人脐静脉内皮细胞的原代传代冻存复苏及鉴定

人脐静脉内皮细胞的原代培养和传代、
冻存、复苏及鉴定
1人脐静脉内皮细胞的分离及培养
1.1 原代血管内皮细胞的获取与培养
在细胞的获取方法上，有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。

前两种易混杂其他血管壁细胞,近年已逐渐被酶消化法取代。

其中胰蛋白酶灌注法及胶原酶消化法获取原代人脐静脉血管内皮细胞的方法。

1.1.1胰蛋白酶消化法
在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。

一端插上带有胶管的玻璃管后结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。

待脐静脉内的残血除净后，用37℃磷酸盐缓冲液(浓度0.01 mol/L，pH=7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8~10 mL，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。

37℃孵育12 min，在此期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。

取出脐带轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50 mL锥形离心管中，加入小牛血清2 mL终止酶反应，再以30 mL磷酸盐缓冲液冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000 r/min离心10 min，弃上清(小牛血清及磷酸盐缓冲液)，加入含有10%小牛血清的IMDM培养液，充分混合制成细胞悬液。

取0.1mL细胞悬液在血细胞计数板计数。

最后调细胞数，以1×105mL接种至24孔培养板中，每孔1mL。

置于5% CO2，37℃静止培养24 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。

以后每隔2天换液1次，维持细胞的营养和内环境稳定。

1.1.2胶原酶消化法
在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，用磷酸盐缓冲液
初步清洗，找到脐静脉后，用50 mL注射器吸取磷酸盐缓冲液反复灌注冲洗，洗净残留的血液后用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入15mLⅡ型胶原酶。

超净台内温度一般高于室温，此条件下胶原酶作用15min，期间可不时晃动。

消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取1倍于消化液体积的内皮细胞培养基灌洗消化后的血管，收集并与消化液合并，900 r/min离心10min，弃去上清，加入事先孵育至37℃的细胞培养液，吹打均匀。

取明胶包被的六孔细胞培养板，吸去明胶，每孔加入内皮细胞悬液2.5mL，置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中静置培养，24 h后更换培养液以除去未贴壁的细胞。

然后每隔3d换液1次至生长汇合。

1.2 传代内皮细胞的培养
原代内皮细胞融合后用培养液冲洗2次，然后用0.25%胰酶和0.25%乙二胺四乙酸以1：1的比例充分混匀后加入到内皮细胞中，每孔0.3 mL。

边消化边在倒置显微镜下观察。

细胞出现皱缩、边缘略变圆、彼此分离或呈大片状分离，此时即可吸弃消化液终止消化。

加入含有10%小牛血清的培养液，用吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按10个细胞/mL，并置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中继续静置培养。

每隔2~3d换液1次。

1.3 人脐静脉内皮细胞的冷冻和复苏
传代细胞贴壁80%后0.25%胰酶消化，离心1200 r/min，5min，弃上清，加入冻存液(含10%甘油、90%细胞外基质)重悬后置4℃30 min，-20℃2 h，-80℃过夜后置入液氮中保存。

复苏时在37.2℃水浴中迅速轻摇解冻，胎盘蓝染色，计算细胞存活率。

1.4 影响脐静脉内皮细胞体外生长的因素
影响脐静脉内皮细胞体外生长的因素包括：
1培养液的pH值。

最适pH值为7.0~7.2，脐静脉内皮细胞耐酶不耐碱，pH 值为7.4时贴壁困难，pH值7.6以上贴壁细胞脱落受损失去活力。

2培养支持物酸性质。

进口的塑料培养瓶、培养板是最理想的支持物，特别是原代、第1代、第2代。

3血清质量。

新鲜的人类血清在维持人脐静脉内皮细胞生长比胎牛、小牛等动物血清好得多，可能与人血清更接近体内生存的条件有关。

2人脐静脉内皮细胞的鉴定
2.1 倒置相差显微镜观察
人脐静脉内皮细胞在4h时可见部分细胞贴壁，伸出伪足。

24 h时，细胞完全贴壁，并呈单层排列，边界清楚，为圆形、短梭形或扁平多角形。

4~5d融合成单层，如铺路石镶嵌排列，有些细胞则呈鱼贯状相连，间有旋涡状排列。

传代细胞生长较旺盛，可见核分裂象。

随传代次数增加，细胞生长缓慢，呈纤维化、老化改变。

2.2 透射电镜观察
透射电镜下，内皮细胞核膜清晰，细胞质内多微丝、微管结构，在少数细胞核周的细胞质中可见内皮细胞所特有的杆状小体，即Wei-bel-Palade小体，其为质膜所包裹，横切面呈圆形或椭圆行，内有微管样结构。

Weibel-Palabe小体在细胞质中的检出，对内皮细胞鉴定具有特异性，但并非每个细胞皆能检出，故意义不大。

2.3 CD34免疫组织化学染色
CD34是一种细胞分化抗原和选择素的配体，自从发现血管内皮细胞有CD34的基因表达后，常被用来标记血管内皮细胞。

由于CD34阳性表达强于第Ⅷ因子,因此,它被认为是目前血管内皮细胞最可靠的标记。

CD34免疫组织化学染色显示,原代及传代细胞的细胞质内均有阳性染色，细胞轮廓清楚，阴性对照无此反应，证实所培养的细胞为脐静脉内皮细胞。

2.4 血管性血友病因子相关抗原间接免疫荧光检查
经研究认为血管性血友病因子相关抗原免疫荧光检测最为可靠，因为在人体内，除内皮细胞外，仅在血小板和巨核细胞中存在血管性血友病因子相关抗原，故可与血管平滑肌和成纤维细胞相鉴别。

免疫荧光检测：显示原代及传代培养的内皮细胞的细胞质中有黄绿色荧光着色，胞核呈黑绿色，整个细胞轮廓清楚。

作为对照的内皮细胞玻片中，偶见绿色斑点散发荧光，未见细胞轮廓。

2.5 CD144的检测
CD144为内皮细胞特异性标志，常用检测方法有免疫细胞化学法、反转录-聚合酶链反应检测及Western blot检测法。

CD144免疫细胞化学阳性细胞，染色表现为胞膜着棕黄色颗粒；反转录-聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞目的基因CD144有较强表达；Western blot检测传代的人脐静脉内皮细胞，显示高表达CD144，表明内皮细胞的特性保存完好。

2.6 第Ⅷ因子抗原检查
因第Ⅷ因子只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中,故它可作为内皮细胞的鉴定标准。

第Ⅷ因子抗原检查包括:1免疫荧光法。

免疫荧光法可见内皮细胞的细胞质呈黄绿色荧光，核周尤其明显，包核清楚，细胞轮廓清晰。

2免疫组化法。

免疫组化法结果可观察到内皮细胞的细胞质内呈棕黄色沉淀，以核周最为明显，胞核不着色，细胞界限清楚。