酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权

【摘要】在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点.因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键.研究中,从酿酒酵母基因组中扩增

得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体pNTS2K中,得到4种复制整合型载体(pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS735、pNTS2 K-ARS1512).经电转化后,4种转化子(36a(pNTS2 K-ARS304)、36a(pNTS2K-ARS315)、36a(pNTS2K-ARS735)、36a(pNTS2K-ARS1512))都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上生长.然而,只有转化子

36a(pNTS2K-ARS315)能在含有500 μg/mL G418的YPD液体培养基里较快生长.经过G418耐受性检测后,36a(pNTS2K-ARS315)仍能在含有1 mg/mL G418

的YPD培养基中很好地生长.此外,通过质粒pNTS2 K-A RS315表达荧光蛋白,其

表达效果高于普通商业质粒.实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主

复制,其中ARS315复制能力最强.因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础.%In the case of yeast expression,low-copy number of transformed genes and low stability are disadvantages of the conventional types of expression

vectors.Therefore,finding a high effective Saccharomyces cerevisiae autonomously replicative sequence (ARS) that can be used for construction of replicative/integrated plasmid is significantly important.In this study,four different ARSs (ARS304,ARS315,ARS735,and ARS1512) were amplified from Saccharomyces cerevisiae and inserted into integrated

yeast vector pNTS2K and four plasmids pNTS2K-ARS304,pNTS2K-

ARS315,pNTS2K-ARS735,pNTS2K-ARS1512 were obtained.All the four plasmids were successfully transformed into S.cerevisiae and all transformants were able to grow on YPD plate containing 300 μg/mL of

G418.However,only transformant containing plasmid pNTS2K-ARS315 was able to grow well in the YPD medium containing 500 μg/mL of G418.After G418 tolerance detection,36a (pNTS2K-ARS315) still could grow well in YPD medium containing 1 mg/mL of G418.Furthermore,the expression of the fluorescent protein by the plasmid pNTS2K-ARS 315 was higher than that by the ordinary commercial plasmid.It can be concluded that all of the four ARSs functioned and the ARS315 had the highest replicate ability in S.cerevisiae.Consequently,ARS315 can be potentially used for high expression and stable recombinant strain construction and metabolic engineering of S.cerevisiae.

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2017(043)003

【总页数】6页(P20-25)

【关键词】酿酒酵母;自动复制区;高拷贝复制整合型质粒;荧光蛋白

【作者】沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权

【作者单位】江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技

术实验室,新加坡;江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122

【正文语种】中文

在酵母表达蛋白以及其他有机产物的过程中，通过增强转化过程中的酶活性来加快产物生成是研究者公认的观点，而高表达特异性酶是解决问题的主要途径。寻找1个新颖匹配的启动子或构建1个高效表达系统是非常困难且需要大量的时间。向

宿主细胞中引入大量目的基因是最先广泛采用的方法。在酵母表达过程中，传统的表达载体YEP，YCP和YIP常常被用来引入外源基因。但是，YCP和YIP存在低

拷贝的缺点，而YEP表达不稳定[1]。高拷贝数地将目的基因整合入酵母基因组是

高表达且稳定的必要途径。酵母自动复制区作为酵母染色体复制起点，在染色体复制过程中起着至关重要的作用[2-3]。如果这些位点发生突变会导致ARS失去活性，进而影响到复制起始的功能[4]。其活性还可能与其他诸如ARS侧翼序列特征，染色体定位，染色体修饰等因素有关。每条染色体复制都是在间隔40～100 kb的多个位点起始的，每个起点在1个细胞周期的中期S期相继被激活，起始1次染色

体复制[5-7]。在酵母基因组中，存在着300多个自动复制区，而找到高效的自动复制区是构建高拷贝质粒的前提。本实验在酿酒酵母整合载体pNTS2K中的Nde I和EcoR I之间(见图1)分别引入4种ARS，筛选出高效的复制区ARS315，从而构建了一种高效的复制整合型载体pNTS2K-ARS315。通过质粒pNTS2K-

ARS315表达荧光蛋白，其表达效果高于普通商业质粒。因此，这种质粒可以在

G418抗性基因KanMX两侧，2个rDNA片段之间(见图1)引入多个表达框。随

着G418抗性的选择压力，尽可能多的将外源基因表达框整合在酵母基因组多拷

贝rDNA区域，为以后外源基因的高效稳定表达奠定了基础。

1.1 材料