第二章 工业生产菌种筛选
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第二章 工业菌种选育(1)
多次传代 摇瓶初筛
诱变育种的 基本程序
挑出高产斜面菌种 保藏菌种 (砂土管、冻干 管或制备固体孢子)
对照组 摇瓶复筛 (复筛次数及摇瓶数以及培养基种类
根据情况决定 )
挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察
放大试验罐，中试考察
大型投产试验
诱变育种基本程序的要点说明
（1） 出发菌株的选择 （2）单孢子悬液或单菌悬液的制备 （3）诱变剂的种类及剂量选择 （4）突变菌株的分离纯化与初筛 （5）优良突变菌株的筛选
菌株选育概述
生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累
解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物大量积累
微生物育种的目的
菌株选育概述
菌株选育目的：
z 防止菌种退化； z 提高生产能力； z 提高产品质量； z 开发新产品
菌株选育概述
方法：
基因突变：自然选育、诱变育种； 基因重组：体内----- 杂交、原生质体融合技术；
• 出发菌株的选择
（1）考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能 力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物 的催化酶系的基因。
（2）出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生 长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
•菌悬液制备
• 一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定 的措施促使细胞处于同步生长。
• 悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会 均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给 后续的筛选工作造成困难。
频率极低
2.3.2.原生质体融合技术
将遗传性状不同的两种菌(包括种间、 种内及属间)融合为一个新细胞的技术。
步骤
选择亲株、原生质体的制备、原生质体 的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤
《工业发酵菌种选育》PPT课件
应用：乳酸、干 酪、奶子酒、发 面、泡菜、酸奶 等的制作
枯草芽孢杆菌
应用：生产淀粉酶、
蛋白酶等
6
2、酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母、毕赤氏酵母
应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡 和制取蛋白质、生产脂肪
7
面包酵母
啤酒酵 母
红酵 8 母
3、霉菌
曲霉属
应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶
第二章 工业发酵菌种来源及选育
第一节 工业发酵生产菌种
一、微生物工业对菌种的要求
微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界
中，其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是野 生型，有的是通过诱变得到的突变体。
发展趋势： 从野生型
变异株
自然选育
代谢控制育种
诱变育种
基因工程定向育种
1
微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：
方法：控制一定的养分（碳源或氮源）；控制一定的培养 条件（温度、pH、底物等）。
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混 杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增 殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制 得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、 稀释分离法、组织分离法。
19
培养条件控制
营养成分控制、控制培养基的pH、添加抑制剂、热处理、 控制培养温度、控制通气量
问题？
1、如何控制营养成分，分离自养型微生物、固氮菌、纤 维素酶菌、几丁质酶菌？ 2、如何控制培养基pH 分离产柠檬酸的黑曲霉？ 3、分离放线菌、细菌、霉菌时，选择哪些抑制剂？ 4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么？厌氧培养 中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么？ 5、如何分离芽孢菌？
枯草芽孢杆菌
应用：生产淀粉酶、
蛋白酶等
6
2、酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母、毕赤氏酵母
应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡 和制取蛋白质、生产脂肪
7
面包酵母
啤酒酵 母
红酵 8 母
3、霉菌
曲霉属
应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶
第二章 工业发酵菌种来源及选育
第一节 工业发酵生产菌种
一、微生物工业对菌种的要求
微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界
中，其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是野 生型，有的是通过诱变得到的突变体。
发展趋势： 从野生型
变异株
自然选育
代谢控制育种
诱变育种
基因工程定向育种
1
微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：
方法：控制一定的养分（碳源或氮源）；控制一定的培养 条件（温度、pH、底物等）。
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混 杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增 殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制 得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、 稀释分离法、组织分离法。
19
培养条件控制
营养成分控制、控制培养基的pH、添加抑制剂、热处理、 控制培养温度、控制通气量
问题？
1、如何控制营养成分，分离自养型微生物、固氮菌、纤 维素酶菌、几丁质酶菌？ 2、如何控制培养基pH 分离产柠檬酸的黑曲霉？ 3、分离放线菌、细菌、霉菌时，选择哪些抑制剂？ 4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么？厌氧培养 中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么？ 5、如何分离芽孢菌？
第二章_生产中常用菌种的分离、选育和保藏
2. 氨基酸生产有关的微生物 20 世纪 50,60 年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个 转折点。 代谢控制发酵是指用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度 地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单。 谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或微杆菌属的棒型细菌。 L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、微杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具 有下述共同特性：①细胞形态为短杆至棒状；②无鞭毛，不运动；③不形成芽孢；④革兰氏 阳性；⑤要求生物素（利用石蜡为碳源的要求硫胺素）;⑥在通气培养条件下产生大量 L－谷 氨酸。此外，其他细菌、放线菌和真菌中的一些属种也有产 L－谷氨酸的菌株，但产酸率较 低。 其它氨基酸生产菌：常规菌种—主要是对上述产 L－谷氨酸的优良菌株进行人工诱变后选 育出的各种突变株；工程菌—大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。 3．食品酶制剂生产有关的微生物 常用的食品酶制剂有： 糖类酶：淀粉液化酶、淀粉糖化酶、葡萄糖水解酶、葡萄糖异构酶等 (淀粉的液化、糖化、 异构化的相关 )。 其它酶：蛋白酶、凝乳酶、脂肪酶、果胶酶等。 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到 FDA 的批 准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 常见酶制剂生产菌： a-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌 蛋白酶：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；黑曲霉、米曲霉、米根酶；
境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。 2.目的微生物的富集
1 2
富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，增加筛选几率。 富集的方案：
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第二章 菌种的筛选、选育和保藏
1、能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物。 2、有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌 种改造的可操作性要强。 3、遗传性能要相对稳定。 4、不易感染它种微生物或噬菌体。 5、产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上 最好与致病菌无关）。 6、生产特性要符合工艺要求。
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
--第二章工业菌种的活化及分离筛选
从自然界分离的菌种
研发部
诱变育种 扩大培养
基因工程 生产用菌种
生产车间
原料
接种
发酵罐
灭菌
发酵条件控制
培养基配置
提取车间
分离 提纯
微生物菌体
代谢产物
原料车间
产品
销售部
一、工业菌种的要求
菌种不是致病菌 能在廉价原料制成的培养基上生长，且高效合成产物
遗传性能要相对稳定，不易变异退化 具有抗噬菌体及杂菌污染能力强
发酵工程及设备 Fermentation Engineering
and Equipment
第一章 工业菌种的来源
第一节 工业菌种的活化及分离筛选
内容速览
1.1生产菌种的 要求
1.2生产菌种的 活化
1.3生产菌种的 分离与筛选
发酵产品
以下产品是发酵产品吗？
工程菌 构建
胰岛素
Figure 1. Idealized biorefinery concept. (Image courtesy of Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA.)
• IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心
• ID 中国医学科学院皮肤病研究所
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
• IV 中国医学科学院病毒研究所
CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
• CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
• GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心
链霉菌属 链霉菌属 诺卡氏菌
花粉
土壤
第二章 工业生产菌种筛选
将 试 管 于 震 荡 机 上 ， 使 菌 液 混 合 均 匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液， 臵入准备好的无菌琼脂内。
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）
二、诱变育种
• 用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再 从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学 实验用。 • 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率 并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10 左右。 • 以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提 高菌种产量、性能的主要手段。
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的 沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化 合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如 一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以 是植物，腐败物品，某些水域等。
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10-15g，盛入清 洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采 样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使 土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。
自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导 致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
第二章 工业发酵菌种选育
镁0.05%、硫酸亚铁0.001%
次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机
体初生级长与代繁谢殖与所次必级需代的物谢质的，关也系有：人把超出生理需求的过量初级
代谢产物也看作是次级代谢产物。
次1级、代存谢在产物范通围常及都产分物泌类到胞型外不，同有些与机体的分化有一定的关
系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。
诱变选育 • 能对生产菌种进行合理保藏
第一节 工业发酵生产菌种
一、工业发酵微生物及其代谢产物
（一）微生物代谢产物的类型
1、初级代谢产物 初级代谢主要是把营养物质转化为机体结构和生理活
性物质以及提供能量的代谢作用。 微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖
所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。 初级代谢产物：中间代谢物、前体物、高分子物质以
可以从自然界中先分离出相 应的菌种，再用物理或化学 的方法使菌种产生突变，从 突变个体中筛选出符合生产 要求的优良菌种。
怎样才能得到 优良的菌种呢？
•如果生产的是一般微生物不能 合成的产品
可用基因工程、细胞工程的方法 对菌种的遗传特性进行定向改造， 以构建工程细胞或工程菌，从而 达到生产相应产品的目的
（2）控制一定的培养条件 如pH值、温度、压力、以及
抗生素等。
（三） 纯种分离
纯种分离的原因？ 微生物太多；杂菌没有完全死亡；细
菌的孢子存活力极强等。 常见的纯种分离方法：
（1）划线分离法 （2）稀释分离法 （3）组织分离法
划线分离法
将少许经增殖的含菌培养物于盛有无菌 水的试管内稀释，在固体培养基表面做规 则的划线，密集的含菌样品经多次划线稀 释，最后得到由单细胞发育成的单菌落。
次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机
体初生级长与代繁谢殖与所次必级需代的物谢质的，关也系有：人把超出生理需求的过量初级
代谢产物也看作是次级代谢产物。
次1级、代存谢在产物范通围常及都产分物泌类到胞型外不，同有些与机体的分化有一定的关
系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。
诱变选育 • 能对生产菌种进行合理保藏
第一节 工业发酵生产菌种
一、工业发酵微生物及其代谢产物
（一）微生物代谢产物的类型
1、初级代谢产物 初级代谢主要是把营养物质转化为机体结构和生理活
性物质以及提供能量的代谢作用。 微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖
所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。 初级代谢产物：中间代谢物、前体物、高分子物质以
可以从自然界中先分离出相 应的菌种，再用物理或化学 的方法使菌种产生突变，从 突变个体中筛选出符合生产 要求的优良菌种。
怎样才能得到 优良的菌种呢？
•如果生产的是一般微生物不能 合成的产品
可用基因工程、细胞工程的方法 对菌种的遗传特性进行定向改造， 以构建工程细胞或工程菌，从而 达到生产相应产品的目的
（2）控制一定的培养条件 如pH值、温度、压力、以及
抗生素等。
（三） 纯种分离
纯种分离的原因？ 微生物太多；杂菌没有完全死亡；细
菌的孢子存活力极强等。 常见的纯种分离方法：
（1）划线分离法 （2）稀释分离法 （3）组织分离法
划线分离法
将少许经增殖的含菌培养物于盛有无菌 水的试管内稀释，在固体培养基表面做规 则的划线，密集的含菌样品经多次划线稀 释，最后得到由单细胞发育成的单菌落。
第2章微生物工业的菌种-jiang
化学结合 胰岛素
提高特定基因的表达水平
• (1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效 表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引 入强启动子；修改现有表达信号，提高基因 效力等。
• (2)诱导解除基因表达抑制的突变。
2、以基因工程为手段改变代谢途径， 改进生产工艺，提高发酵单位
D-葡萄糖
化学氧化
加氢还原
筛选模型 加选择性压力 富集培养、诱饵法 反应特性 随机分离
筛选模型
在抗生素的筛选过程中，为避免致 病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌 为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌 而又能代表致病菌的其它微生物作为试 验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛 选模型。
小麦赤霉病菌
Fusarium graminearum
突变株A
不合成阿克拉霉素，但合 成阿克拉霉素前体的类似 物和2-hydroxyaklacinoe
突变株B
不合成阿克拉霉素，也不合成阿 克拉霉素前体的类似物，但能在 2-hydroxyaklacinoe上接上糖苷
原生质体融合 融合子产生2－羟基阿克拉霉素
用原生质体技术提高发酵单位的例子
产物 性质
西索米星 种内 硫链丝菌肽 种内 碳青霉烯 种内 麦迪霉素 种内
的培养条件 4、良好的保藏方法
②阻断支路代谢，增加有效组份含量
阿维菌素B组分向A组分的转化是由aveD 基因编码 的C5-O-甲基化酶催化的。
CH3 OH
13
H3C
22
HO
23
25
O
CH3
R H CH3
OO
OH H
2
O
5
H
CH3
OH
AveD
CH3 OH
第二章工业微生物产生菌的分离筛选课件
三、 好氧微生物的分离 3、酶抑制剂产生菌的分离
芽孢杆菌的筛选：芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。 分离培养：将培养液倾入硅酸胶平板上，用富集培养物涂布接种于烘烤后的平板培养基上，于适温、厌氧条件下培养至长出足够大的 菌落。
四、厌氧微生物的分离 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌
一、 含微生物样品的采集
1、从土壤中采样 土壤是微生物的王国，从土壤中几乎可以分
离到任何所需的菌株。 细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）> 酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103）
1）根据土壤特点采样
▪比较复杂，应根据分离目的来进行灵活掌握
土壤有机质含量和通气状况
有机质含量丰富：耕作土、菜园土和近 郊土壤 ；森林土壤，枯枝落叶多的土壤
某些必要试验和毒性试验
分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
3、菌的稳定性
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度
5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性
6、容易从培养液中回收产物
3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条， 便有希望成为效益高的生产菌株
➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势 的情况下进行。
1、控制培养基的营养成分
环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该 物质的微生物也较多。在分离该类菌株之前，可在增 殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。 那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖， 其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。
芽孢杆菌的筛选：芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。 分离培养：将培养液倾入硅酸胶平板上，用富集培养物涂布接种于烘烤后的平板培养基上，于适温、厌氧条件下培养至长出足够大的 菌落。
四、厌氧微生物的分离 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌
一、 含微生物样品的采集
1、从土壤中采样 土壤是微生物的王国，从土壤中几乎可以分
离到任何所需的菌株。 细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）> 酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103）
1）根据土壤特点采样
▪比较复杂，应根据分离目的来进行灵活掌握
土壤有机质含量和通气状况
有机质含量丰富：耕作土、菜园土和近 郊土壤 ；森林土壤，枯枝落叶多的土壤
某些必要试验和毒性试验
分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料
3、菌的稳定性
4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度
5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性
6、容易从培养液中回收产物
3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条， 便有希望成为效益高的生产菌株
➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势 的情况下进行。
1、控制培养基的营养成分
环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该 物质的微生物也较多。在分离该类菌株之前，可在增 殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。 那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖， 其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。
发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育
微生物工程工业生产 水平的三个决定要素:
生产菌种的性能 生产设备 发酵和提取工艺条件
优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生 产的第一环节。
第二章 发酵工业菌种的选育
2.1 发酵工业常用菌种 2.2 发酵工业菌种的分离筛选 2.3 发酵工业菌种鉴定 2.4 发酵工业菌种改良 2.5 发酵工业菌种保藏
• 生长迅速，营养要求不高，易培养； • 安全性好； • 比哺乳动物细胞操作简单； • 具有一定的修饰蛋白的能力。
2.2发酵工业菌种的分离筛选
菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅 速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生 物的过程。
菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能 产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、 生活环境等，设计选择性高的分离方法。
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、 细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白 (SCP) 、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转 化蔗糖，制造酒心巧克力。
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
生产菌种的性能 生产设备 发酵和提取工艺条件
优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生 产的第一环节。
第二章 发酵工业菌种的选育
2.1 发酵工业常用菌种 2.2 发酵工业菌种的分离筛选 2.3 发酵工业菌种鉴定 2.4 发酵工业菌种改良 2.5 发酵工业菌种保藏
• 生长迅速，营养要求不高，易培养； • 安全性好； • 比哺乳动物细胞操作简单； • 具有一定的修饰蛋白的能力。
2.2发酵工业菌种的分离筛选
菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅 速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生 物的过程。
菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能 产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、 生活环境等，设计选择性高的分离方法。
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、 细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白 (SCP) 、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转 化蔗糖，制造酒心巧克力。
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
02 工业发酵菌种选育
二、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高
效地合成产物
菌种可以在要求不高，易于控制的培养条件下迅
速生长和发酵。
生产菌种要纯粹，不易感染其它微生物或噬菌
体，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质 量的稳定性。
生产菌及其产物的毒性必须考虑
三、 工业上常用菌种
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌、乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。
物理：紫外线，快中子，X射线，γ 射线，激光
诱变剂
{
化学：碱基类似物、与碱基反应的物质
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
确定出发菌株 ↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓ 制备单细胞（或单孢子）悬液 ↓←活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 ↓ 诱变处理 ↓ 平板分离 ↓计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 ↓ 突变体的初步筛选 ↓←用简单快捷的方法 重复筛选 ↓←摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复 诱变处理）
①斜面低温保藏法（低温） 斜面菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代（一般保存
期为3~6个月 ） ②石蜡油斜面低温保藏法（低氧、低温）
橡皮塞取代棉塞、加石蜡油4℃冰箱保藏（可保藏 1年）。 ③沙土管保藏法（低温、缺氧、缺养、干燥） 将菌种灭菌干燥的沙土中，抽真空干燥后封口， 4℃冰箱保藏（保藏2~10年）。
生产性能测定
目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
（二）诱变育种
• 以微生物的自然变异作为基础的生产选种 的机率很低，一个基因的自然突变频率仅 10-6～10-10左右。 • 以诱发突变为基础的育种，是国内外提高 菌种产量、性能的主要手段。
工业微生物菌种的筛选
a
7
根据微生物的生理特点
• 产纤维素酶 • 产蛋白酶 • 产淀粉酶,糖化酶 • 以碳氢化合物为底物的菌种等
a
8
采样方法
• 出去表层5CM左右的土层,取5~25CM的 土样10~15克(北方土壤干燥,可在1030CM处取样),装入事先准备好的容器内, 编号并记录地点﹑ 土壤质地 ﹑植被状况 ﹑取样时间及其它环境条件等.
• 平板菌落预选法:根据菌种及其代谢产物 的特性,在平板上设计许多巧妙的筛选方 法和活性粗测方法.
a
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平板菌落预选法
• 根据形态变异 • 根据产物特性 • 浓度梯度法
a定每一突变株,选出 生产能力高的菌株.
• 复筛:对同一菌株采用不同的条件实验,选 出生产能力强的菌株和相对应的实验条 件.
a
3
工业微生物菌种的筛选步骤
• 菌株的筛选通常分采样 ﹑富集﹑分离﹑ 筛选﹑产物鉴别等步骤.
a
4
出发菌株采样
• 向菌中保藏机构购买或索取 • 向其它机构购买或索取 • 从自然界采样
a
5
从自然界采样
• 从土壤中采样 • 根据微生物特点采样
a
6
从土壤中采样
• 土壤有机质状况 • 土壤酸碱度和植被状况 • 地理条件 • 季节变化
a
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工业微生物的诱变育种
• 微生物育种是建立在遗传和变异的基础 上的,一个菌种生物合成代谢产物的产量 和质量由遗传因素所决定.一个性能好的 菌种只有在合适的条件下才能表现出来. 因此诱变育种的包括诱变 筛选和优化环 境条件三个重要环节.
a
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人工诱变育种的目的
• 提高有效产物的产量. • 改善菌种特性 提高产品质量.例如:孢子
菌种筛选与开发的研究
菌种筛选与开发的研究第一章引言菌种筛选与开发是生物技术中最为重要的一个环节，是实现微生物应用的关键之一。
菌种筛选与开发是指从自然环境、工业发酵体系中选择出具有特定性状或功能的菌种并进行开发利用的一系列过程。
在现代生物技术领域中，菌种筛选与开发已经成为了一门重要的学科，广泛应用于药物、食品、环保、农业等各个领域。
菌种筛选与开发的研究不断深入，已经取得了许多重要的发现和成果。
本文结合前人研究成果，从菌种筛选、菌种功能开发两个方面进行综述。
第二章菌种筛选2.1 分类筛选法分类筛选法是指直接从自然或工业样品中直接筛选出优良菌株的方法。
这种方法可以通过形态学、遗传学、生理生化指标等指标来选出理想菌株。
常用的分类筛选法有形态学筛选法、抗生素敏感性筛选法、生理生化指标筛选法等。
2.2 分子识别筛选法分子识别筛选法是指根据分子特征，通过PCR、电泳、基因芯片、基因工程等技术选出具有目标特征的优质菌种。
这是一种基于基因分析的筛选方法，具有多样性、高效性和精准性的特点。
常用的分子识别筛选法有PCR法、RFLP法、基因芯片法等。
2.3 高通量筛选法高通量筛选法是指采用高通量技术进行菌种筛选的方法，可以快速高效地筛选出含有目标基因型、表型的微生物。
常用的高通量筛选法有生物芯片技术、基因测序技术、光学筛选技术等。
第三章菌种功能开发3.1 药物开发目前，菌种在药物开发中已经得到了广泛的应用。
从天然产物中分离出的新型药物，往往是由微生物代谢产生的，这些化合物具有良好的生物活性和生物可利用性。
因此，人们通过对微生物进行分离、筛选和鉴定，可以找到新型的生物活性物质。
菌种在药物开发中的研究还包括抗肿瘤、抗病毒、抗菌、降胆固醇等多个方面。
3.2 食品开发菌种在食品行业中被广泛应用，可以发掘出味道、营养、安全性更好的菌种，以生产更加美味、安全的食品。
另外，还可以通过利用菌种的代谢产物，如发酵豆制品、大豆酱油等，改善食品品质，提高营养价值。
2生产菌种的筛选
钝顶螺旋藻
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1）螺旋藻含丰富的蛋白质，高达60-70%； 2）螺旋藻含丰富的β胡箩卜素，为胡萝卜的15倍。 3）螺旋藻含丰富的维生素B1,B2,B5,B6,B11,B12,C,E。 4）螺旋藻含多种人体必需的微量元素，钙、镁、钠、 钾、磷、碘、硒、铁、铜、锌等。 5）螺旋藻中所含的叶绿素A,有其独特的造血净血功 能。而且其细胞壁很薄，由肽葡聚糖构成的，极易被 降解，消化吸收率达95%。 6）螺旋藻中含很高的γ亚麻酸，有促进钙吸收、提 高免疫力、防止代谢紊乱和防止衰老的功能。 7）螺旋藻中的多糖，有抗辐射的功能，并通过增强 机体免疫力，间接抑制癌细胞的增生。另外螺旋藻多 糖能提高血浆中的SOD的活性，减少脂质过氧化物的 生成，有抗衰老的作用。
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以氨基酸生产为例
氨基酸生产菌的要求：
代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种：
棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌：
常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌， 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。
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大肠杆菌 应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨 酸、缬氨酸
第一章
生产菌种的筛选
一、工业生产常用的微生物 二、工业化菌种的要求 三、菌种的分离与筛选
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一、工业生产常用的微生物
微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、 食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工 等方面。 在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、 霉菌和放线菌。 由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入， 藻类（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地变 为工业生产用的生物。 尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不 够的，已经初步研究的不超过自然界微生物总量 的10%左右。 微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于 大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近千 种，而工业上用的不过40－50种。因此微生物具 有巨大的潜力可挖掘。
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
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将 试 管 于 震 荡 机 上 ， 使 菌 液 混 合 均 匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液， 臵入准备好的无菌琼脂内。
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）
教具 多媒体
复习内容及形式
1、工业生产菌种筛选流程 2、工业菌种的育种技术 讲授内容及方法
时间分配 复习与提问： 5min 讲授：90min 总结：5min
思考题
1.自然界分离筛选菌种的步骤 2.发酵工业对菌种的要求
第二章 工业生产菌种筛选 程序及育种技术
第一节
工业生产菌种筛选流程
第二节
工业菌种的育种技术
处理菌悬液的制备
• 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、 活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的 培养，并要离心，洗涤，过滤。
诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍， 结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有 一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀 释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将 突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和 获得稳定菌株都是极为重要的。
3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须 非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，， 且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏 感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。
诱变剂的选择 1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使 用，回复突变率高，效果不大。 2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 “超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变 剂之一。 3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大 损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。 但它可能影响邻近基因的性能。
（二）诱变育种步骤 •出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备
•诱变处理
•中间培养
•分离和筛选
出发菌株的选择
1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。 2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。 3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。 4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。
5. 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细 胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部 分是隐性的，特别是高产基因。 6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱 变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会 使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂 是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的 作用于休止期，就可选用孢子。
菌种鉴定
生理生化鉴定
遗传学鉴定
（五）毒性试验 • 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒 的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与 食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家 规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲 霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试 验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以 上的毒性试验。
步骤九
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三 区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后 的营养平板，如右上图。
步骤十
在营养平板上贴好标签，标 示好接种日期、操作者姓名、菌 种学名以及培养基名称。
固体培养基的稀释涂抹接种法
需要使用的仪器——震荡机
吸取准备好欲稀释的菌液
吸取充分均匀后的菌液
取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液臵入，此时试管须做记号为第一次稀释。
（三）培养（纯种）分离 • 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于 微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯 化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还 应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
固体培养基四区划法接种法
步骤一
接种针先以火焰灭菌法灭菌
步骤二
轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却
自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导 致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿臵 于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍 数推算出菌液浓度。
•
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重 要和基础的步骤。 • 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭 示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。 • 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。 • 因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方 法是必要的。
分离和筛选 • 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到 初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 • 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。 因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与 某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的 大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。 在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的 菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶 段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。
步骤三
以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。
步骤四
更换一个新的无菌营养平板
步骤五
将接种针上的细菌划于一个新的营养平板 上。此为第一菌区 。
步骤六
重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法 灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二 区，如右上图。
步骤八
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的 第二区中划出第三区，如右上图。
第二节
工业菌种的育种技术
• 工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定 生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通 过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不 良性质或增加新的性状。
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的
• 一、自然选育
• 不经过人工处理，利用微生物自然突变而进行 的菌种选育过程。 ⒈ 从自然界分离获得菌株 • • • • ⑴ ⑵ ⑶ ⑷ 采样 增殖培养 纯种分离 生产性能的测定 划线法
稀释法
一般习惯上将自然选育 称为菌种的分离纯化。
• ⒉ 从自发突变体中获得菌株
• 自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。 • 微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境 中的营养物质，优先进行生长和繁殖，而生产菌 种（突变株）常常是打破了原有的代谢调节系统 的突变株，因此常常表现出生活力比野生菌株弱、 遗传特性不够稳定的特点。
第一节
工业生产菌种筛选流程
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； • 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 • 从一些发酵产品中分离出来所需菌种。
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 • 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。 • 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
教
课程：发酵技术 班级：生物09级 课题
案
任课教师：李懿 教研组长签字： 授课类型 讲授
第二章 工业生产菌种筛选程序及育种
教学目的
1.了解生物活性物质产生菌的筛选方法与过程， 2.掌握自然育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合技术育 种及基因重组技术育种的原理与方法。 1. 微生物代谢产物分哪两类？ 2.简述发酵工程的内容
可操作性要强
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关）
生产特性要符合工艺要求
经验 育种 菌种 选育
自然 选育 诱变 育种 杂交 育种
主要通过突 变和筛选来 育种
常规的杂交 育种
定向 育种
分子 育种
原生质体 融合
通过DNA重 组技术来育 种
诱变
物理、化学或生物诱变方法
（一）诱变剂和诱变处理 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线， 快中子； • 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫 外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一 般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 • 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力， 一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一 定危险性。
三、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。 • 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌 种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
（四）筛选
•
这一步是采用与生产相近的培养基和培养 条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验， 以求得适合于工业生产用菌种。