超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定猪尿中金刚烷胺与金刚乙胺的残留量

超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定猪尿中金刚烷胺与金

刚乙胺的残留量

胡丽芳;张金艳;罗林广

【摘要】采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)在多反应监测(MRM)模式下建立了猪尿中金刚烷胺和金刚乙胺残留量的检测方法.尿样经乙腈超声提取,Oasis MCX固相萃取柱净化后,使用Eclipse Plus C18柱(RRHD

1.8μm,

2.1 mm× 100 mm)进行分离,以甲醇-0.19％甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子(ESI+)模式电离,多反应监测(MRM)模式进行定性定量测定.色谱保留时间和质谱碎片的离子丰度比定性,内标法定量.结果表明,2种待测物在

0.2～20.0 μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.999,该方法测得在猪尿样液中,金刚烷胺和金刚乙胺的检出限(LOD)均为0.05 μg/L,定量下限(LOQ)均为0.2 μg/L;平均加标回收率为89.7％～ 102.8％,日内相对标准偏差为2.8％～4.2％.【期刊名称】《分析测试学报》

【年(卷),期】2014(033)006

【总页数】5页(P678-682)

【关键词】超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(UPLC-ESI-MS/MS);金刚烷胺;金刚乙胺;猪尿

【作者】胡丽芳;张金艳;罗林广

【作者单位】江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所农产品质量安全重点实验室,江西南昌330200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所农产品

质量安全重点实验室,江西南昌330200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所农产品质量安全重点实验室,江西南昌330200

【正文语种】中文

【中图分类】O657.63;TQ460.72

金刚烷胺是人工合成饱和三环癸烷的氨基衍生物，用于亚洲A型流感病毒的预防和早期治疗，也可用于治疗帕金森病引起的神经障碍和预防动物常见的病毒类疾病如禽流感等［1－2］。金刚乙胺是金刚烷胺类似物，也用于预防和治疗A型流感病毒感染，临床疗效优于金刚烷胺，且不良反应小于金刚烷胺［3－4］，金刚烷胺和金刚乙胺的结构式见图1。我国于2005年12月发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，禁止金刚烷胺等抗病毒药作为兽用药，但由于其价格低廉、效果良好，仍有不法分子大量使用金刚烷胺和金刚乙胺用于动物疾病的预防和治疗。滥用金刚烷胺类药物会导致动物中毒，使病毒产生不同程度的耐药性，并诱发病毒产生变异［5－7］，严重影响了国家动物疫病防控工作。

目前，金刚烷胺的检测方法主要有气相色谱法(GC)［8－9］、液相色谱法(LC)［10－11］及液相色谱－串联质谱法(LC－MS/MS)［12－16］。但这些方法多应用于血液、医药和动物组织中金刚烷胺类药物的测定，而针对动物尿液中金刚烷胺类药物残留的检测方法未见报道。由于大部分药物是通过尿液排出体外，且猪尿样品可以活体采样，在生猪屠宰前即可快速检测生猪中是否含有金刚烷胺类药物残留，从而达到从养殖源头控制禁用药物使用的目的。因此，建立猪尿中金刚烷胺类药物残留的检测方法，对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要意义。本文采用乙腈提取，MCX小柱净化，Plus C18色谱柱分离后，以超高效液相色谱－质谱联用仪对金刚烷胺和金刚乙胺进行检测，同位素内标法定量。

该方法快速、科学、可靠、灵敏，用于实际样品的检测，结果满意。

图1 金刚烷胺(A)和金刚乙胺(B)的结构式Fig.1 Structures of amantadine(A)and rimantadine(B)

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6460三重四极杆串联质谱仪、Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm，2.1 mm×100 mm)(美国Agilent公司);CR22GⅢ型高

速冷冻离心机(日本日立公司);Organomation N－EVAP－24型氮吹浓缩仪(美国Organomation公司);KQ－400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);GL－88B型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造公司);固相萃取真空装置(美国Agilent公司);Milli-Q纯水系统(Millipore公司);Waters Oasis MCX固相萃取柱(Waters公司，3 mL/60 mg)。

甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国Fisher Scientific公司);氨水:含量为25%～

28%(质量分数);金刚烷胺、金刚乙胺和金刚烷胺-D15(纯度≥98.0%，Sigma公司)。实验用水为Milli-Q超纯水系统制备的二次水。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液:称取适量上述标准品，用甲醇分别配制成1.0 g/L的标准储备液，于

－18℃避光储存。

金刚烷胺和金刚乙胺混合标准中间液:取上述标准储备液各1 mL，用甲醇稀释成质量浓度为10 mg/L的混合标准中间液，于－4℃下避光储存。

金刚烷胺-D15标准工作液:取金刚烷胺-D15标准储备液1 mL，用甲醇稀释成质

量浓度为10 mg/L的标准中间液，再用甲醇－水(1∶1)溶液稀释成质量浓度为200.0 μg/L的标准工作液，于－4℃下避光储存。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件色谱柱:Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm，

2.1 mm×100 mm)。流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序:0～

3.0 min，10%～60%B;3.0～

4.5 min，60%～100%B;4.5～4.6 min，100%～10%B;4.6～6.0 min，10%B。流速0.25 mL/min;柱温30℃;进样体积

5.0 μL。

1.3.2 质谱条件电离模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+);检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:4 000 V;离子源温度(TEM):325℃;干燥气温度:300℃;干燥气流量:15 L/min;雾化气压力:50 psi;鞘气温度:400℃;鞘气流量:12 L/min。

1.4 样品前处理

准确量取5 mL猪尿样品于50 mL离心管中，加入金刚烷胺-D15标准工作液20 μL、乙腈10 mL，涡旋混匀2 min，置于超声波清洗器中超声提取20 min后加

入氯化钠2.0 g，涡旋混匀2 min，以8 000 r/min离心5 min，吸取上清液于另一50 mL离心管中，重复提取1次，合并两次上清液加载至已依次用3 mL甲醇、3 mL水活化过的MCX柱中，再依次用3 mL 2%的甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，减压抽干，用5 mL 5%的氨水甲醇溶液(体积比)洗脱;洗脱液在60℃下用氮气吹干后，用1 mL 0.1%甲酸水溶液－甲醇溶液(90∶10，体积比)溶解残渣，涡旋30 s，经0.22 μm滤膜过滤后，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

参考文献［10－16］，比较了甲醇、乙腈、1.0%三氯乙酸－乙腈(50∶50)和1.0%三氯乙酸－甲醇(50∶50)作提取液的提取效率，并对提取方法、提取时间等条件进行了研究。结果表明，采用纯乙腈作为提取液时，金刚烷胺和金刚乙胺的提取平均回收率均大于97.9%，而甲醇、1.0%三氯乙酸－乙腈(50∶50)和1.0%三氯乙酸－甲醇(50∶50)3种溶剂的提取平均回收率分别为83.5%，91.1%，86.8%。因此，纯乙腈对猪尿中金刚烷胺和金刚乙胺的提取效果总体最佳，这可能是因为尿液样品