酶联免疫标记技术
酶联免疫吸附实验
记录结果有下列几种方法： 1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4） 的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴 性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以 一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到 的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度 能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该 标本的滴度。
（三）试验样品
（四）结合物
(五）洗涤剂与稀释剂
（六）底物
（七）作用时间
（八）结果判断
(九)试验的重复性（精确度）
（十）对使用仪器要求
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（一）固相载体
在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑 料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能 是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型 及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺 不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚 至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须 经过实验室鉴定 。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一 个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检 测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。 以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数， 再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。
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（十）对使用仪器要求
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（八）结果判断
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反 应的深浅作出判断，也可用分光光度计作 精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观 察更为简便，而且也有一定正确性。
酶联免疫吸附的原理和步骤
酶联免疫吸附（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于医学、生物学、生物化学、环境监测等领域。
它主要是通过酶标记抗体或抗原与待检测样品中的特定分子发生特异性反应，利用酶的催化作用来检测目标物质的存在量和浓度。
一、酶联免疫吸附的原理酶联免疫吸附的原理是基于免疫学和酶学的原理。
它利用抗体和抗原之间的特异性结合关系来检测待测物质的存在和浓度。
ELISA的原理主要分为两种类型：直接ELISA和间接ELIS A。
直接ELISA是将酶标记的抗体或抗原直接与待检测物质结合，然后用底物检测酶的活性，从而测定待检测物质的存在和浓度。
间接ELISA是将待检测物质与特异性抗体结合，再加入酶标记的二抗与第一抗体结合，最后用底物检测酶的活性，从而测定待检测物质的存在和浓度。
二、酶联免疫吸附的步骤酶联免疫吸附的步骤主要分为以下几个方面：1.涂层：将抗体或抗原涂在微孔板上，使其与微孔板表面结合。
2.阻断：用蛋白质或其他物质阻止非特异性结合。
3.样品加入：加入待测样品，使其与涂层的抗体或抗原发生特异性结合。
4.洗涤：用缓冲液洗去未结合的物质。
5.酶标记的抗体或抗原加入：加入酶标记的抗体或抗原，使其与待测物质结合。
6.洗涤：用缓冲液洗去未结合的物质。
7.底物加入：加入底物，使其与酶发生反应，产生可测量的信号。
8.停止反应：加入停止反应剂，停止底物的反应。
9.测量：用酶标仪或光度计测量信号的强度，从而计算出待测物质的存在量和浓度。
三、酶联免疫吸附的实际应用酶联免疫吸附在医学、生物学、生物化学、环境监测等领域都有广泛的应用。
1.医学应用：酶联免疫吸附可以检测血清中的病原体抗体，如乙肝病毒、艾滋病毒等；检测血清中的肿瘤标志物，如癌胚抗原、前列腺特异性抗原等；检测血液中的药物浓度，如抗生素、抗癌药物等。
2.生物学应用：酶联免疫吸附可以检测细胞因子、酶、蛋白质等生物分子的存在和浓度，用于研究生物学过程和疾病机制。
3.环境监测应用：酶联免疫吸附可以检测水、土壤、空气中的污染物，如重金属、有机物、农药等，用于环境监测和污染物的快速检测。
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法是一种用于检测和定量分析特定蛋白质的技术方法。
以下是一般的酶联免疫操作方法的步骤：
1. 杂交：将待检的抗原或抗体固定在固相载体上，如微孔板或膜。
可以通过直接插入法或被动吸附法将抗原或抗体与载体结合。
2. 阻断：在固相载体上，加入一种非特异性蛋白质（如牛血清蛋白，BSA）或洗脱缓冲液来阻断未被固定的表面；这样可以减少非特异性结合。
3. 反应：加入待测样品，使其与固相上的抗原或抗体结合。
待测样品可能是抗原，也可能是抗体。
4. 洗涤：用洗涤缓冲液彻底洗涤固相载体，以去除未结合的物质，尤其是非特异性结合。
5. 标记：加入与待检测物质相匹配的标记物，如酶标签，荧光标记或放射性标记。
6. 反应：与酶标签或其他标记物相互作用，生成底物反应产物。
这种反应可用于颜色变化、荧光或放射性计数等信号读取。
7. 终止反应：加入终止试剂停止底物反应。
8. 测量：测量反应产物的信号强度，通过比较标准曲线或对照样品来定量待测物质的浓度。
以上是一般酶联免疫操作方法的步骤，不同的实验可以根据需要进行适当的调整。
酶联免疫吸附试验
全自动设备：
酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有 β-半乳糖苷酶、尿酶等。
1. 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛。是从辣根菜中提取的酶类，由糖 蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在 403nm 波长处有最大吸收峰，糖 蛋白在 275nm 波长有最大吸收峰，故用 A403nm 与 A275nm 比值代表纯度（reinheir zahl,RZ）。 用于酶免疫技术的 HRP，其 RZ 值应大于 3.0。但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ 不变 但活力下降。
基本原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物， 再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人 IgG 抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成 固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。 【操作步骤】
竞争法 ELISA 可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。 方法和特点: ①酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体 （抗原）结合的能力 ②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位 点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和 ③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性） 与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比
免疫吸附剂的制备
免疫吸附剂的制备（点击播放）
免疫吸附剂的制备：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂，将抗原或抗体固相化的过程称为包被 (coating)，若以聚苯乙烯为载体，包被方法是：将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为 pH9.6 的 碳酸盐缓冲液）中， 加入 ELISA 板孔中在 4℃过夜后甩弃孔内液体，用洗涤液清洗即可。如果 包被液中蛋白浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物 中的蛋白也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况 下，如在包被后再用 1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭 (blocking)。
酶联免疫分析技术
室 温 温 育 的 反 应 ， 操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在 规 定 的 范围 内 ， 标准 室 温温 度 是指 20-25℃ ， 应注 意 温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点， 一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯 作 为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处 有吸收峰。用 NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时 间。 AP也有发荧光底物（磷酸 4- 甲基伞酮），可用 于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的 比色法。
洗涤液
常用的稀释液为含 0.05% 吐温 20磷酸盐缓冲液。
异相法：
?Ab* A* *g*和Ab 分离，然后测定 Ab Ag 或Ab 的量， 从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
*
Ab *
Ab A g
均相法 ：
?Ab *Ag中的标记物 *失去特性，直接测定游离 Ab *的量，从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
* Ab *
Ab A g
1 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结 合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高 度的特异性。
2013-8-13
免疫检验
? 利用免疫检测原理检测与免疫相关的 物质（抗原、抗体、补体、细胞因子 等）
? 利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据 。
酶联免疫分析技术
酶联免疫吸附实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种广泛应用于生物医学科研和临床诊断的免疫学实验技术。
它利用酶标记的抗体或抗原结合特定抗体，通过酶催化产生的色素反应来定量检测目标物质的存在。
下面是ELISA实验的具体步骤及详细说明。
1. 酶标板涂布：将特异性的抗原或抗体溶液加入酶标板孔中，密封并在4℃下过夜静置，使抗原或抗体与酶标板表面结合。
通常使用96孔多孔板，每孔涂布50-100ng的抗原或抗体。
2.检测试样：将待测样品加入酶标板中，与已固定的抗原或抗体发生特异性结合。
样品可为血清、组织提取物、细胞培养上清液等。
3.洗涤：将酶标板孔倒置于洗液缓冲液中，轻轻拍打板子，使孔内的液体充分与缓冲液混合。
然后，倒掉液体，重复该步骤3次，以充分清洗非特异性结合的物质。
4.酶标记抗体添加：加入与目标物质结合后的酶标记抗体。
酶标记抗体可以是酶标记的二抗、酶标记的蛋白A、酶标记的蛋白G等。
它与样品中的目标物质结合形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
5.洗涤：同步酶标记抗体添加后的洗涤步骤，用洗涤缓冲液彻底冲洗非特异性结合的物质。
6.底物添加：将酶底物加入各孔中，酶底物通常是一种可被酶催化反应产生明显产物的物质。
常用的酶底物有TMB（3,3',5,5'—四甲基联苯胺）和ABTS（2,2'-联氨基二乙基苯并硫酸盐）等。
7.反应停止：在适当的时间内，加入酸性停止剂，停止酶催化反应。
酸性停止剂可以是含2MH2SO4或0.2MHCl的缓冲液。
8. 读取光密度：使用酶联免疫吸附测定仪（ELISA Reader）测量各孔的光密度。
光密度与目标物质的浓度成正比。
一般使用450nm波长进行测量。
9.结果分析：根据标准曲线上的光密度读数，可以计算出待测样品中目标物质的浓度。
通过与正常参照样品进行比较，可以确定是否存在异常浓度。
免疫酶技术及其应用-ELISA
待出现明显颜色反应（或一定时间）后，加入终止液， 50ul/孔以终止反应。
7. 结果测定
用酶标仪在492nm波长下测定OD值。 以标准抗原的浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标绘 制标准曲线，计算未知抗原的浓度。
•免疫酶技术及其应用-ELISA
四、思考题
• 在定量测定抗原时，直接ELISA与竞争ELISA有何 区别？从理论上分析一下各自的优缺点。
待测抗原： 取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。 250ul抗体
100ul 标准抗原
50ul
50ul
稀释板
50ul 稀释液
待测抗原 PBS
50ul
50ul
•免疫酶技术及其应用-3E7LI℃SA ，30 min
3. 与固相抗原的竞争结合
取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100μl，加入 酶标板的抗原孔中，放入37℃恒温培养箱中60 min。洗 板3次。
抗原100ul/孔
酶标板
湿盒中，4℃过夜
次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后 倾去），以洗去未包被的游离抗原。
•免疫酶技术及其应用-ELISA
• 抗原与抗体的预孵育
制作标准曲线：
在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度 的抗原最终为50μl，分别在各抗原孔中加入250μl一定浓 度的抗体，放入37℃恒温培养箱中30 min。
液 • 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS • 底物溶液：OPD-H2O2 • 终止液：2mol/L H2S04 • 酶标反应板（一条/人）
•免疫酶技术及其应用-ELISA
三、操作步骤
• 包被抗原
抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标 板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜。
酶联免疫方法检测细胞因子步骤
酶联免疫方法检测细胞因子步骤酶联免疫方法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究领域的检测技术，它能够快速、准确地检测细胞因子等生物大分子的含量。
细胞因子是一类在调节和介导细胞间相互作用中发挥重要作用的细胞因子，它们在免疫反应、炎症反应和细胞信号传导等生理过程中具有重要的调节作用。
本文将对酶联免疫方法检测细胞因子的步骤进行详细介绍，让读者对该技术有一个全面的了解。
第一步：样品处理在进行酶联免疫法检测细胞因子之前，首先需要对样品进行处理。
样品处理的目的是提取细胞因子，并将其置于适宜的条件下以便后续的检测。
对于细胞因子的提取可采用离心、超声波破碎等方法，以获取高纯度的样品。
同时，对于血清、血浆等液体样品，还需通过凝胶过滤、醋酸纤维素柱层析等步骤进行净化处理，以去除样品中可能存在的干扰物质。
第二步：酶标记抗体的制备酶联免疫法的关键之一是酶标记抗体的制备。
酶标记抗体一般是通过将抗体与酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）进行共价结合而得到的。
在制备酶标记抗体时，需要考虑到抗体与酶的比例、结合条件等因素，并通过一系列的实验来优化制备条件，以确保酶标记抗体的稳定性和活性。
第三步：微板上样品的包被完成样品的处理和酶标记抗体的制备之后，下一步是将样品包被到微板上。
微板是一种通常由聚苯乙烯、聚碳酸酯等材料制成的微量反应容器，其表面具有一定的亲和性，可以吸附蛋白质等生物分子。
在将样品包被到微板上时，需注意包被的时间、温度等因素，以使样品能够均匀地吸附到微板上，并且保持其天然的构象和生物活性。
第四步：酶标记抗体的添加将样品包被到微板上之后，接下来就是添加酶标记抗体。
酶标记抗体作为二抗，可以与包被在微板上的靶分子结合，形成特异性的抗原-抗体复合物。
为了确保酶标记抗体的特异性和灵敏度，通常需要对酶标记抗体进行适当的稀释，并加入到微板上进行孵育。
第五步：底物的加入与反应在酶标记抗体添加完毕后，需要加入底物并进行反应。
临床常用标记免疫技术及特点
临床常用标记免疫技术及特点1.引言1.1 概述标记免疫技术是现代生物医学领域中常用的一种实验方法，其通过在生物样本中引入特定的标记物，来检测、定量或分析目标物质的存在和性质。
这些标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶或其他具有特异性的物质。
在临床医学中，标记免疫技术具有广泛的应用，可以用于诊断疾病、评估治疗效果、研究疾病机制等方面。
常用的标记免疫技术包括免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)等。
免疫荧光染色技术是一种利用特异性抗体与标记物结合后发出荧光信号的技术。
通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，可以定位、鉴定并定量分析目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的特点。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种利用特异性抗体与酶结合后，通过酶催化反应来产生可定量的信号的技术。
ELISA技术可以用于检测血清中的免疫球蛋白、抗原、抗体等多种生物分子，并可定量测定其浓度。
ELISA 技术具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点。
放射免疫测定(RIA)是一种利用放射性同位素标记分子，通过测量放射性同位素放出的射线来定量目标物质的技术。
RIA技术在测定极低浓度物质或微量物质时具有非常高的敏感性和特异性。
然而由于放射性同位素标记物的安全性和环境污染问题，RIA技术在临床实验室中的应用受到了限制。
总之，标记免疫技术在临床医学中具有重要的应用价值，可以帮助医生准确、快速地诊断疾病，评估治疗效果，深入研究疾病的发生机制。
随着科学技术的不断进步，标记免疫技术也在不断发展，将为临床医学带来更多的突破和进展。
1.2文章结构文章结构部分：本篇文章主要介绍临床常用标记免疫技术及其特点。
文章结构如下：第一部分为引言，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，将介绍免疫技术在临床应用中的重要性和广泛应用的背景。
在文章结构部分，将详细说明本篇文章的章节分布和内容安排。
在目的部分，将说明本文的目的和意义，为读者明确文章的目标。
简述酶联免疫吸附测定的原理
简述酶联免疫吸附测定的原理酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感、高通量的免疫技术，常用于检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
ELISA的原理基于抗体与抗原之间高度特异性的结合，以及酶底物反应的可见色素反应。
ELISA的基本原理如下：1. 酶联：先将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）上。
最常用的固相载体是聚丙烯酸酯（polystyrene），可以牢固地吸附抗原或抗体。
2.结合：在固相载体上固定的抗原与样品中的分子结合，以形成特异性的抗原-抗体复合物。
3.洗涤：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反复的洗涤步骤。
4.检测：加入与目标分子相关的抗体，这些抗体经过标记，通常是酶标记。
这些标记的抗体与复合物中的目标分子结合。
5.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合的物质。
6.底物-酶反应：加入合适的底物，底物与酶标记的抗体发生反应，并产生可见的色素物质。
7.读数：用光度计测量反应物的吸光度，吸光度的强度与样品中目标物的浓度成正比。
ELISA的优点是具有高度的特异性和敏感性，可以检测极低浓度的物质。
此外，ELISA还可以同时检测多个样品，并且操作相对简单，不需要昂贵的设备。
ELISA的应用广泛，特别是在医学诊断领域。
例如，ELISA可以用来检测一些疾病的标志物，如乳腺癌、艾滋病、流感等。
此外，ELISA还用于酶抗体检测、药物监测、细菌和病毒的检测等领域。
虽然ELISA是一种非常有用的技术，但也存在一些局限性。
ELISA对样品中的杂质比较敏感，可能会导致假阳性结果。
此外，ELISA只能检测已知的抗原或抗体，无法发现新的目标分子。
此外，ELISA需要时间较长（通常需要2-4小时）。
综上所述，酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种重要的免疫技术，通过抗原与抗体的特异结合和酶底物反应，可以准确、敏感地检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
竞争法
此法可用于小分子抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。被 结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如 果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就 减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点 在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
掌握免疫标记技术的基本原理。 掌握三大免疫标记技术的工作原理及主要实验类型的
原理和方法。 熟悉ELISA试验的实验设计原理。 了解免疫标记技术的应用与发展。
酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
酶联免疫吸附试验
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫 测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。
HRP催化过氧化物的氧化反应。
供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波 长为492nm
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后， 由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm .TMB性质较稳定，可 配成溶液试剂，只需与H2O2溶液进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需 稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝 标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原 的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
捕获法 测IgM抗体
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。
即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
免疫标记技术
• 100 ul of fresh substance (DAB) are added into each well.
Incubated at 37℃ for 20min. • 50 ul (one drop) of the stop solution are added into each well. • Read OD of each well at 490nm with a ELISA reader.
• 以胶体金为标记物的抗原抗体反应。 • 分类：定性：免疫电镜技术和免疫组织化学技术
半定量：常与膜载体技术结合，包括斑点金免疫渗滤
试验和斑点金免疫层析试验等。
• 胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，呈红 色，并能与蛋白质等大分子物质结合。
斑点金免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA)
• 三种试剂： ① 固相抗原或抗体 即把抗原或抗体用合适的方法连接到固 相载体表面，同时保留它们的免疫活性；
② 酶标抗原或抗体，即把某些酶用合适的方法连接到抗原或 抗体表面，同时保留它们的免疫活性以及酶的催化活性。 常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)； ③ 酶作用的底物 ：一般是能发生颜色改变的化合物，也可 以是发光类化学物质。
Immunogold labeling technique
the "rapid tests" that you might use to detect pregnancy, or diagnose an infection quickly in a doctor's office
胶体金免疫技术
Method
• Rabbit anti-human antibody are attached to the surface of microplate. (have been done)
酶联免疫吸附反应的技术进展及应用
ELISA的基本原理是利用抗原-抗体反应的特异性，将特异性抗体或抗原固相 化在固体表面上，再与待测样本中的相应抗原或抗体发生特异性结合，加入酶标 记的二抗，最后通过底物显色反应，定量或定性分析待测样本中的抗原或抗体。
随着生物技术的不断发展，ELISA技术也在不断进步。在抗体方面，越来越 多的重组抗体和基因工程抗体被应用于ELISA中，这些抗体的制备过程更加简单， 纯度和特异性更高。在标记技术方面，酶标记物的选择更加多样化，如碱性磷酸 酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶等，以满足不同检测需求。同时，一些新 型的检测系统，如微孔板、磁性颗粒和纳米材料等被引入到ELISA中，使得检测 更加灵敏、快速和自动化。
6、洗涤：清洗，去除未结合的酶标记抗体或抗原。
7、显色：加入底物溶液，酶催化底物生成有色产物，根据颜色深浅判断抗 原或抗体的浓度。
8、终止反应：加入终止液，停止酶催化反应。
9、读数：在酶标仪上读取各孔的光密度值，根据标准曲线计算抗原或抗体 的浓度。
三、ELISA酶联免疫吸附试验原 理
ELISA酶联免疫吸附试验基于抗原抗体反应的特异性。抗原和抗体分别固定 在固相载体和酶标记物上，当两者相遇时，发生特异性结合。通过洗涤步骤去除 未结合的成分，仅留下结合在固相载体上的抗原-抗体复合物。然后加入酶标记 的抗体或抗原，进一步与复合物中的抗原或抗体结合。最后加入底物溶液，酶催 化底物生成有色产物，根据颜色深浅判断抗原或抗体的浓度。
酶联免疫吸附反应的技术进展及应 用
酶联免疫吸附反应（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一 种基于抗原-抗体反应的经典免疫分析方法。在过去的几十年里，ELISA技术取得 了显著的技术进展，使其在生物医学、环境保护、食品检测等领域中的应用越来 越广泛。本次演示将介绍ELISA的技术进展及其在不同领域中的应用情况，并通 过案例分析探讨其优缺点和发展趋势。
第四代酶联免疫法
第四代酶联免疫法第四代酶联免疫法（第四代ELISA）是一种高度敏感且可靠的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
它是传统ELISA方法的改进版本，具有更高的灵敏度和特异性，能够快速准确地检测样品中低浓度的目标分子。
本文将介绍第四代酶联免疫法的原理、优势以及在实验室和临床中的应用。
一、原理第四代酶联免疫法主要由抗原涂覆、原位抗体结合、酶标抗体结合和底物显色等步骤组成。
与传统ELISA方法相比，第四代ELISA在前三个步骤中进行了改进，从而提高了检测的敏感性和准确性。
1.抗原涂覆：样品中的目标分子被固定到酶标板上，通常使用特定抗原、抗体或核酸进行涂覆。
2.原位抗体结合：在抗原涂覆的酶标板上加入待检样品，目标分子与酶标板上的特异性抗体结合。
3.酶标抗体结合：加入特定的酶标抗体，该抗体与目标分子的另一特异性位点结合，形成夹心复合物。
4.底物显色：加入适当的底物，被酶标抗体结合的酶可以催化底物的反应，产生可见的色素变化。
根据反应时间和底物的颜色变化程度，可以定量检测样品中目标分子的浓度。
二、优势第四代酶联免疫法相较于传统ELISA具有以下优点：1.更高的灵敏度：第四代ELISA采用了增强的信号放大技术，能够检测到低至几个皮克图的目标分子浓度，大大提高了检测的灵敏度。
2.更高的特异性：第四代ELISA利用多个特异性抗体结合目标分子，减少了假阳性的可能性，提高了检测的特异性。
3.更快的反应速度：第四代ELISA使用了更快速的样本处理方法和酶反应系统，可以在较短的时间内完成检测，提高了实验效率。
4.更广泛的应用范围：第四代ELISA可以用于检测多种生物分子，包括蛋白质、抗体、核酸等，适用于不同领域的研究和临床诊断。
三、应用第四代酶联免疫法在医学、生物学和生物化学等领域广泛应用，具有重要的研究和临床价值。
1.病毒检测：第四代ELISA被广泛应用于病毒感染的检测和诊断，如HIV、乙肝、丙肝等。
它的高灵敏度和特异性可以有效地筛查病毒感染者，及时进行治疗和预防传播。
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酶联免疫标记技术
酶联免疫标记技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用于检测生物样本中特定蛋白质、抗体、荷尔蒙、抗原等的定量和定性方法。
该技术利用酶与抗原-抗体复合物相互作用的原理，通过酶的催化作用将底物转化为可检测的产物，从而实现对目标分子的检测和测量。
ELISA技术通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等不同类型，但它们的基本原理相似。
以下是酶联免疫标记技术的基本步骤：
1．包被阶段（Coating）：将要检测的抗原或抗体吸附在固体表面上，如微孔板的底部或壁上。
2．阻断阶段（Blocking）：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白、鱼胶等）阻断未被包被的表面，以减少非特异性结合。
3．结合阶段（Binding）：将待测样本加入到包被的微孔板中，目标分子与包被的抗体或抗原发生特异性结合。
4．洗涤阶段（Washing）：使用缓冲液洗去未结合的样本成分，以减少背景干扰。
5．检测阶段（Detection）：加入与目标分子特异性结合的检测抗体，形成抗原-抗体复合物。
6．洗涤阶段（Washing）：再次使用缓冲液洗去未结合的检测抗体。
7．酶标记阶段（Enzyme Labeling）：加入与检测抗体特异性结合
的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
8．底物加入阶段（Substrate Addition）：加入底物，酶催化底物产生可检测的产物。
9．测量阶段（Measurement）：使用光度计或荧光测量仪器测量产物的光学密度或荧光强度，从而定量目标分子的浓度。
ELISA技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本较低等优点，因此在医学诊断、生物医学研究、药物开发等领域被广泛应用。