基因植株。 关键特征:主要适用于双子叶植物和祼子植物 实例: 农杆菌转化法示意图：
最常见的转基因方法,具体方法有农杆菌介导法、 病毒介导法等。
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外 源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复 制和表达。
农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(rootindcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最 多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
1.1 受体
1.1.1 叶盘
采用打孔器对叶片进行打孔，得到圆叶片（叶 盘 ），致使叶片四周都有伤口，与对数生长期的一定 浓度的农杆菌浸泡一定时间（数秒-数分），取出叶圆 片，用滤纸吸干，置于无选择剂培养基上，共培养23天，无菌水冲洗或直接于选择培养基上培养。对双 子叶植物较适合。
叶盘法
双子叶植物较为常用、简单有效的方法。
1.3.1 选择性培养检测（抗性基因检测）
一般用抗性基因来富集转化细胞。抗 性基因应满足以下几点：
A. 抗性基因应是显性基因。 B. 在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非转 化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。 C. 抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或发 育有抑制作用。 D. 选择物价廉易得。
1.2.3 花粉管通道法
**花粉管通道法是将外源DNA涂抹于植物柱头，通过植 物授粉，经天然的花粉管通道将外源DNA经珠心进入胚 囊，以达到遗传转化的目的。 **特点：是方便易行，不需专门仪器和昂贵药品；直 接得到转化的种子；受季节限制。
《转基因植物》PPT课件
编辑课细胞包埋于固体基 质中，成为一个固定的生物反映系统。包埋的基质： 多糖和多聚化合物，如褐藻酸盐、琼脂（糖）、聚丙 烯酰胺、角叉莱胶。由于这些支持物胶体本身的交联 方式，使之对养料、水分及气体有一定的通透性，在 不同程度上维持细胞的生物活力，从而得证进行生化 反映的酶系和辅助因子的存在。基于此原理，在细胞 产生次生产物的时期，就将其固定化，加以营养介质 及底物进行反应，将其制成颗粒状，注入柱式反应器， 就可以进行连续循环反应。通过固定化细胞进行连续 培养始实现商业化生产的有效途径。
编辑课件ppt
9
C代谢产物胞外释放 由于大部分有用的次生代谢物 并不释放到培养基中，而是储存于液泡中，传统的提 取药用次生代谢物的方法始破碎细胞，使细胞只能一 次性的使用。解决储存液泡中的次生代谢物使之释放 到胞外也是通过固定化细胞进行连续培养要解决的一 个主要问题。已发展出了化学试剂法、改变离子强度 法、PH扰动法、电击法等。
利用培养的植物细胞生产次生物质
植物细胞不仅具有形态建成的全能性，还具有
物质代谢的全能性，通过药用植物细胞或组织
的大量培养，可以获得某些有用成分，特别是
用化学手段合成困难的药物。目前通过组织培
养成细胞培养的药用成分有生物碱，甙类、甾
醇，萜稀类、醌类、木质素类、黄酮类、糖类、
蛋白类、有机酸类、芳香油、酚类等上百种。
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3.4.3 建立适宜的培养程序和条 件，保证细胞系高产稳定
a二步法 从许多植物细胞培养与次生产物的形成来 看，生物合成作用往往在细胞生长的后期，据此提出 二步培养发（two-step culture）。第一步培养基称 为生长培养基，主要适合于细胞的生长；第二步称为 生产培养基，用于次生产物的合成。两种培养基往往 有所区别，后者通常具有较低含量的硝酸盐或磷酸盐， 或两者含量均较低。此外，通常也含有较低的糖分或 少量可利用的碳源。二步培养已在许多药用植物细胞 培养中得到应用。日本首次利用紫草细胞工业化生产 紫草宁用二步法。Mei等（1996）在10L反应器中采 用二步培养技术培养红豆杉细胞，20天后生物增加 了3倍，经过比较，生长基中紫杉醇含量很低 （0.8mg/L），生产基中达19.4—27.5mg/L。
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双元载体转化
花粉管通道法
将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注 入 柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道通过珠心 进 入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵或早期胚性 细胞。由
病毒感染法： Viruses can be used as vectors for whole plants
cell-to-cell infection
Ti plasmid：双链共价闭 合环状DNA分子，约 150～200Kb
农杆发根菌的生物学特性
发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） ：土壤细菌，能侵染大
多数双子叶植物和少数单子叶植物
Ri质粒
Ri质粒(root-inducing plasmid)：T －DNA区、Vir区两个功能区
Ri
opine catabolism
ori
Ti质粒介导的转化方法
Ti质粒衍生的克隆转化载体必须具备以下的结构 特点 1）具有选择标记基因 2）DNA复制起始位点 3）T－DNA右边缘序列 4）单克隆位点 5）vir区域 方法：利用双元载体系统和共整合载体系统解决
共整合转化--载体和农杆菌质粒重组过程
基因枪介导的DNA转移
• 基因枪法最早是由美国康奈尔大学 的Sanford最先提出的。它通过高 速飞行的金属颗粒将包被其外的目 的基因直接导入到受体细胞内，从 而实现基因转化的方法。1992年， 世界首例转基因小鼠就是通过该法 获得的。
基因枪转化的原理
载体介导法：根癌农杆菌介导的基因转移：Ti质粒 (tumor-inducing plasmid) 转移DNA(transfer DNA,T-DNA)
4.胚状体再生系统是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力 强，嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。 5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基 因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体 培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化， 如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等
第二节 基因改良植物
✓ 抗除草剂的转基因植物（最早进入田间生产，目前栽培面 积最大）如 Monsanto 的抗除草剂草甘膦大豆
✓ 抗虫转基因植物 如 Syngenta的Bt 176抗虫玉米 ✓ 抗病转基因植物 （抗病毒，抗真菌，抗细菌） ✓ 抗环境胁迫转基因作物 （温度、水分、化学物） ✓ 植物发育调节基因工程 （控制果实成熟，雄性不育，改良
植物品质） ✓ 医药领域中的转基因植物（利用植物作为生物反应器，生
产药用蛋白、食用疫苗等）
遭受虫害的普通玉米
抗虫的Bt转基因玉米
转基因植物的生产实践：
样品比较（左为普通棉花， 右为兔毛转基因棉花）
抗除草剂大豆
实例：抗TMV（烟草花叶病毒）的转基因番茄
分
目的基因
基因载体
切
接
重组体
转 筛
总 体基 技因 术工 路程 线
表
转基因植物研究发展
1983年，转基因烟草问世 ---世界上第一例转基因 植物。 1987年，转基因油菜、棉花产生 转基因水稻、玉米、小麦、甘薯等陆续出现。 转基因作物商业化：遍布6大洲 预测：2020年世界上80％-90％的农作物将是转
第十章 转基因植物 Transgenic Plant
转基因植物
将外源基因导入植物细胞，经组织培养， 获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。
抗虫 抗病 抗逆 生产药物
由中国农科院开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性，与对照 相比减少农药用量80。
中国"黄金大米"事件
不会引起过敏的大豆
彩色玉米
microinjection
转基因植物鉴定
1.选择性培养检测：利用抗生素标记基因筛选 2.遗传标记检测：通常选择具有特殊遗传标记的质 粒，常用的遗传标记有：β-葡糖苷酸酶基因荧 光素酶基因。 3.目的基因检测：PCR，分子杂交技术
绿色荧光蛋白检测 GFP产生绿色荧光蛋 白，在395nm和 490nm的波长下发 出独特的绿色荧光。
T-DNA区插入到寄主植物基因组中，
表达决定发根生长和冠瘿碱合成的 基因，冠瘿碱的检测是评价植物转 化是否成功的证据之一 。
E
D C
G vir
Vir区不插入寄主植物基因组DNA B 中，但与T-DNA的转移有关，其缺 A
失或突变ห้องสมุดไป่ตู้能使感染的植物出现发
根。
T-DNA
LB RB
Hairy root genes and opine synthase
2.直接分化再生系统 外植体细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直 接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定 缺点：材料局限，转化率低。 3.原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获 得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少 ，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
基 因植物
受体材料的选择
受体是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植 物基因转化受体系统应满足如下条件： 1、高效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性； 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4、对筛选剂敏感； 5、转化率高。
常用的受体材料有以下几大类型:
1.愈伤组织再生系统 外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化 （带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得 再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，转 化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生 系统。
植物转基因的基本技术路线
◆ 获得目的基因，克隆到载体上扩增 ◆ 受体细胞培养：如植物愈伤组织等 ◆ 目的基因导入受体细胞 ◆ 培养转化细胞 ◆ 筛选、培植、鉴定
质粒载体
苏云金杆菌 毒蛋白基因
棉花 棉花细胞
抗虫棉的构建
重组质粒构建 农杆菌
侵染转移 转基因棉花
转基因方法
◆ 直接导入法 基因枪法（1987年） ◆ 载体介导法：农杆菌介导转化法 （1974年） ◆ 病毒感染法