琥珀酸脱氢酶竞争性抑制
实验三：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学
3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。
反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。
丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。
丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。
抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。
2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。
3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。
4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。
5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。
（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。
（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。
再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。
(自改)酶的竞争性抑制作用
本实验中5号、6号试管的作用是什度。
注意随时观察各管褪色情况。 37℃水浴保温过程中，不能振摇试管，避免 甲烯白重新氧化变蓝。
实验结束后，一定要洗净试管内的液体石蜡。
生物化学与分子生物学实验 CQMU
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制作用
P、97
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
目的： P、97
原理：1、概念：丙二酸（I）与琥珀酸（S）结构相似，竞争结合 琥珀酸脱氢酶活性中心，抑制酶活性。 2、竞争性抑制特点： P、98 ① Vm不变，Km ↑ ；
② E 的抑制程度
3. 结果及分析
试管编号 1 2 3 4 5 6
各管均在最后加入琥珀酸。并且立即混匀， 沿管壁加入石蜡油约0.5 cm厚，37 ℃水浴保温 （不摇动）。随时观察记录褪色所需时间
计算各管[I]/[S]
完全褪色 所需时间
P.99 酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？
各管的褪色情况有何区别？为什么？ 丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用的类型及其特点是什么？
∝ [I]/[S]
；
③ [S]足够大，抑制解除。 3、观察： 操作：1、酶提取液的制备 2、取试管6支，按表所列步骤操作。 3、实验结果及分析 注意事项 ：
一、实验目的
学习和掌握酶竞争性抑制的概念和特点 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑 制作用
二、实验原理
酶的竞争性抑制作用
抑制剂和底物的结构相似，可 与底物竞争酶的活性中心，阻碍 酶-底物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
● Km和Vmax的求法 底物浓度曲线是双曲线。
实验三丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
+
I
EI [S]>>[I]：高浓度的底物可解除抑制
竞争性抑制作用特点 1、I结构常与S结构类似 2、I/S与酶的结合部位相同:酶的活性中心 3、[S]↑可以降低甚至消除抑制作用 4、(表观）Km值增大，Vm值不变
1/ 珀酸竞争琥珀酸脱氢酶
COOH CH2 CH2
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
FAD
COOH CH2 COOH
丙二酸
延胡索酸
COOH
FADH2
无 氧
甲烯蓝（MB） 甲烯白（MBH2） +FAD
三、实验材料、主要仪器和试剂 （Equipments , Materials and Agents）
• • • • • • • • • （一）主要仪器：离心机、恒温水箱。 （二）主要试剂： 1．0.2mol/L 琥珀酸 2．0.02mol/L 琥珀酸 3．0.2mol/L 丙二酸 4．0.02mol/L 丙二酸 上述四中溶液调节pH值为7.4。 5．0.02%甲烯蓝 6．1/15mol/L的Na2 HPO4
四、操作步骤（Operating Procedure）
1 酶的提取液的制备：将兔子处死，取出肝 脏，切成碎片后，放入乳钵中，每组取8g 左右，加入1/15mol/L的Na2 HPO4溶液 5ml研成糊状后，再加入5ml1/15mol/L的 Na2 HPO4溶液，混匀后，倒入离心管中， 2000转/分钟离心4分钟，取上清液转入其 它试管备用。
六、思考题：(Questions)
什么叫酶的竞争性抑制作用？举例说明在医 学上的应用。
七.注意事项：(Notices) 1．注意密切观察颜色变化。 2．加入各种试剂要注意看清标签， 不能混用各试剂瓶瓶盖。
琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察
1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。
需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。
如果人数多可以适当多分几瓶试剂。
所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。
等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。
琥珀酸
先在试管中加入琥珀酸钠、丙二酸钠、水、甲烯蓝、磷酸缓冲液等试剂，放在37℃恒温水浴中保温10min，再加入肌肉浆，混匀后立即在各管中加入0.5~1mL 液体石蜡，覆盖于液面上使试样与空气隔绝。在37℃恒温水浴中继续保温。从加入液体石蜡开始记录甲烯蓝变白所需时间。
注意事项
①第3管加入的肌肉浆预先用100 ℃恒温水浴中保温5min，以杀死酶活性作为对照管。
②观察变色时不要振动试管以免氧气调入管内影响变色。
三、仪器、原料和试剂
仪器
试管、恒温水浴锅、研钵。
原料
肌肉
试剂
1. 1/15mol/L—pH 7.0磷酸缓冲液
2. 0.1mol/L 琥珀酸钠
3. 0.01％甲烯蓝溶液
4. 0.04mol/L 丙二酸钠溶液
5. 石英砂
6. 液体石腊
四、操作方法
1.琥珀酸脱氢酶
(1)取肌肉2g，加磷酸缓冲液5mL 在研钵中研成肌肉浆。
(2)取试管2支，各加肌肉浆2mL，其中一管置100℃恒温水浴锅中保温5min，灭酶作为对照管。
两管各加0．01％甲烯蓝溶液2滴，各加0．1mol/L 琥珀酸钠溶液lmL，摇匀。
(3)各加液体石腊封口。
(4)在40℃恒温水浴中保温10min。
2.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用
取3支试管编号(若定量，用比色法)，按下表加入各种试剂。
丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制刑。细菌量越多或脱氢酶活性越高甲烯蓝脱色所需时间越短。因此，甲烯蓝脱色所需时间的倒数可用来表示酶的活性或细菌生长的情况。
根据上述原理，可用甲烯蓝脱色法来测定脱氢酶或细菌含量。例如，在评定牛奶的等级时，可用此法测定牛奶中的杂菌含量，脱色越快，含菌量越高，牛奶质量越差。由于甲烯蓝容易被空气中的氧所氧化，所以实验需在无氧情况下进行。常用Thnbe ro(邓氏)管抽去空气进行反应，也可简化为，用液体石腊(或冻结琼脂)封闭反应液，制造无氧环境，这样可不用抽真空设备。
实验四 酶的竞争性抑制作用
实验四酶的竞争性抑制作用一、目的要求：通过实验加深对酶的竞争性抑制作用的了解二、实验原理：与底物化学结构类似的抑制剂，能与底物竞争和酶活性中心的结合、抑制酶的活性，这种类型的抑制为竞争性抑制。
竞争性抑制的程度由抑制剂与底物相对浓度决定。
如果底物浓度不变，酶活性被抑制的程度随抑制剂的浓度增加而增强。
反之，如果抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度的增加而逐渐恢复。
本实验观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的影响。
琥珀酸脱氢酶的活性，在隔绝空气的条件下，可从加入的甲烯蓝褪色情况来观察。
COOH COOH︳︳CH2 琥珀脱氢酶CH︳+ 甲烯蓝——————→‖+ 甲烯白CH2 CH︳︳COOH COOH三、实验材料1、试剂：（1）0.2 mol/L 琥珀酸：称取琥珀酸23.618g，用蒸馏水配成约600ml ,用5mol/L NaOH 调pH至7.4，再加水至1000ml（2）0.02mol/L琥珀酸：用0.2 mol/L 琥珀酸稀释10倍（3）0.2 mol/L 丙二酸：称取丙二酸22.92g ，用蒸馏水配成约600ml ，5mol/L NaOH调pH 至7.4，再加水至1 000ml（4）0.02mol/L丙二酸：用0.2 mol/L丙二酸稀释10倍（5）0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）：取0.2 mol/L Na2HPO4 19ml ，加蒸馏水至200ml (6) 0.02%甲烯蓝（7）液体石蜡2、器材（1）小试管及试管架（2）吸量管（10ml *1）及滴管（8支）（3）研钵四、实验方法1、心肌匀浆的制备：取动物（鼠、猪等）心肌1g，置研钵中，剪碎，研磨成匀浆，再加入0.1mol/L 磷酸盐缓冲液10ml ，磨匀，备用2、取小试管5支并编号，按下表操作：加入液体石蜡后，室温放置。
观察各管甲烯蓝褪色情况。
五、结果处理记录各管甲烯蓝褪色情况，并解释结果。
六、注意事项1. 心肌要用新鲜的2.注意各种试剂加入的顺序，混匀各管已加入的试剂后马上加入液体石蜡3.及时、仔细观察颜色变化4．观察结果过程中，不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使甲烯白重新被氧化变蓝七、思考题在此实验基础上，如何设计实验来观察“增加底物浓度，酶的竞争性抑制作用可以降低或消除”的现象？。
实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【实验名称】：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用09救援一班第三大组李岚宇2009222336室温：25℃（一）实验目的：1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。
2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
（二）实验原理：化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。
琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（三）实验材料与仪器：1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。
（四）实验步骤:1、酶提取液的制备：去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，用冷水洗3次，加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。
在匀浆器中进行匀浆，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤的备用。
2、取试管6支，编号，在按图步骤操作，酶提取液（ml）磷酸缓冲液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸馏水（滴）甲烯蓝（滴）褪色时间（分钟）试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制报告
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
一、实验原理
在化学结构上与底物类似的抑制剂，能与底物竞争酶分子的活性中心，从而抑制酶的活性。
抑制程度随抑制剂浓度的改变而改变。
如果底物浓度不变，酶活性的抑制程度随抑制剂浓度的增加而增加。
反之，如抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度增加而逐渐回复，这种类型的抑制称竞争性抑制。
琥珀酸脱氢酶是一种含铁的黄酶，它可以催化琥珀酸脱氢酶，生成延胡索酸，在有氧的情况下，脱下的氢经呼吸链的传递，与氧化合成水。
肝中含有丰富的琥珀酸脱氢酶，体外实验在隔绝空气的情况下，琥珀酸脱下的氢可被人工受氢体一甲烯蓝接受还原成甲烯白。
因此我们可以用甲烯蓝被还原褪色的速度和程度，来了解不同底物浓度，不同抑制剂浓度时酶活性的改变。
二、实验步骤与结果
2.将上述各试管摇匀，于夜面上加液体石蜡10滴，放37℃水浴中保温，随时比较，观察
各试管颜色变化。
3.结果
经观察，各个试管的褪色时间顺序为：1>4>2>3
三、结论
底物浓度、抑制剂浓度影响了酶的竞争性。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制目的与要求：了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用实验原理：肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变为延胡索酸（三羧酸循环，线粒体）。
反应中生成的FADH2可使甲烯蓝还原为甲烯白。
丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，与琥珀酸的分子结构相似，与酶的亲合力高。
丙二酸与酶结合后，酶活性受到抑制，则不能催化琥珀酸的脱氢反应。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
操作步骤：酶提取液的制备酶促反应管的制备37℃酶促反应，观察甲烯蓝褪色程度实验结果：间隔10分钟，记录各管甲烯蓝褪色程度，解释结果。
注意事项：充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清洗。
滴加液体石蜡时，倾斜试管，避免产生气泡。
观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝。
改良Mohum法测定谷-丙转氨酶活性目的与要求：了解Mohum法测定谷-丙转氨酶活性的原理及测定方法实验原理：利用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，再利用2 4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成棕色的丙酮酸二硝基苯肼，在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。
血清谷-丙转氨酶活性单位定义：每毫升血清在pH值7.4，37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug 的丙酮酸为1谷-丙转氨酶单位，正常值为2-40单位/ml。
实验步骤：见书Page 77酶活性测定表格。
实验结果：谷丙转氨酶活性单位A测定管/A标准管标准管中丙酮酸含量10/2.5。
注意事项：保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥催化作用环境。
酶活性单位。
微量移液器的使用。
..。
实验八 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验八 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【目的】验证丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
【原理】琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下脱氢生成延胡索酸，脱下的氢被受氢体接受。
本实验用亚甲蓝（MB ）作为受氢体，亚甲蓝接受琥珀酸脱下的氢由蓝色还原成无色的甲烯白（MBH 2）。
丙二酸与琥珀酸分子结构相似，能竞争性抑制琥珀酸脱氢酶。
通过观察亚甲蓝颜色消退的程度，可以判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制程度。
COOHCH CH +MBCOOH CH 2CH 2+MBH 2琥珀酸亚甲蓝（蓝色）延胡索酸还原性亚甲蓝（无色）琥珀酸脱氢酶【器材】试管及试管架、滴管、剪刀、研钵或20ml 匀浆器、电热恒温水浴箱。
【试剂】1. 0.1mol/L 磷酸缓冲液（PH7.4）取0.1mol/L Na 2HPO 4溶液19ml 和0.1mol/L NaH 2PO 4溶液81ml 混合即可。
2. 1.5% 琥珀酸钠溶液 3. 1% 丙二酸钠溶液 4. 0.02% 亚甲蓝溶液 5.液状石蜡 【操作】1. 取新鲜动物肌肉或肝5g 左右，放入研钵，用剪刀将组织剪碎，然后加入10ml 在冰箱中保存的PH7.4的磷酸缓冲液充分研磨均匀（或在匀浆器内进行匀浆，制备成20%匀浆液）。
2. 取4支试管，编号，按下表操作：表3-11 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用加入物（滴） 1 2 3 4 匀浆10 10 －101.5%琥珀酸钠溶10 10 10 20液1%丙二酸钠溶液－10 10 10 蒸馏水20 10 20 －0.02%亚甲蓝溶液10 10 10 103. 各管混匀后，各加少量液状石蜡覆盖在液体上，置37℃水浴中保温，随时观察各管颜色变化，并记录各管亚甲蓝褪色时间。
【结果及分析】比较各管亚甲蓝褪色情况，并对实验结果进行分析。
【思考题】1. 什么是竞争性抑制作用，与非竞争性抑制作用有何不同。
2. 为什么要用石蜡油隔绝空气来进行实验？。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种酶,参与生物体内的三羧酸循环。
SDH的主要功能是将琥珀酸氧化为富能的丙酮酸和二氧化碳,为细胞提供能量。
SDH的活性受到一些物质的影响,例如甲肝灵等药物就可以抑制SDH的活性。
竞争性抑制实验是在SDH的底物琥珀酸中加入不同浓度的抑制剂,观察SDH的活性变化。
实验的结果可能呈现出以下几个情况：抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,活性呈线性的降低；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但达到饱和点后,SDH的活性降低幅度逐渐增加；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但在饱和点后活性降低趋于不变。
实验者可以通过这些结果,得到抑制剂的半数抑制浓度（IC50）,进而评价抑制剂的效果。
在实验中,我们观察到抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,且具有饱和点。
这说明抑制剂与SDH结合的速度是有限的。
从实验结果中可以看出,IC50值比较低,这表明抑制剂的效果比较好。
实验结果为我们提供了有关SDH的一些基本信息,也有助于我们更好地理解如何控制相关疾病,比如心肌缺血。
在这个实验中,我深刻认识到了科学研究的重要性,同时也学会了如何进行实验和如何分析实验结果。
这些经验对于我的学习和未来的研究都有一定的启示作用。
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
4.MTT法
实验操作：
(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠 将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充
分研磨至糊状 分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml 搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟 将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢
酶的肝糜液
实验操作：
另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
3.TTC（氯化三苯四氮唑）法
无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为 人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原 成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶体的形式存 在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋 、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液 测定485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶 活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出 TTC-脱氢酶活性
琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受 体的，另一种是作用于所有受体。
琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种 1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法 2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法
1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二 甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化 琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光 度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋ PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋ DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这 种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化 与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出 SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧 化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算 SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准 =μmol/min/mg。
琥珀酸脱氢酶实验报告
一、实验目的1. 理解琥珀酸脱氢酶在细胞代谢中的作用。
2. 掌握琥珀酸脱氢酶的活性测定方法。
3. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
二、实验原理琥珀酸脱氢酶（SDH）是三羧酸循环（TCA循环）中的一个关键酶，其主要功能是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，同时将脱下的氢传递给电子传递链。
本实验采用比色法测定琥珀酸脱氢酶的活性，通过观察甲烯蓝的脱色时间来反映酶的活性。
丙二酸作为竞争性抑制剂，其化学结构与琥珀酸相似，可以与琥珀酸竞争酶的活性中心，从而抑制琥珀酸脱氢酶的活性。
三、实验材料与仪器实验材料：1. 大肠杆菌2. 琥珀酸钠3. 甲烯蓝4. 磷酸缓冲液5. 丙二酸溶液6. 液体石蜡实验仪器：1. 试管2. 吸量管3. 电热水浴锅4. 恒温水浴箱5. 移液器四、实验步骤1. 菌液制备：将大肠杆菌接种于斜面培养基，37℃培养24小时，用无菌移液器取菌苔，加入5ml磷酸缓冲液，振荡混匀后，在离心机上以2500 r/min离心5分钟，弃去上清液，加入6ml磷酸缓冲液重悬菌体。
2. 酶活性测定：a. 取试管3支，分别编号为A、B、C。
b. 向A管中加入1ml菌液，B管中加入1ml菌液和1ml丙二酸溶液，C管中加入1ml菌液和1ml磷酸缓冲液。
c. 向各管中加入0.5ml琥珀酸钠和1ml甲烯蓝溶液。
d. 将试管放入恒温水浴箱中，在37℃下保温5分钟。
e. 将各管取出，立即在离心机上以5000 r/min离心5分钟，取上清液。
f. 用分光光度计在波长620nm处测定各管的吸光度值。
3. 计算酶活性：a. 计算A管和C管的平均吸光度值。
b. 计算A管和C管的吸光度比值。
c. 根据标准曲线计算琥珀酸脱氢酶的活性。
五、实验结果与分析1. 通过实验，成功制备了大肠杆菌菌液，并测定了琥珀酸脱氢酶的活性。
2. 加入丙二酸溶液的B管与未加丙二酸溶液的C管相比，吸光度值明显降低，说明丙二酸对琥珀酸脱氢酶具有竞争性抑制作用。
3. 通过计算，得出琥珀酸脱氢酶的活性为X单位。
实验三-丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验三-丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用引言：琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种重要的蛋白质，其在三羧酸循环中起着关键的作用。
SDH 能够催化琥珀酸脱氢反应，将琥珀酸氧化为富含能量的丙酮酸。
在人体中，SDH的异常通常会导致疾病的发生，如甲状腺疾病、糖尿病、肝脏疾病等。
因此，SDH的调节和控制是非常重要的。
在本实验中，我们将研究丙二酸对SDH的竞争性抑制作用，以期了解其在细胞代谢中的作用。
实验目的：2、了解SDH在细胞代谢中的作用。
实验原理：SDH是一种酸性蛋白质，其催化反应式为：琥珀酸+辅酶Q+OH-→丙酮酸+辅酶QH2。
SDH活性的测定一般采用酶联免疫吸附法（ELISA）。
在实验前，需要将SDH标准品稀释至一定浓度。
然后，将SDH标准品加入到孔板中，与不同浓度的丙二酸预先混合，测定SDH 的活性。
根据SDH催化反应的特点和丙二酸的特异性竞争性抑制作用，可确定丙二酸的浓度和SDH的活性之间的关系。
实验步骤：1、将SDH标准品稀释至一定浓度，取适量的SDH标准品分别加入到不同的孔板中。
2、根据实验需求，添加不同浓度的丙二酸到不同孔板中，混合均匀。
3、放置孔板至37℃恒温箱内，反应30分钟。
4、加入反应液至各个孔位中，搅拌均匀。
5、测定不同孔板的OD值。
6、据此根据SDH活性的公式，计算SDH活性值。
7、根据SDH活性值和丙二酸的浓度，确定丙二酸浓度与SDH活性之间的关系。
实验结果：见附件1。
讨论：通过实验，我们发现丙二酸对SDH的竞争性抑制作用比较显著。
丙二酸的浓度与SDH 的活性呈明显的负相关关系。
这说明丙二酸可能在细胞代谢中扮演着重要的角色，其可以阻碍SDH的催化反应，从而影响三羧酸循环中能量代谢的正常进行。
本实验结果表明，丙二酸具有竞争性抑制SDH的能力，说明丙二酸在细胞代谢中的作用非常重要。
这为进一步探讨丙二酸在细胞代谢中的作用提供了有价值的参考和思路。
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SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准
=μmol/min/mg。
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2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底
物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与 Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸 光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱 氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活 力愈强。
FAD
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MBH2甲烯白（无色）
HOOC—CH=CH—COOH
FADH2
MB甲烯蓝（蓝色）
在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢 酶活性的改变。
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实验器材与试剂:
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（一）试剂 pH=7.4的磷酸缓冲液 0.25%琥珀酸钠溶液 0.5%草酸钠溶液 0.01%甲烯蓝溶液 生理盐水 液体石蜡
DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这
种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化
与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出
SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧
化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算
1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
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琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二
甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化
琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光
度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋
PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋
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思考题：
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5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺 陷与改进方案？
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补充：
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琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简 称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶， 属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢 纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需 氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标 志酶。
1.00
1.00
1.0
甲烯蓝/ml 0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
摇匀，静置于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记 录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并 分析产生该现象的原因。
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注意事项：
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1>肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢 酶尽量释放到溶液里
草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争 性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。 在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧 结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色） 作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲 烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的 快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色 消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。
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实验器材与试剂：
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（二）器材 研钵.手术剪.手术镊子 2mL移液管 1000 uL微量可调仪器 10mL离心管 低速离心机
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实验操作：
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(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠 将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充
分研磨至糊状 分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml 搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟 将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢
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思考题：
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பைடு நூலகம்
2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本 实验成功的关键是什么？
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思考题：
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3：抑制剂还可以选用什么物质？
还可以选用丙二酸
4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点 ？
竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物 ；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部 位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大； 但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参 数：Km值增大，Vm值不变。
2>离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要 相等的离心管对称放置
3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振 荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊
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思考题： LOGO
1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在 摇动?
避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲 烯白重新氧化成甲烯蓝
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琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
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实验目的：
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(1)学习动物的处死与组织匀浆的方法。 (2)学习离心机的使用方法。 (3) 进一步理解酶的竞争抑制原理。
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实验原理：
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竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞 争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的 抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。
琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受 体的，另一种是作用于所有受体。
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琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种 1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法 2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法
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酶的肝糜液
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实验操作：
另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
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编号
1
2
3
4
5
0.25%琥珀 0.50
——
0.50
2.00
0.50
酸钠溶液
/ml
0.5%草酸 ——
0.50
0.50
0.50
2.00
钠溶液/ml
蒸馏水/ml 2.00
2.00
1.50
——
——
肝糜液/ml 1.00
1.00
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二、实验原理
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酶的竞争性抑制作用
抑制剂和底物的结构相似，可与 底物竞争酶的活性中心，阻碍酶-底 物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
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HOOC—CH2—CH2—COOH
草酸
琥珀酸脱氢酶
HOOC—COOH