基因克隆的质粒载体优秀课件
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➢ 在基因导入受体时：将目的 片段转移到受体细胞中并进 行使之表达——转化载体或 表达载体。
✓ 细菌质粒(克隆)； ✓ λ噬菌体(克隆)； ✓ 柯斯质粒(克隆)； ✓ 穿梭质粒(克隆/表达)； ✓ 细菌人工染色体(克隆/表达)；
✓ 酵母人工染色体(克隆/表达)；
✓ Ti质粒及其衍生载体(转化)。
表达体
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
大肠杆菌的质粒
在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已 经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主 染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细 胞中去。
2．如果两条多核苷酸链中只有一条 保持着完整的环形结构，另一条链出 现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA（ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
（5）质粒空间构型与电泳速率
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽 管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最 前沿的是SC DNA，其后依次ຫໍສະໝຸດ BaiduL DNA和OC DNA
色体的基因或DNA区段。 ✓ 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，携带着细菌的染
色体基因或DNA区段。 ✓ 以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上。
F质粒结构：
tra区（转移区，与质 粒转移和性菌毛合成 有关）
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
自主复制基因，转移基因，大 肠杆菌素基因
自主复制基因，转移基因，抗 菌素抗性基因
自主复制基因，转移基因，大 肠杆菌素基因
R质粒(R因子)
F质粒（ F因 子） Col质粒
R质粒(R因子)
Ent质粒
（1.1） 接合型质粒 又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
λ噬菌体
E.coli
丝状噬菌体及噬菌粒
E.coli
粘粒载体
E.coli
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小：
1—200 kb
（2）编码基因少：
2—3个中等大小的蛋白质。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌 一些额外的特性（非必须）。
（3）环形状：
双链环状DNA。 （酵母的“杀伤质粒”是RNA）。
（4）质粒的空间构型：
1．当其两条多核苷酸链均保持着完 整的环形结构时，称之为共价闭合环 形DNA（cccDNA），这样的DNA 通常呈现超螺旋的SC构型；
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
载体
第一代 原核生物 质粒、噬菌体 表达体系
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
宿主 细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
基因克隆的质粒载体
载体通论
（一）基本概念 载体：在基因工程中，用于承载、克隆、转移目的基
因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。
（二）分类 克隆载体 表达载体
按载体功能分
质粒载体 噬菌体载体 人工染色体
按载体性质分
常用基因工程载体有：
➢ 在基因克隆时：将目的片段 转移到宿主细胞中进行复制 克隆——克隆载体；
如：F质粒（性质粒、或F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
（2）F质粒(F plasmid)
又称F因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别 并有转移能力的质粒。分子量约为大小94kb，共编码19个转 移基因。
F质粒在寄主细胞中有三种存在形式： ✓ 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带来自寄主染
②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基 因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细 胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆 菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘 关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
✓ 细菌质粒(克隆)； ✓ λ噬菌体(克隆)； ✓ 柯斯质粒(克隆)； ✓ 穿梭质粒(克隆/表达)； ✓ 细菌人工染色体(克隆/表达)；
✓ 酵母人工染色体(克隆/表达)；
✓ Ti质粒及其衍生载体(转化)。
表达体
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
大肠杆菌的质粒
在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已 经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主 染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细 胞中去。
2．如果两条多核苷酸链中只有一条 保持着完整的环形结构，另一条链出 现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA（ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
（5）质粒空间构型与电泳速率
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽 管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最 前沿的是SC DNA，其后依次ຫໍສະໝຸດ BaiduL DNA和OC DNA
色体的基因或DNA区段。 ✓ 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，携带着细菌的染
色体基因或DNA区段。 ✓ 以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上。
F质粒结构：
tra区（转移区，与质 粒转移和性菌毛合成 有关）
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
自主复制基因，转移基因，大 肠杆菌素基因
自主复制基因，转移基因，抗 菌素抗性基因
自主复制基因，转移基因，大 肠杆菌素基因
R质粒(R因子)
F质粒（ F因 子） Col质粒
R质粒(R因子)
Ent质粒
（1.1） 接合型质粒 又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
λ噬菌体
E.coli
丝状噬菌体及噬菌粒
E.coli
粘粒载体
E.coli
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小：
1—200 kb
（2）编码基因少：
2—3个中等大小的蛋白质。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌 一些额外的特性（非必须）。
（3）环形状：
双链环状DNA。 （酵母的“杀伤质粒”是RNA）。
（4）质粒的空间构型：
1．当其两条多核苷酸链均保持着完 整的环形结构时，称之为共价闭合环 形DNA（cccDNA），这样的DNA 通常呈现超螺旋的SC构型；
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
载体
第一代 原核生物 质粒、噬菌体 表达体系
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
宿主 细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
基因克隆的质粒载体
载体通论
（一）基本概念 载体：在基因工程中，用于承载、克隆、转移目的基
因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。
（二）分类 克隆载体 表达载体
按载体功能分
质粒载体 噬菌体载体 人工染色体
按载体性质分
常用基因工程载体有：
➢ 在基因克隆时：将目的片段 转移到宿主细胞中进行复制 克隆——克隆载体；
如：F质粒（性质粒、或F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
（2）F质粒(F plasmid)
又称F因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别 并有转移能力的质粒。分子量约为大小94kb，共编码19个转 移基因。
F质粒在寄主细胞中有三种存在形式： ✓ 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带来自寄主染
②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基 因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细 胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆 菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘 关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。