基因克隆的质粒载体优秀课件
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《基因克隆载体》PPT课件
显性质粒
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的 抗性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒
隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 质粒克隆载体构建的基本策略
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切
pBR322质粒
YEp24 （图3-11）
特征 （1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变
优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制
3．2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒基本结构：
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后
一、λ噬菌体克隆载体
（一） λ噬菌体性质
λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)
λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
（三）构建的基本策略与技术路线
策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位 点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的 抗性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒
隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 质粒克隆载体构建的基本策略
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切
pBR322质粒
YEp24 （图3-11）
特征 （1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变
优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制
3．2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒基本结构：
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后
一、λ噬菌体克隆载体
（一） λ噬菌体性质
λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)
λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
（三）构建的基本策略与技术路线
策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位 点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]
![基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/d56699a9ddccda38366baf0a.png)
融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图
表达融合体蛋白质策略的优点：
（1）克隆的外源基因能有效 转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位 输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。
非融合蛋白表达载体：
二、噬菌体克隆载体
λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环 状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。 形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期， 是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操 作。
不含对受体有害基因不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节克隆载体的一般特征一细菌质粒载体第二节原核生物基因克隆载体细菌质粒载体是以细菌质粒dna分子为基础构建的克隆载体主克隆载体
• DNA重组（限制性内切酶） • 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
pBR322
（6524bp)
λDNA：cos序列和控制包装序列
pBR322
质粒的复制子 抗药性基因 多克隆位点区
克隆能力：31—45kb
（二） Cosmid载体的应用程序
应用柯斯质粒载体，在大肠 杆菌细胞中克隆大片段的真 核基因组DNA技术，叫做柯 斯克隆（cosmid cloning）。
表达融合体蛋白质策略的优点：
（1）克隆的外源基因能有效 转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位 输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。
非融合蛋白表达载体：
二、噬菌体克隆载体
λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环 状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。 形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期， 是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操 作。
不含对受体有害基因不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节克隆载体的一般特征一细菌质粒载体第二节原核生物基因克隆载体细菌质粒载体是以细菌质粒dna分子为基础构建的克隆载体主克隆载体
• DNA重组（限制性内切酶） • 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
pBR322
（6524bp)
λDNA：cos序列和控制包装序列
pBR322
质粒的复制子 抗药性基因 多克隆位点区
克隆能力：31—45kb
（二） Cosmid载体的应用程序
应用柯斯质粒载体，在大肠 杆菌细胞中克隆大片段的真 核基因组DNA技术，叫做柯 斯克隆（cosmid cloning）。
基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
第三章植物基因克隆的载体-课件
三、质粒的基本特性
（5）自主复制性
携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
（6）不相容性
同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相 容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
（7）可扩增性
质粒就其复制方式而言分为两类
松弛型复制 严谨型复制
（8）可转移性
• 质粒克隆载体引入与lacZ’互补的E. coli，在含 IPTG和X-gal的诱导培养基中，菌落呈蓝色。
• 如果在MCS区插入一个外源片断，就会使lacZ’基
因失活，引入 lacZ’互补的E. colБайду номын сангаас，肽不能生成，
就无所谓互补，在含IPTG和X-gal的诱导培养基 中X-gal不会被降解，菌落呈白色。
分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆 位点，Tetr 作为筛选标志。
分子量大，拷贝数低
（2） ColE1质粒——筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。
• colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成 “噬菌斑”。
• 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内 部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易 自发突变出抗colicin E1的细胞…….
命名举例
• pBR322是最早构建的质粒之一 • “p”表明它是一个质粒 • “BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：
Bolivar和Rodriguez • “322”区别于该实验室构建的其他质粒，如
pBR325、pBR327等
三、质粒的基本特性
（1）质粒分子较小
一般为1-200Kb，最大的可达1400kb(如苜 蓿根瘤菌质粒pRm141a)。
《基因克隆的载体》课件
噬菌体
适用于大批量表达分泌蛋白的研究，转化后可产生 高水平的基因表达。
Cosmid
BAC
可容纳大型外源DNA片段，适用于聚合酶连锁反应、 基因组构建和定位大片段DNA序列等研究。
适合于构建大型基因组和物种基因组序列的物 理/遗传图谱。
基因克隆的步骤
1
下载或制备载体
获取可自主复制的载体，或通过人工合成的方法制备载体。
特点
常见的基因克隆载体质粒具 有如下特点： 1. 大小适中； 2. 构建简单方便； 3. 易于操作且可大量扩增； 4. 可以自主复制； 5. 便于基因操纵和定向表达 等。
类型
常见的载体类型包括质粒、 噬菌体、Cosmid和BAC等。
常见的基因克隆载体
质粒
最常见的基因克隆载体，易于操作且可大量扩增。
基因克隆的载体
克隆技术是现代生命科学研究的重要手段之一。基因克隆技术作为克隆技术 的重要组成部分，因其应用领域的广泛性及重要性而备受关注。本课程将为 您详细介绍基因克隆的载体知识。
载体的定义和特点
定义
基因克隆载体是指具有自主 复制能力的DNA分子，具有 携带外源DNA片段进入细胞 和定向操纵目的基因表达等 功能。
基因克隆的验证
1 检测重组载体
常用方法包括PCR，南方杂交等。通过检测 目的基因的插入，判断载体是否重组成功。
2 验证目的基因的插入
常用方法包括Sequencing和Southern blotting等，验证目的基因是否插入到载体中。
总结和展望
总结
基因克隆载体是基因克隆技术的重要组成部分， 应用领域广泛。核心在于选取合适的载体、构 建载体、将基因植入载体并最终将载体转化到 受体细胞中。
2
第六章基因克隆的载体与受体PPT课件
抗菌素选择原理
含有抗菌素的培养基（选择培养基）中能够生 长抗菌素抗性基因的受体菌
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后， 受体菌才能生长。
抗性基因
死
抗菌素
活
• 另：pUC18质粒具有以下特点：
①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择标记
（1）选择标记
① 抗菌素抗性
绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：
氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）
② 遗传标记
使受体菌发生遗传性状的改变的基因。
经典的大肠杆菌质粒载体
1. pSC101
第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。
第六章 基因克隆的载体与受体
质粒载体 噬菌体载体 大分子DNA克隆载体 用于基因转移的受体菌或细胞
载体
• 载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。 DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现 在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。
• 载体的条件： ①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复
（4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳 迁移率不同：
基因克隆载体PPT幻灯片
二、基因克隆载体
（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在 复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使 两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周 期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞 内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。
2）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell
（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在 复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使 两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周 期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞 内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。
2）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell
基因工程-2-载体ppt课件
③易操作,id)
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
目的基因的克隆PPT课件(模板)
A ＝ 1 : ( 1~3 )
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
分钟，9000g×1分钟。备用。
载体和目标基因的连接反应
重组 DNA 技术的一般流程
重组子的筛选 （2）受体菌的选择与改造
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.
次选匹配粘端，载体脱磷
5ml离心管中，在吸附膜中央加入30 lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。
耐药性基因 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。
荧光质粒转染观察
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
分钟，9000g×1分钟。备用。
载体和目标基因的连接反应
重组 DNA 技术的一般流程
重组子的筛选 （2）受体菌的选择与改造
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.
次选匹配粘端，载体脱磷
5ml离心管中，在吸附膜中央加入30 lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。
耐药性基因 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。
荧光质粒转染观察
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
基因克隆载体 (3)PPT课件
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（二）构建依据
1、λ噬菌体是一种温和噬菌体
2、能承载较大的外源DNA片段 野生型λDNA头部可包装约36.4～ 51kb(自身的75%～105%)，且约有 20kb λDNA可缺失（生长非必需）
3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
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（三）构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统
成具有两个cos位点而且相距达36.4～51kb之间时， 才能被包装。
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利用Cos质粒进行克隆
（四）使用cosmid载体的基本程序
利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的λ噬菌体性质→转导受体细胞（下图）
区插入ＭＣＳ连杆
构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+” 链一起复制包装。
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HindⅡ
B H H
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（四）M13克隆载体的优点与应用
优点：
1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作 2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细
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2、λ噬菌体 基因组有 基因61个 以上
J与N、P 与Q之间 为非必需 序列
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迄今已经定位的λ噬菌体基因至少有61个， 其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的 调控（必需基因）；
另一部分基因则被称为非必需基因；当它 们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生 命周期。
（二）构建依据
1、λ噬菌体是一种温和噬菌体
2、能承载较大的外源DNA片段 野生型λDNA头部可包装约36.4～ 51kb(自身的75%～105%)，且约有 20kb λDNA可缺失（生长非必需）
3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
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（三）构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统
成具有两个cos位点而且相距达36.4～51kb之间时， 才能被包装。
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利用Cos质粒进行克隆
（四）使用cosmid载体的基本程序
利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的λ噬菌体性质→转导受体细胞（下图）
区插入ＭＣＳ连杆
构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+” 链一起复制包装。
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HindⅡ
B H H
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（四）M13克隆载体的优点与应用
优点：
1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作 2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细
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2、λ噬菌体 基因组有 基因61个 以上
J与N、P 与Q之间 为非必需 序列
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迄今已经定位的λ噬菌体基因至少有61个， 其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的 调控（必需基因）；
另一部分基因则被称为非必需基因；当它 们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生 命周期。
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E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小：
1—200 kb
（2）编码基因少：
2—3个中等大小的蛋白质。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌 一些额外的特性（非必须）。
（3）环形状：
双链环状DNA。 （酵母的“杀伤质粒”是RNA）。
（4）质粒的空间构型：
1．当其两条多核苷酸链均保持着完 整的环形结构时，称之为共价闭合环 形DNA（cccDNA），这样的DNA 通常呈现超螺旋的SC构型；
②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基 因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细 胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆 菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘 关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
色体的基因或DNA区段。 ✓ 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，携带着细菌的染
色体基因或DNA区段。 ✓ 以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上。
F质粒结构：
tra区（转移区，与质 粒转移和性菌毛合成 有关）
➢ 在基因导入受体时：将目的 片段转移到受体细胞中并进 行使之表达——转化载体或 表达载体。
✓ 细菌质粒(克隆)； ✓ λ噬菌体(克隆)； ✓ 柯斯质粒(克隆)； ✓ 穿梭质粒(克隆/表达)； ✓ 细菌人工染色体(克隆/表达)；
✓ 酵母人工染色体(克隆/表达)；
✓ Ti质粒及其衍生载体(转化)。
表达体
自主复制基因，转移基因，大 肠杆菌素基因
自主复制基因，转移基因，抗 菌素抗性基因
自主复制基因，转移基因，大 肠杆菌素基因
R质粒(R因子)
F质粒（ F因 子） Col质粒
R质粒(R因子)
Ent质粒
（1.1） 接合型质粒 又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
2．如果两条多核苷酸链中只有一条 保持着完整的环形结构，另一条链出 现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA（ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
（5）质粒空间构型与电泳速率
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽 管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最 前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA
载体
第一代 原核生物 质粒、噬菌体 达体系
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
宿主 细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
λ噬菌体
E.coli
丝状噬菌体及噬菌粒
E.coli
粘粒载体
E.coli
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
基因克隆的质粒载体
载体通论
（一）基本概念 载体：在基因工程中，用于承载、克隆、转移目的基
因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。
（二）分类 克隆载体 表达载体
按载体功能分
质粒载体 噬菌体载体 人工染色体
按载体性质分
常用基因工程载体有：
➢ 在基因克隆时：将目的片段 转移到宿主细胞中进行复制 克隆——克隆载体；
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
大肠杆菌的质粒
在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已 经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主 染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细 胞中去。
如：F质粒（性质粒、或F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
（2）F质粒(F plasmid)
又称F因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别 并有转移能力的质粒。分子量约为大小94kb，共编码19个转 移基因。
F质粒在寄主细胞中有三种存在形式： ✓ 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带来自寄主染